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Biochemistry

कवक रोगज़नक़ में तरल प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा लिपिड सूचकांक निर्धारण Ustilago मेडिस

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन लिपिड छोटी बूंद सूचकांक (LD सूचकांक) को प्राप्त करने के लिए उच्च प्रवाह प्रयोगों में प्रसंस्कृत कोशिकाओं में triacylglycerols की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए । LD सूचकांक परख एक आसान और विश्वसनीय तरीका है कि BODIPY 493/503 का उपयोग करता है । इस परख dispendious लिपिड निष्कर्षण या माइक्रोस्कोपी विश्लेषण की जरूरत नहीं है ।

Abstract

लेख दिखाता है कि कैसे LD सूचकांक परख है, जो एक संवेदनशील microplate परख के लिए triacylglycerols के संचय (टैग) लिपिड बूंदों (LDs) में निर्धारित है को लागू करने के लिए । LD सूचकांक लिपिड निष्कर्षण के बिना प्राप्त की है । यह विभिंन स्थितियों के तहत उच्च प्रवाह प्रयोगों में LDs सामग्री जैसे अमीर या नाइट्रोजन घट मीडिया में वृद्धि के रूप में मापने की अनुमति देता है । हालांकि विधि पहली बार के लिए Saccharomyces cerevisiae में लिपिड छोटी बूंद चयापचय का अध्ययन करने के लिए वर्णित किया गया था, यह सफलतापूर्वक basidiomycete Ustilago मेडिसकरने के लिए लागू किया गया था । दिलचस्प है, और क्योंकि LDs organelles phylogenetically eukaryotic कोशिकाओं में संरक्षित कर रहे हैं, विधि कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता के लिए लागू किया जा सकता है, खमीर से स्तनधारी कोशिकाओं के लिए । LD सूचकांक BODIPY 493/503 के तरल प्रतिदीप्ति रिकवरी परख (LFR) शमन शर्तों के तहत, formaldehyde के साथ तय की कोशिकाओं के अलावा द्वारा पर आधारित है. पोटेशियम आयोडीन एक प्रतिदीप्ति शमन के रूप में प्रयोग किया जाता है । प्रतिदीप्ति और ऑप्टिकल घनत्व ढलानों के बीच अनुपात LD सूचकांक नाम है । ढलानों जब BODIPY प्रतिदीप्ति और 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व नमूना अतिरिक्त के खिलाफ साजिश रची जाती है प्राप्त सीधे लाइनों से गणना कर रहे हैं । इष्टतम डेटा गुणवत्ता सहसंबंध गुणांक के बराबर या ऊपर 0.9 (r ≥ 0.9) द्वारा प्रतिबिंबित है । कई नमूने एक साथ पढ़ा जा सकता है के रूप में यह एक microplate में लागू किया जा सकता है । चूंकि BODIPY 493/503 एक lipophilic फ्लोरोसेंट डाई कि लिपिड बूंदों में विभाजन है, यह कोशिकाओं है कि LDs जमा के कई प्रकार में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

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लिपिड बूंदों (LDs) सर्वव्यापी intracellular वसा शरीर तटस्थ लिपिड के एक कोर से बना रहे हैं, मुख्य रूप से टैग और स्टेरोल एस्टर (एसई) । कोर फॉस्फोलिपिड के एक monolayer से घिरा हुआ है जो perilipin और तटस्थ लिपिड के संश्लेषण में शामिल एंजाइमों जैसे प्रोटीन के साथ इंटरैक्ट करता है, जैसे कि diacylglycerol acyl-ट्रांस्फ़्रेज़, एसिटाइल-CoA carboxylase और acyl-CoA सिंथेस1। अपने गतिशील व्यवहार के कारण, फॉस्फोलिपिड monolayer भी triacylglycerol lipases शामिल है कि hydrolyze टैग और एसई2। कोशिका के प्रकार और जीव पर निर्भर करता है, तटस्थ लिपिड संग्रहीत करने के लिए ऊर्जा उत्पंन किया जा सकता है, या संश्लेषित फॉस्फोलिपिड और संकेत अणुओं । खमीर और अंय कवक में, संस्कृति मीडिया में नाइट्रोजन/कार्बन अनुपात में बदलाव के जवाब में LDs परिवर्तन की सामग्री, यह दर्शाता है कि कम नाइट्रोजन उपलब्धता को तटस्थ लिपिड उत्पादन में वृद्धि की कुंजी हो सकती है3,4 ,5. खमीर में टैग की उच्च मात्रा का उत्पादन जैव ईंधन के स्रोत के रूप में और खाद्य उद्योग में बायोटेक्नोलॉजी में एक संभावित उपयोग किया है । कुछ संग्रहीत लिपिड पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड के उच्च अनुपात होते हैं, ओमेगा 3 और ओमेगा 6 की तरह, पोषण और आहार महत्व के साथ 6,7,8,9,10 , 11. स्तनधारी कोशिकाओं के LDs, मानव कोशिकाओं सहित, भी टैग और कोलेस्ट्रॉल एस्टर होते हैं । फॉस्फोलिपिड monolayer खमीर LDs में वर्णित प्रोटीन के स्तनधारी मुताबिक़ के साथ बातचीत, और एक अतिरिक्त प्रोटीन, perilipin, जो एस cerevisiae12में अनुपस्थित है के साथ । एक फॉस्फोलिपिड monolayer और उसके जुड़े प्रोटीन के लिए प्रस्तावित भूमिका के लिए lds संरचना को स्थिर और mitochondria, endoplasmic जालिका, peroxisomes, और रिक्तिकाएं के रूप में organelles के साथ lds की बातचीत की अनुमति है, लिपिड एक्सचेंज के लिए मुख्य रूप से 13,14. दिलचस्प है, मनुष्यों में, LDs प्रकार की तरह विकृतियों में शामिल होने के लिए प्रकट 2 मधुमेह, atherosclerosis, steatohepatitis, और कोरोनरी हृदय रोग, जिसमें उनकी संख्या में वृद्धि 15है,16,17 . वायरस के कुछ प्रकार के प्लेटफार्मों के रूप में LDs का उपयोग करें virions 2,18,19इकट्ठा ।

मानव विकृतियों और उनके संभावित तकनीकी उपयोग में lds के निहितार्थ के कारण, lds गठन के सटीक प्रयोगात्मक निर्धारण एक महत्वपूर्ण काम है । इस लेख का वर्णन एक विश्वसनीय प्रतिदीप्ति की वसूली पर आधारित परख (LFR) के BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-बोरा-ए, 4a-diaza-एस-indacene), कोशिकाओं में तटस्थ लिपिड की सामग्री का एक रिश्तेदार मूल्य प्राप्त करने के लिए । इस परख के साथ, यह संभव है कि यू मेडिस और एस cerevisiaeजैसे कवक में तटस्थ लिपिड के संचय की गतिशीलता का पालन करें, और भी स्तनधारी कोशिकाओं में, लिपिड निष्कर्षण 20की आवश्यकता के बिना विधि cerevisiae में पहली बार के लिए लागू किया गया था प्रोटीन phosphatases और kinases लिपिड चयापचय के विनियमन में शामिल की पहचान करने के लिए । यह लिपिड निष्कर्षण या प्रोटीन शुद्धि21,22के बिना संभव था । LFR भी पेरिटोनियल मैक्रोफेज23में LDs गठन की गतिशीलता स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । BODIPY 493/503 का उपयोग नील लाल के रूप में अंय तटस्थ लिपिड रंजक से अधिक कुछ लाभ है । BODIPY 493/503 तटस्थ लिपिड के लिए अत्यधिक विशिष्ट है और एक संकीर्ण उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन या मिळो-tracker की तरह रंजक से संकेतों का एक साथ पता लगाने की सुविधा, जब नमूनों फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, BODIPY 493/503 photobleaching के प्रति संवेदनशील है, लेकिन इस प्रक्रिया को प्रकाश24के लिए जोखिम के दौरान एक antiquenching एजेंट का उपयोग करके बचा जा सकता है ।

बाहर खमीर कोशिकाओं में LFR परख ले, वे वांछित पोषण की स्थिति के तहत संस्कृति रहे हैं, और aliquots अलग समय पर वापस ले रहे हैं । अगले, कोशिकाओं formaldehyde, जो महीनों के लिए LDs की अखंडता को बरकरार रखता है जब कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित कर रहे है के साथ तय कर रहे हैं । अंय निर्धारण तकनीक से बचना चाहिए, विशेष रूप से उन मेथनॉल या ठंड एसीटोन का उपयोग कर, क्योंकि वे24कोशिकाओं के भीतर LDs के क्षरण के लिए सीसा । LD सूचकांक को मापने के लिए, formaldehyde-फिक्स्ड कोशिकाओं को एक परिभाषित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पानी में निलंबित कर रहे हैं । फिर, वे एक fluorophore BODIPY 493/503 के द्वारा बुझती है युक्त समाधान के लिए जोड़ रहे हैं, और जब fluorophore सेल और LDs के साथ सहयोगियों में प्रवेश करती है, वहां अपनी प्रतिदीप्ति की वसूली है । प्रतिदीप्ति माप (485 एनएम/510 एनएम), कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए सहवर्ती 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा quantified है । प्रत्येक नमूना एक formaldehyde-फिक्स्ड सेल निलंबन के बाद 5 µ एल aliquots जोड़कर चार बार एक ही अच्छी तरह से पढ़ा है । कोशिकाओं के जोड़ से पहले प्रतिदीप्ति और अवशोषित के रिक्त स्थान प्राप्त कर रहे हैं । प्रतिदीप्ति की गुणवत्ता और अवशोषक डेटा माप की रैखिकता का निर्धारण करके मूल्यांकन कर रहे हैं: यदि r < 0.9, डेटा छोड़ दिया जाता है । r मान महत्वपूर्ण है क्योंकि मूल रूप से प्रतिदीप्ति की तीव्रता सेल सांद्रता बढ़ाने के लिए एक रैखिक प्रतिक्रिया का उत्पादन करना चाहिए । यदि कक्ष एकाग्रता बहुत अधिक है, रैखिकता खो जाती है । LFR परख उच्च प्रवाह प्रयोगों में वांछित LD phenotype का चयन करने के लिए एक तेज, सरल और आर्थिक विधि प्रदान करता है । वांछित शर्तों का चयन करने के बाद, व्यक्तिगत कोशिकाओं के LD सामग्री फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, एक ही formaldehyde-फिक्स्ड BODIPY के साथ दाग कोशिकाओं का उपयोग कर, सेल में LDs की एक छवि प्रदान करते हैं । उनके टैग और एसई सामग्री अब आगे पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।

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Protocol

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1. बफ़र्स और समाधानों की तैयारी

  1. फास्फेट के 1 एल तैयार करने के लिए खारा (पंजाबियों, पीएच 7), NaCl के 8 जी भंग, KCl के 0.2 जी, 1.44 जी के ना2HPO4, KH के ०.२४ g2पीओ4 में 800 मिलीलीटर की distillated पानी. एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित करने के लिए 7.0, और फिर 1 के अंतिम खंड के लिए पानी जोड़ने L. पंजाबियों एक 10x शेयर समाधान के रूप में बनाया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत ।
  2. हल फिक्सिंग के 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, 37% formaldehyde के 1 मिलीलीटर के लिए पंजाब के 9 मिलीलीटर जोड़ने के लिए 3.7% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने । इस समाधान को अभी उपयोग करने से पहले तैयार करें ।
    चेतावनी: formaldehyde समाधान को संभालने के लिए दस्ताने का उपयोग करें ।
  3. शमन समाधान तैयार करने के लिए (500 मिमी), आसुत पानी की 100 मिलीलीटर में की 8.3 g भंग । इस समाधान का उपयोग करने से पहले तैयार है और यह कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  4. BODIPY 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, BODIPY 493/503 के 10 मिलीग्राम dimethyl sulfoxide (DMSO) के 3.8 मिलीलीटर में भंग । -70 ° c पर अंधेरे में 100 µ l aliquots रखें ।
  5. BODIPY 5 µ एम शमन समाधान तैयार करने के लिए, 10 मिमी BODIPY 493/503 के 1 µ एल जोड़ने के लिए 500 मिमी शमन समाधान के 2 मिलीलीटर. LFR परख के लिए, BODIPY के 5 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता की आवश्यकता है ।
  6. खनिज समाधान तैयार करने के लिए, एच3बो के ०.०६ g जोड़ें3, 0.14 g of MnCl2-4H2o, 0.4 g of ZnCl2, 0.04 g च्या ना2मू4-2H2o, 0.1 g of FeCl3-6H2हे व 0.4 g च्या CuSO 4-5H2O से 1 L तक आसुत जल ।
  7. नमक समाधान तैयार करने के लिए, KH के 16 ग्राम जोड़ें2पीओ4, 4 जी की ना2तो4, KCl की 8 माम, MgSO4की 2 माम, CaCl2की 1 ग्राम, और आसुत जल की 1 L को मिनरल सॉल्यूशन की 8 मिलीलीटर ।
  8. यू मेडिस FB2 (a2b2) के लिए एक नाइट्रोजन स्रोत के बिना न्यूनतम माध्यम तैयार करने के लिए, Holliday, एट अल के अनुसार ग्लूकोज और मीलियन मिलीलीटर के 1 एल नमक समाधान के 10 ग्राम जोड़ें । 31. पीएच को 7.0 समायोजित करें और फिर 250 मिलीलीटर कुप्पी में मीडिया के 100 मिलीलीटर बांटें और उंहें निष्फल करें । 15 psi (1.05 kg/cm2) पर तरल चक्र या फिल्टर बंध्याकरण पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव ।
  9. खमीर peptone डेक्सट्रोज मध्यम (YPD) तैयार करने के लिए, खमीर निकालने के 5 जी, peptone के 2.5 जी, और आसुत जल के 1 एल के लिए ग्लूकोज की 5 ग्राम जोड़ें । 250 मिलीलीटर कुप्पी में समाधान के 100 मिलीलीटर वितरण और उन्हें निष्फल । 15 psi (1.05 kg/cm2) पर तरल चक्र या फिल्टर बंध्याकरण पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव ।

2. कल्चरल कंडीशन और सेल निर्धारण

नोट: जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं फिक्सिंग द्वारा LDs की संरचना को बनाए रखने. निर्धारण microcentrifuge ट्यूबों में किया जा सकता है । अगर निर्जलीकरण पानी की एक पतली परत छोड़ने से बचा जाता है निश्चित कोशिकाओं को एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।

  1. अध्ययन के लिए प्रासंगिक संस्कृति शर्तों के तहत U. मेडिस कोशिकाओं को विकसित करना । एक प्रारंभिक आयुध डिपो 0.05 (1.15 × 106 कोशिकाओं/एमएल) के600 के साथ संस्कृति शुरू करो । 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस, 180 rpm पर कोशिकाओं की मशीन । एक आयुध डिपो 1 के600 2.3 × 107 कोशिकाओं/एमएल से मेल खाती है ।
  2. चयनित समय पर, कक्षों की एक aliquot को वापस लें । यू मेडिस के लिए, पहले 8 ज के दौरान 5 मिलीलीटर हर 2 ज को वापस लें । ग्रोथ के 8 ज के बाद 2 एमएल के aliquots काफी हैं ।
  3. प्रत्येक aliquot के 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेल सस्पेंशन एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक का उपयोग कर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
  5. पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं की गोली निलंबित-formaldehyde 3.7% बफर । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
  6. मशीन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 14,000 एक्स जी में सेल निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
  7. आसुत जल (1 मिलीलीटर) की एक समान मात्रा के साथ दो बार कोशिकाओं गोली धो लो । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 14,000 एक्स जी में सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक । प्रत्येक धुलाई चरण के बाद supernatant को त्यागें ।
  8. आसुत जल (समीकरण 1) के साथ 5 आयुध डिपो600 (1.15 x 108 सेल/एमएल) के लिए सेल गोली समायोजित करें ।
    Equation 1    समीकरण 1 ।
  9. इसके उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखें ।

3. लिक्विड प्रतिदीप्ति रिकवरी परख (LFR)

  1. spectrophotometer चालू करें और Skanlt सॉफ़्टवेयर खोलें । नए सत्रपर क्लिक करें, और प्रारंभ चुनें और फिर लक्स Varioskan। सत्र ट्री से प्रोटोकॉल का चयन करें, प्रतिदीप्ति तरंग दैर्ध्य के लिए सेटिंग्स दर्ज करें (उत्तेजना 485 एनएम/उत्सर्जन 510 एनएम; ऑप्टिकल घनत्व 600 एनएम) और चुनें स्वत: photomultiplier लाभ । उत्तेजना बैंडविड्थ के लिए, 12 एनएम का चयन करें । प्रकाशिकी में, शीर्ष का चयन करें (नमूने के उत्तेजना अच्छी तरह से ऊपर से है) ।
  2. एक सौंय और निरंतर आंदोलन (300 rpm) दर्ज करें । चुनें थाली बाहर भागो, और उपयोगकर्ता कार्रवाई जब तक (समय कुओं के लिए नमूने के अलावा के लिए इस्तेमाल किया) को थामने । प्रोटोकॉल को पांच बार दोहराएं । सहेजें क्लिक करें और सत्र नाम फ़ील्डपर सत्र के लिए नाम लिखें । अब नमूनों के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल तैयार है ।
  3. BODIPY 5 µ एम के 200 µ एल जोड़ें-एक 96 अच्छी तरह से काले साफ नीचे की थाली के प्रत्येक कुआं के लिए बुझती समाधान ।
  4. spectrophotometer कक्ष के अंदर थाली प्लेस और 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट की मशीन । इस बिंदु से, प्लेट को जितना हो सके प्रकाश से सुरक्षित रखें ।
  5. प्रारंभ बटन क्लिक करें और प्रतिदीप्ति (उत्तेजना 485/उत्सर्जन 510) और रिक्त स्थान के लिए इसी आयुध डिपो600 पढ़ें ।
  6. ठहराव समय के दौरान कुओं को formaldehyde-फिक्स्ड सेल सस्पेंशन के 5 µ l को जोड़ें । पिपेट के साथ नमूनों को सावधानीपूर्वक मिलाएं । spectrophotometer के अंदर थाली रखो और जारी रखेंक्लिक करें । इसके बाद उसके ऊपर तैयार किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार नमूनों पर कार्रवाई की जाएगी ।
  7. सेल सस्पेंशन के 5 µ l के तीन क्रमिक जोड़ दोहराएं । सुनिश्चित करें कि कक्ष नहीं हाला । (चित्र 1) ।

4. LD सूचकांक की गणना

  1. microplate में प्रत्येक नमूने के लिए, प्रतिदीप्ति और अवशोषक के प्रत्येक क्रमिक अतिरिक्त की मात्रा के खिलाफ एक ग्राफ के भूखंड (5 अंक सहित रिक्त) । इस अध्ययन में, गणना के लिए Microsoft Excel सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । डेटा प्लॉट करने के लिए, क्रमश: डेटापत्रक के पहले, दूसरे और तीसरे स्तंभ में वॉल्यूम, प्रतिदीप्ति और अवशोषक डेटा दर्ज करें । उसके बाद, कर्सर के साथ पूरे डेटा का चयन करें, क्लिक करेंसंमिलित और का चयन करें (XY) स्कैटर ।
  2. ग्राफ़ में प्रत्येक पंक्ति के लिए बिंदुओं का चयन करें और चयनित समीकरण दिखाएं बॉक्स के साथ संबंधित रुझान पंक्ति को डालें । दो सीधे लाइनों के ढलानों के मूल्यों के नीचे लिखें, 2 समीकरण के अनुसार:
    Equation 2    समीकरण 2
    जहां y = प्रतिदीप्ति या ऑप्टिकल घनत्व, x = नमूना की मात्रा (0, 5, 10, 15, 20 µ l), m = प्रतिदीप्ति या ऑप्टिकल घनत्व रेखा की ढलान, और b = y-अवरोधन ।
  3. प्रतिदीप्ति लाइन की ढलान से ऑप्टिकल घनत्व लाइन की ढलान में भाग लेने के लिए LD सूचकांक, समीकरण 3 ।
    Equation 3    समीकरण 3
    LD सूचकांक प्रतिदीप्ति और ऑप्टिकल घनत्व ढलानों के गुणांक से मेल खाती है ।

5. डेटा गुणवत्ता विश्लेषण

  1. प्रत्येक सीधी रेखा के सहसंबंध गुणांक की गणना करें: फ़ंक्शन विज़ार्ड (fx) पर क्लिक करके CORRELचुनें । यदि r < 0.9, तो डेटा छोड़ें और पठन को दोहराएं । यदि r ≥ 0.9, रीडिंग विश्वसनीय हैं ।

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Representative Results

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LFR, BODIPY 493/503 के साथ फ्लोरोसेंट जांच के रूप में एक विश्वसनीय और आसान तरीका है यू मेडिस में LDs के गतिशील संचय का अध्ययन है, चाहे विकास की स्थिति । जब कक्ष YPD-माध्यम में कल्चरित होते थे, तो घातांकीय चरण के दौरान LD इंडेक्स में वृद्धि हुई थी, जिसके बाद स्टेशनरी फेज (चित्र 2a) में गिरावट आई थी । इसके विपरीत, कोशिकाओं में नाइट्रोजन भुखमरी के तहत हो, वहां LD सूचकांक में दोनों घातीय और स्थिर चरणों में एक सतत वृद्धि हुई थी (चित्रा बीसी) । क्योंकि दोनों संस्कृतियों एक ही ऑप्टिकल घनत्व (कोशिकाओं के समान संख्या) के साथ शुरू किया गया, परिणाम LFR परख की उच्च क्षमता को दिखाने के लिए लिपिड सामग्री में छोटे परिवर्तन का पता लगाने (चित्रा 2) । विधि की संवेदनशीलता को फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि गया था: YPD-कोशिकाओं पूरे सेल में कई छोटे lds होते हैं, जबकि नाइट्रोजन भुखमरी के तहत वहां बड़े LDs का एक महत्वपूर्ण उत्पादन था, आम तौर पर प्रति कोशिकाओं 4-5 LDs, (चित्रा 2, सही पैनलों A और B, क्रमशः) । ld सूचकांक तटस्थ लिपिड सामग्री का एक निरपेक्ष मूल्य नहीं है के बाद से, triacylglycerols की राशि के साथ ld सूचकांक से संबंधित एक मानक वक्र निर्माण किया जाना चाहिए । इस दृष्टिकोण एस cerevisiaeमें टैग संश्लेषण की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था20. प्रत्येक मानक वक्र के आधार पर, LFR परख कोशिकाओं में लिपिड संचय की दर को समाप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

LD सूचकांक soraphen की उपस्थिति में पीछा किया जा सकता है एक, एसिटाइल के एक विशेष अवरोधक-CoA carboxylase, एक एंजाइम फैटी एसिड के संश्लेषण के लिए आवश्यक है कि टैग में संग्रहित25LDs. अवरोध करनेवाला एक नाइट्रोजन स्रोत के अभाव में विकास के 2 ज के बाद संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था, एक शर्त है जिसमें कोशिकाओं लिपिड संचय की उच्च दर दिखाया (चित्रा 2 बी). एस cerevisiae में पिछली रिपोर्ट के अनुसार, soraphen के अलावा-एक LD संचय (चित्रा बी2, लाइट ब्लू) 20,21के पूर्ण निषेध में हुई ।

आगे यू मेडिसमें LDs के जमावड़े की जांच करने के लिए, 72 एच के लिए नाइट्रोजन भुखमरी के तहत हो कोशिकाओं YPD-मध्यम (चित्रा 3) को हस्तांतरित किया गया । एक घातीय कार्य के बाद LD सूचकांक में कमी आई । 24 घंटे के बाद, LD अनुक्रमणिका के लिए समान मान तक पहुंच YPD-मध्यम में cultureed नाइट्रोजन अनुपस्थिति (चित्र 2a) के तनाव के बिना । के बाद से कोशिकाओं को नाइट्रोजन भुखमरी के दौरान जमा LDs जुटाने में सक्षम थे, परिणाम टैग सामग्री में कमी का पता चलता है । इसी तरह की प्रतिक्रिया एस cerevisiae के लिए लिपिड चयापचय21के विनियमन में शामिल phosphatases के अध्ययन के दौरान सूचना दी गई थी ।

Figure 1
चित्र 1: LFR में शामिल चरणों का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण. संस्कृति शर्तों के कदम U. मेडिस खमीर के लिए प्रतिनिधि है लेकिन अंय सूक्ष्मजीवों या कोशिकाओं के प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । URF, रिकवरी प्रतिदीप्ति की इकाइयां; bd, bidistilled पाणी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: यू मेडिस में लिपिड बूंदों संचय की गतिशीलता । खमीर कोशिकाओं YPD में 24 घंटे के लिए बड़े हो गए थे मध्यम, काटा और (एक) ताजा YPD में निलंबित मध्यम (ऊपर बाएं पैनल) या में (ख) एक नाइट्रोजन स्रोत के बिना ंयूनतम मध्यम (नीचे बाएं पैनल-डार्क ब्लू) । नाइट्रोजन भुखमरी के तहत, LD सूचकांक में वृद्धि (बी, हल्के नीले रंग) विकास के 2 ज के बाद एक संस्कृति मीडिया में 192 एनएम soraphen एक जोड़कर हिचक रही थी । n = 3, डेटा मतलब ± SEM हैं । सही पैनल: सेल में LDs के फोकल माइक्रोस्कोप 24 घंटे में काटा (एक) शीर्ष पैनल: YPD-कोशिकाओं । (ख) नीचे पैनल: एक नाइट्रोजन स्रोत के बिना कोशिकाओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: LDs संघटन. खमीर कोशिकाओं YPD में 24 ज के लिए बड़े हो गए थे मध्यम, काटा और 24 घंटे के लिए ताजा YPD में हो (नियंत्रण) या ंयूनतम मध्यम में 72 घंटे के लिए एक नाइट्रोजन स्रोत के बिना, तो ताजा-YPD माध्यम को हस्तांतरित और अतिरिक्त 24 के लिए विकसित की गई ज. Aliquots संकेत में वापस ले लिया गया दोनों संस्कृतियों के लिए टाइंस LFR द्वारा LDs के जुड़ाव को मापने के लिए । डेटा एक घातीय क्षय समीकरण द्वारा सज्जित किया गया था (y = A · ई-टी एस) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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LFR एक उपंयास विधि है कि पहली बार के लिए एस cerevisiae में लिपिड चयापचय का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था और बाद में इसे सफलतापूर्वक मेडिस20,21में लागू किया गया था । ld अनुक्रमणिका कक्षों में संचित टैग का एक निरपेक्ष मान नहीं देता है, हालांकि यह कोशिकाओं की लिपिड सामग्री की एक तेजी से विचार प्रदान करता है, और डेटा की व्याख्या सीधी है जब दो या अधिक प्रयोगात्मक शर्तों से LD सूचकांक तुलना कर रहे हैं । BODIPY 493/503 तटस्थ लिपिड के लिए अत्यधिक विशिष्ट है, LDs के मुख्य घटक है, और यह एक संकीर्ण उत्सर्जन अंय अंय संकेतों की एक साथ का पता लगाने की सुविधा है जब कोशिकाएं फोकल द्वारा अध्ययन कर रहे है पर नजर रखने या CMAC नीले रंग की तरह 26माइक्रोस्कोपी । कई फ्लोरोसेंट अणुओं की तरह, BODIPY 493/503 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के दौरान photobleaching के प्रति संवेदनशील है, लेकिन इस प्रक्रिया को27प्रकाश के लिए जोखिम के दौरान विरोधी photobleaching रिएजेंट जोड़कर कम किया जा सकता है । सारांश में, BODIPY 493/503 कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया जा सकता है और तटस्थ लिपिड के संचय और जुड़ाव का अध्ययन करने के लिए21,22,23,28,29

विधि के लिए ठीक से काम करने के लिए, कुछ बिंदु को ध्यान में रखा जाना चाहिए । के बाद से ओडी600 LD सूचकांक की गणना के लिए प्रयोग किया जाता है, कोशