Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحديد الفهرس الدهن الانتعاش Fluorescence السائل في مسببات الأمراض الفطرية مايديس Ustilago

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/57279
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 1
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكول للحصول على فهرس الحبرية الدهن (فهرس LD) لدراسة ديناميات triacylglycerols في الخلايا المستزرعة في تجارب الفائق. تحليل مؤشر LD هو طريقة سهلة وموثوق بها أن يستخدم بوديبي 493/503. لا تحتاج هذا الإنزيم استخراج دهن ديسبينديوس أو التحليل المجهري.

Abstract

المقالة يوضح كيفية تنفيذ المقايسة مؤشر LD، الذي فحص ميكروسكوبية حساسة لتحديد تراكم triacylglycerols (العلامات) في قطيرات الدهن (LDs). يتم الحصول على مؤشر LD دون استخراج الدهن. أنها تسمح لقياس محتوى LDs في تجارب الفائق تحت ظروف مختلفة مثل النمو في الغنية أو النيتروجين استنفدت وسائل الإعلام. أن كانت الطريقة التي وصفت لأول مرة لدراسة الأيض الدهني الحبرية في Saccharomyces cerevisiae، أنه تم تطبيقها بنجاح على باسيديوميسيتي Ustilago مايديس. من المثير للاهتمام، ونظرا لقديسي الأيام الأخيرة هي العضيات فيلوجينيتيكالي المصانة في الخلايا حقيقية النواة، الطريقة التي يمكن تطبيقها على مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا، من الخميرة لخلايا الثدييات. فهرس LD يستند على مقايسة الانتعاش fluorescence السائل (الحراجة) من بوديبي 493/503 تحت شروط التبريد، بإضافة الخلايا الثابتة مع الفورمالدهيد. يتم استخدام اليود البوتاسيوم يحتوي الأسفار. النسبة بين الأسفار والمنحدرات الكثافة البصرية يسمى مؤشر دينار. يتم حساب المنحدرات من الخطوط المستقيمة التي تم الحصول عليها عند بوديبي الأسفار والكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) رسم مقابل إضافة نموذج. تنعكس جودة البيانات الأمثل بمعاملات الارتباط مساوية أو أعلى 0.9 (r ≥ 0.9). يمكن قراءة عينات متعددة في وقت واحد كما أنها يمكن أن تنفذ في ميكروسكوبية. ولما بوديبي 493/503 الفلورسنت محبتين صبغ تلك الأقسام إلى قطيرات الدهن، يمكن استخدامه في العديد من أنواع الخلايا التي تتراكم LDs.

Introduction

قطرات الدهن (LDs) في كل مكان هيئات الدهون داخل الخلايا تتكون من مجموعة أساسية الدهون محايدة، أساسا العلامات واسترات ستيرول (جنوب شرق). نواة محاطة باحادي الطبقة فوسفوليبيدات التي تتفاعل مع البروتينات مثل بيريليبين والأنزيمات المشاركة في تركيب الدهون محايدة، مثل diacylglycerol الأسيل-ترانسفيراز و carboxylase أسيتيل CoA اشيل synthase1. بسبب سلوكها الحيوي، أحادي الطبقة فسفوليبيد كما يحتوي على ليباسيس ترياسيلجليسيرول أن يتحلل العلامات و سراج الدين2. اعتماداً على نوع الخلية والكائن الحي، تخزين الدهون محايدة يمكن استخدامها لتوليد الطاقة، أو توليف فوسفوليبيدات وجزيئات إرسال الإشارات. في الخميرة والفطريات الأخرى، يتغير محتوى LDs في استجابة للتغيرات في نسبة الكربون/النيتروجين في ثقافة وسائل الإعلام، مشيراً إلى أن توافر النيتروجين انخفاض ربما تكون المفتاح لزيادة إنتاج المادة الدهنية محايدة3،4 ،5. وقد إنتاج كميات عالية من العلامات في الخميرة استخدام محتمل في مجال التكنولوجيا الأحيائية كمصدر للوقود الأحيائي وفي صناعة الأغذية. بعض الدهون المخزنة تحتوي على نسبة عالية من الأحماض الدهنية المشبعة، مثل أوميغا 3 وأوميغا 6، مع الأهمية التغذوية والغذائية 6،،من78،،من910 , 11-LDs لخلايا الثدييات، بما في ذلك الخلايا البشرية، تحتوي أيضا على العلامات واسترات الكوليسترول في الدم. أحادي الطبقة فسفوليبيد يتفاعل مع الثدييات مثلى من البروتينات الموصوفة في الخميرة LDs وبروتين إضافية، بيريليبين، وغائبة في سيريفيسيا س.12. اقترح أحد دور أحادي الطبقة فسفوليبيد والبروتينات المرتبطة به هو استقرار هيكل LDs والسماح بالتفاعل بين قديسي الأيام الأخيرة مع العضيات الميتوكوندريا، هيولى، بيروكسيسوميس، وفاكوليس، أساسا لتبادل المحتوى الدهني 13،14. من المثير للاهتمام، في البشر، وقديسي الأيام الأخيرة تظهر أن تشارك في أمراض مثل داء السكري من النوع 2، وتصلب الشرايين، steatohepatitis، وأمراض القلب التاجية، فيه هناك زيادة بعدد 15،16،17 . استخدام بعض أنواع الفيروسات LDs كمنابر لتجميع18، 2،فيريونس19.

بسبب الآثار المترتبة على دس في الأمراض البشرية واحتمال استخدام التكنولوجيا الحيوية، تصميم التجريبية الدقيقة لقديسي الأيام الأخيرة تشكيل مهمة هامة. توضح هذه المقالة مقايسة موثوق بها استناداً إلى انتعاش الأسفار (الحراجة) من بوديبي 493/503 (4، 4-ديفلورو-1، 3، 5، 7، 8--بينتاميثيل--4--بورا-3a, 4a-ديزا-s-إينداسيني)، للحصول قيمة نسبية لمحتوى الدهون محايدة في الخلايا. مع هذا التحليل، من الممكن تتبع ديناميات تراكم الدهون محايدة في الفطريات مثل مايديس U. S. cerevisiae، وأيضا في خلايا الثدييات، دون الحاجة ل استخراج الدهن 20. الأسلوب الذي طبق لأول مرة في S. cerevisiae لتحديد فوسفاتاسيس البروتين ومؤنزم تشارك في تنظيم استقلاب الدهون. وكان هذا ممكناً بدون استخراج الدهن أو البروتين تنقية21،22. كما تم استخدام إعادة إنشاء ديناميات تشكيل LDs في الضامة البريتوني23. الاستخدام من بوديبي 493/503 بعض مزايا أكثر من الأصباغ الدهنية محايدة أخرى "النيل الأحمر". بوديبي 493/503 محددة للغاية للدهون محايدة وله طيف الانبعاث ضيقة، تيسير الكشف المتزامن إشارات من الأصباغ مثل البروتين الفلورسنت الأحمر أو ميتو-المقتفي، عندما يتم تحليل العينات بالفحص المجهري [كنفوكل]. ولسوء الحظ، بوديبي 493/503 الحساسة إلى فوتوبليتشينج، ولكن يمكن تجنب هذه العملية باستخدام كاشف أنتيكوينتشينج أثناء التعرض ل الضوء24.

للقيام بفحص الحراجة في خلايا الخميرة، هم مثقف تحت ظروف التغذية المطلوبة، ويتم سحب مختبرين في أوقات مختلفة. وبعد ذلك، الخلايا ثابتة مع فورمالدهايد، مما يحافظ على سلامة LDs لأشهر عندما يتم تخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية. تقنيات التثبيت الأخرى ينبغي تجنبها، خاصة تلك التي تستخدم الميثانول أو الأسيتون البارد، نظراً لأنها تؤدي إلى تدهور LDs داخل الخلايا24. لقياس مؤشر LD، يتم تعليق الخلايا فورمالدهايد--الثابتة في الماء للحصول على تركيز محدد. ثم، يتم إضافتها إلى محلول يحتوي على فلوروفوري بوديبي 493/503 مروي بأن كي، وعندما يدخل الخلية فلوروفوري وتأييداً قديسي الأيام الأخيرة، هناك انتعاش في الأسفار. الملازمة لقياس الفلورية (485 نانومتر nm/510)، تركيز الخلايا هو كمياً عن طريق قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر. تتم قراءة كل عينة أربع مرات بإضافة اللاحقة مختبرين ميليلتر 5 من تعليق خلية فورمالدهايد--ثابت لنفسه جيدا. يتم الحصول على فراغات للأسفار وامتصاص قبل إضافة الخلايا. نوعية الأسفار وامتصاص البيانات يتم تقييمها بواسطة تحديد الخطي القياسات: إذا صاد < 0.9, يتم تجاهل البيانات. قيمة r مهم لأنه أساسا كثافة الأسفار ينبغي أن ينتج رد خطي على التركيزات المتزايدة في الخلية. إذا كان تركيز خلية مرتفع جداً، يتم فقدان الخطي. والرزن الحراجة يوفر طريقة سريعة وبسيطة واقتصادية لتحديد النمط الظاهري LD المرجوة في تجارب الفائق. بعد تحديد الشروط المطلوبة، يمكن أن تدرس محتوى خلايا فردية LD [كنفوكل] مجهرية، باستخدام نفس الخلايا الثابتة فورمالدهايد ملطخة بوديبي، تقديم صورة لقديسي الأيام الأخيرة في الخلية. هذه العلامات ومحتوى سراج الدين يمكن الآن مواصلة تحليلها بطبقة رقيقة اللوني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد المخازن المؤقتة والحلول

  1. لتحضير 1 لتر فوسفات مخزنة المالحة (PBS، الأس الهيدروجيني 7)، حل ز 8 من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم بوكل، ز 1.44 غ2هبو4، ز 0.24 خ2ص4 في 800 مل من الماء ديستيلاتيد. ضبط درجة الحموضة 7.0 مع HCl، ثم قم بإضافة الماء لوحدة تخزين نهائي لبرنامج تلفزيوني ل. 1 يمكن إجراؤها 10 × الحل الأسهم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. لإعداد 10 مل من تحديد الحل، إضافة 1 مل من 37% فورمالدهيد لمل 9 من برنامج تلفزيوني للوصول إلى تركيز نهائي من 3.7 في المائة. إعداد هذا الحل فقط قبل الاستخدام.
    تحذير: استخدام قفازات للتعامل مع الحل فورمالدهايد.
  3. لإعداد حل تبريد (500 ملم)، حل ز 8.3 لكي في 100 مل ماء المقطر. إعداد هذا الحل قبل استخدامها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. لإعداد بوديبي 10 مم حل الأسهم، حل 10 مغ من بوديبي 493/503 في 3.8 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). تبقى 100 ميليلتر مختبرين في الظلام في-70 درجة مئوية.
  5. إعداد 5 بوديبي تبريد مكم الحل، إضافة 1 ميليلتر من 10 مم بوديبي 493/503 إلى 2 مل من 500 ملم تبريد الحل. للمقايسة الحراجة، مطلوب تركيز نهائي من 5 ميكرومتر من بوديبي.
  6. إضافة إلى إعداد الحل المعدنية، 0.06 ز ح3بو3، 0.14 ز للحركة2-4 ح2س، ز 0.4 زنكل2، ز 0.04 غ2مو4-2 ح2س، ز 0.1 فيكل3-6 ح2س وز 0.4 من CuSO 4-5 ح2س 1 لتر ماء المقطر.
  7. إعداد الحل الملح، أضف 16 ز خ2ص4، ز 4 غ2حتى4وز 8 من بوكل، ز 2 MgSO4، ز 1 كاكل2و 8 مل من محلول المعدنية إلى 1 لتر من الماء المقطر.
  8. إعداد متوسط الحد الأدنى دون مصدر نيتروجين لشين مايديس FB2 (a2b2)، بإضافة 10 جرام من السكر و 62.5 مل من محلول الملح إلى 1 لتر ماء المقطر، وفقا هوليداي, et al. 31-تعديل درجة الحموضة 7.0 ثم الاستغناء عن 100 مل من وسائط الإعلام في قوارير 250 مل وتعقيم لهم. اﻷوتوكﻻف لمدة 20 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة (1.05 كغ/سم2) في دورة السائل أو تصفية تعقيم.
  9. لتحضير الخميرة ببتون سكر العنب المتوسطة (YPD)، إضافة استخراج 5 غ خميرة، 2.5 g ببتون، و 5 غ السكر إلى 1 لتر من الماء المقطر. الاستغناء عن 100 مل الحل في قوارير 250 مل وتعقيم لهم. اﻷوتوكﻻف لمدة 20 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة (1.05 كغ/سم2) في دورة السائل أو تصفية تعقيم.

2-الثقافة شرط وتثبيت الخلية

ملاحظة: الحفاظ على هيكل دس بتحديد الخلايا في أقرب وقت ممكن. يمكن أن يتم تثبيت البرنامج في أنابيب ميكروسينتريفوجي. يمكن الاحتفاظ الخلايا ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد إذا كان الجفاف هو تجنب ترك طبقة رقيقة من المياه.

  1. تنمو خلايا U. مايديس تحت ظروف الثقافة ذات الصلة للدراسة. تبدأ الثقافة OD أولى600 0.05 (1.15 × 106 خلايا/مل). احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية، 180 لفة في الدقيقة ح 24. يناظر التطوير التنظيمي600 1 2.3 × 107 خلايا/مل.
  2. في المحدد مرات، سحب قاسمة للخلايا. مايديس شين، سحب 5 مل كل ح 2 خلال ح 8 الأولى. بعد 8 ساعات نمو، مختبرين 2 مل بما فيه الكفاية.
  3. قياس الكثافة البصرية 600 نيوتن متر لكل قاسمة.
  4. الطرد المركزي بتعليق خلية في 14,000 س ز لمدة 1 دقيقة على 4 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد مركزي منضدية. تجاهل المادة طافية.
  5. تعليق بيليه الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني-فورمالدهايد 3.7% المخزن المؤقت. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. وبعد التفريخ، الطرد المركزي بتعليق خلية في 14,000 س ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  7. أغسل بيليه الخلايا مرتين مع كمية مماثلة من الماء المقطر (1 مل). الطرد المركزي من تعليق خلية في 14,000 س ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بعد كل خطوة الغسيل.
  8. ضبط بيليه الخلية إلى OD 5600 (1.15 x 108 خلية/مل) مع الماء (المعادلة 1) المقطر.
    Equation 1    المعادلة 1.
  9. الاحتفاظ العينة عند 4 درجة مئوية حتى استعماله.

3. السائل Fluorescence الانتعاش المقايسة (الحراجة)

  1. قم بتشغيل جهاز المطياف الضوئي وفتح البرنامج سكانلت. انقر فوق جديد الدورة، واختر بدء ثم لوكس فاريوسكان. حدد البروتوكول من شجرة الدورة وإدخال الإعدادات الخاصة أطوال موجية الفلورية (الإثارة 485 نانومتر/الانبعاثات 510 نانومتر؛ الكثافة البصرية 600 nm) واختر مكسب ضوئي التلقائي. الإثارة عرض النطاق الترددي، حدد 12 نانومتر. في البصريات، حدد أعلى (الإثارة عينة من أعلى البئر).
  2. أدخل الانفعالات لطيف ومستمر (300 لفة في الدقيقة). حدد تشغيل لوحة بها، و إيقاف مؤقت حتى إجراء المستخدم (الوقت المستخدم لإضافة العينة إلى الآبار). كرر البروتوكول خمس مرات. انقر فوق حفظ واكتب اسماً للدورة في حقل اسم الدورة. البروتوكول جاهز الآن لتحليل العينات.
  3. إضافة مروي ميليلتر 200 ميكرومتر 5 بوديبي--حل لكل بئر من صفيحة 96 الأسود واضحة تماما أسفل.
  4. ضع اللوحة داخل قاعة جهاز المطياف الضوئي واحتضان 5 دقيقة في 30 درجة مئوية. من هذه النقطة، حماية اللوحة من الضوء قدر الإمكان.
  5. انقر فوق الزر ابدأ وقراءة الأسفار (الإثارة 485/الانبعاثات 510) و التطوير التنظيمي600 المقابلة للفراغات.
  6. إضافة 5 ميليلتر من تعليق خلية فورمالدهايد--الثابتة إلى الآبار أثناء وقت الإيقاف المؤقت. مزيج العينات بعناية مع الماصة. وضع اللوحة داخل جهاز المطياف الضوئي وانقر فوق متابعة. ثم ستتم معالجة العينات وفقا للبروتوكول صممت أعلاه.
  7. كرر ثلاث إضافات متتالية من 5 ميليلتر من تعليق خلية. تأكد من أن لا تتسبب في الخلايا. (الشكل 1).

4-العمليات الحسابية للمؤشر LD

  1. لكل عينة في الميكروسكوبية، ارسم رسم بياني للأسفار وامتصاص ضد وحدة التخزين لكل إضافة متتالية (بما في ذلك الفراغ 5 نقاط). في هذه الدراسة باستخدام برنامج Microsoft Excel للعمليات الحسابية. لرسم البيانات، قم بإدخال حجم والأسفار، وامتصاص البيانات في الأولى والثانية والثالثة من العمود في ورقة البيانات، على التوالي. ثم، حدد البيانات كاملة مع المؤشر، انقر فوق إدراج، وحدد المبعثر (س ص).
  2. قم بتحديد النقاط لكل خط في الرسم البياني، وإدراج كل منها خط الاتجاه مع تحديد خانة إظهار المعادلة . كتابة قيم منحدرات خطوط مستقيمة اثنين، وفقا للمعادلة 2:
    Equation 2    المعادلة 2
    حيث y = الأسفار أو الكثافة البصرية، س = حجم العينة (0، 5، 10، 15، 20 ميليلتر)، m = المنحدر من الأسفار أو خط الكثافة البصرية، وب = التقاطع y.
  3. تقسيم منحدر خط الأسفار بالميل لخط الكثافة الضوئية للحصول على فهرس LD، معادلة 3.
    Equation 3    المعادلة 3
    فهرس LD يناظر حاصل قسمة الأسفار ومنحدرات الكثافة البصرية.

5-بيانات نوعية التحليل

  1. حساب معامل الارتباط لكل خط مستقيم: انقر فوق معالج الدالة (fx)، واختر CORREL. إذا كان r < 0.9، تجاهل البيانات وتكرار القراءات. إذا كان r ≥ 0.9، قراءات موثوق بها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الحراجة، مع بوديبي 493/503 كالمسبار الفلورسنت طريقة موثوقة وسهلة لدراسة تراكم حيوي لقديسي الأيام الأخيرة في الولايات المتحدة مايديس، بغض النظر عن ظروف النمو. عندما كانت استزراع الخلايا في YPD والمتوسطة، كان هناك زيادة في مؤشر LD أثناء مرحلة الأسى، أعقبه انخفاض في المرحلة ثابتة (الشكل 2A). وفي المقابل، في الخلايا التي نمت تحت المجاعة النيتروجين، كان هناك زيادة مطردة في فهرس LD في أسي وثابتة مرحلتي (الشكل 2). لأن كل الثقافات بدأت بنفس الكثافة البصرية (عدد مماثل من الخلايا)، وتبين النتائج قدرة عالية للمقايسة الحراجة للكشف عن تغيرات صغيرة في المحتوى الدهني (الشكل 2). حساسية الطريقة التي كان أكدها مجهرية [كنفوكل]: YPD-خلايا تحتوي على العديد من دس الصغيرة في جميع أنحاء الخلية كلها، بينما ظل المجاعة النيتروجين كان هناك إنتاج هامة من كبير LDs، عادة 4-5 دس كل الخلايا، (الشكل 2، الحق الألواح A و B، على التوالي). الفهرس LD ليست قيمة مطلقة للمحتوى الدهني محايدة، ينبغي بناء منحنى قياسية المتعلقة بالفهرس LD مع كمية ترياسيلجليسيرولس. تم استخدام هذا النهج لدراسة ديناميات توليف العلامات في S. cerevisiae20. استناداً إلى كل من المنحنى المعياري، يمكن أن يكون التحليل إعادة استخدامها بعوض معدل تراكم الدهون في الخلايا.

يمكن أن يتبع في فهرس LD حضور صرافين A، مثبط محددة من carboxylase البيروفات، إنزيم ضروري تخليق الأحماض الدهنية الواردة في العلامات المخزنة في دس25. المانع أضيفت إلى المتوسطة الثقافة بعد ح 2 من النمو في الغياب مصدر النيتروجين، شرط فيها خلايا أظهرت ارتفاع معدل تراكم الدهون (الشكل 2). وفقا للتقارير السابقة في S. cerevisiae، أدت إلى إضافة صرافين-أ في تثبيط كامل LD تراكم (الشكل 2B، أزرق فاتح) 20،21.

مواصلة التحقيق تعبئة LDs في مايديس شين، نقل الخلايا التي نمت تحت المجاعة النيتروجين عن ح 72 إلى YPD والمتوسط (الشكل 3). وانخفض مؤشر LD عقب دالة آسيه. بعد 24 ساعة، بلغ مؤشر LD قيم مماثلة للتي لوحظت في الخلايا المستزرعة في YPD والمتوسطة دون ضغط غياب النيتروجين (الشكل 2A). ولما كانت الخلايا قادرة على تعبئة LDs المتراكمة أثناء المجاعة النيتروجين، تقترح النتيجة خفض محتوى العلامات. وأبلغ استجابة مماثلة ل S. cerevisiae أثناء دراسة phosphatases تشارك في تنظيم الأيض الدهني21.

Figure 1
رقم 1: التمثيل التخطيطي للخطوات التي تنطوي عليها الحراجة. خطوات شروط الثقافة هي الممثل للخميرة مايديس U. لكن يمكن تكييفها للكائنات الدقيقة أو نوع من الخلايا الأخرى. نموذج الإبلاغ الموحد، وحدات الأسفار الانتعاش؛ دينار بحريني، بيديستيليد المياه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: القوى المحركة لتراكم قطرات الدهن في مايديس U.. خلايا الخميرة كانت نمت عن 24 ساعة في المتوسط YPD وحصادها وعلقت في المتوسط YPD (A) جديدة (اللوحة اليسرى العلوية) أو متوسطة (ب) الحد الأدنى دون مصدر نيتروجين (السفلي اليسرى الظلام-الفريق الأزرق). تحت النيتروجين المجاعة، كان كبح الزيادة في مؤشر LD بإضافة صرافين نانومتر 192 ألف في وسائط الثقافة بعد ح 2 للنمو (ب، أزرق فاتح). n = 3، البيانات هي ± يعني sem. اللوحة اليسرى: حصاد مجهرية [كنفوكل] لقديسي الأيام الأخيرة في الخلية 24 h. (أ) أعلى لوحة: YPD--الخلايا. (ب) أسفل لوحة: الخلايا دون مصدر نيتروجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تعبئة LDs. خلايا الخميرة زادت عن 24 ساعة في المتوسط YPD، وتحصد وتزرع في YPD جديدة ح 24 (تحكم) أو في الحد الأدنى المتوسط دون مصدر نيتروجين عن ح 72، ثم المحولة إلى متوسط جديدة-YPD والمحتضنة لمختبرين h. 24 إضافية تم سحب في رد مرات لكل الثقافات لقياس تعبئة LDs بالحراجة. بيانات كانت مزودة بمعادلة تحلل أسي (y = A·e-كيلوطن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحراجة هو أسلوب رواية التي تم تطبيقها للمرة الأولى لدراسة الأيض الدهني في S. cerevisiae والإصدارات الأحدث بنجاح تنفيذها في الولايات المتحدة مايديس20،21. على الرغم من أن الفهرس LD لا يعطي قيمة مطلقة للعلامات المتراكمة في الخلايا، فإنه يقدم فكرة سريعة عن محتوى الخلايا الدهنية، وتفسير البيانات واضحة عند مقارنة مؤشر LD من اثنين أو أكثر من الظروف التجريبية. بوديبي 493/503 محددة للغاية للدهون محايدة، المكون الرئيسي لقديسي الأيام الأخيرة، وأنها طيف الانبعاث ضيقة تيسير الكشف المتزامن من إشارات أخرى قادمة من الأصباغ مثل تعقب ميتو أو الكمبودي الأزرق عندما يتم دراسة الخلايا [كنفوكل] 26من الفحص المجهري. مثل العديد من الجزيئات الفلورسنت، بوديبي 493/503 حساس فوتوبليتشينج أثناء تجارب الفحص المجهري الأسفار، ولكن يمكن تقليل هذه العملية عن طريق إضافة مكافحة الكواشف فوتوبليتشينج خلال التعرض ل الضوء27. وباختصار، يمكن استخدام بوديبي 493/503 في طائفة واسعة من الخلايا لدراسة تراكم وتعبئة الدهون محايدة21،22،23،،من2829.

لتحديد أسلوب العمل بشكل صحيح، يجب مراعاة بعض النقاط. مورفولوجيا الخلايا منذ OD600 يستخدم لحساب مؤشر LD، لا يجب إدخال تغييرات جذرية خلال التجربة. الحفاظ على المكونات داخل الخلايا أثناء تثبيت الخلايا أيضا خطوة بالغة الأهمية، وينبغي أن تشمل هذه المحافظة قديسي الأيام الأخيرة، التي هي الهدف الرئيسي لهذا البروتوكول. تحديد الخلايا مع مجمع لمناسبة مهم جداً لتطبيق هذا الأسلوب على أنواع عديدة من الخلايا دون أي مشكلة. وهنا استخدمنا فورمالدهايد لإصلاح هياكل الخلايا؛ ألدهيد يتفاعل مع المجموعات الأمينية للبروتينات. وأفيد أن الألدهيدات الأخرى أيضا الحفاظ على هياكل مجموعة واسعة النطاق من الخلايا، ويبدو أنه لا توجد تغييرات هامة في هيكل البروتين24،26. عيب فورمالدهايد هو أن فإنه يدفع الضرر الغشاء الصغيرة وتشكيل المنقبضة قرب في الميتوكوندريا والأغشية النووية، ولكن هذه الآثار السلبية شائعة في جميع أساليب التثبيت ألدهيد26. وينبغي تجنب المذيبات العضوية مثل الميثانول أو الأسيتون نظراً لأنها تتحلل LDs في الخلايا. التثبيت مع المذيبات العضوية يستند إلى الجفاف وهطول الأمطار من البروتينات، والتي يمكن اعتبارها أثرا سلبيا. وبالإضافة إلى ذلك، يرتبط استخدام المذيبات العضوية تلطيخ غير محددة.

كأي تقنية أخرى، قد الإنزيم مؤشر LD القيود عند تنفيذها لأنظمة أخرى. مشاكل في نشر بوديبي عبر جدار الخلية الفطرية، اعتماد الأسفار على تكوين الأحماض الدهنية، ونوع الدهون ومحتوى البروتين داخل الهيئات داخل الخلايا الدهنية30، يحول دون مقارنة كمية العلامات بين الأنواع المختلفة أو حتى مع نفس الخلايا نمت تحت ظروف غذائية مختلفة. أيضا، يتم التغييرات الشكلية الكبيرة مثل الانتقال إلى الميسليوم أو معقمات للخلايا بعض من المشاكل التي يمكن العثور عليها.

LD مؤشر المقايسة هو أسلوب الفائق الذي يتطلب أوقات قصيرة وكميات صغيرة من الكتلة الأحيائية وكواشف مختبر. المقايسة موثوقة، والبيانات التي تم الحصول عليها بدقة واستنساخه. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر مبادئ توجيهية للبحوث المتعلقة بديناميات الأيض الدهني في الطب، وأنها قد تصبح أداة في مجال التكنولوجيا الأحيائية للفرز الفائق للكائن الحي الزيتية لإنتاج الوقود الأحيائي أو تغذية الزيوت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف

Acknowledgments

أيد هذا العمل منح معهد بحوث النظم الوطنية-أمانة y بوسجرادو (معهد البوليتكنيك الوطني-المسبار-20170864)، برنامج دعم أ ه المشاريع لبحوث التكنولوجيا Innovación (بابيت IN222117)-(جامعة المكسيك الوطنية المستقلة جامعة المكسيك الوطنية المستقلة)، و y Consejo ناسيونال دي العلوم التكنولوجيا (254904-جب مبرزين و 256520-GGS). Fundação de Amparo البحوث ريو دي جانيرو (فابري-سينتيستاس هل Estado نوسو: 26/103.353/2011 ه). ونحن بفضل QFB. أوسكار إيفان Luqueño بوكاردو على العرض التخطيطي. ونحن نشكر الدكتور ميغيل رودريغيز تابيا لمساعدة قيمة في الفحص المجهري [كنفوكل] لقديسي الأيام الأخيرة. ونود أن نشكر الدكتور برونو مورايس بوزاكال لعمله الرائد في تطوير هذه التقنية في S. cerevisiae التي نحن تكييفها الولايات المتحدة مايديس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).

Tags

الكيمياء الحيوية، والمسألة 134، فهرس المحتوى الدهني، قطرات الدهن، باسيديوميسيتي، استرداد الأسفار، بوديبي 493/503، مايديس Ustilago
تحديد الفهرس الدهن الانتعاش Fluorescence السائل في مسببات الأمراض الفطرية <em>مايديس Ustilago</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli,… More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter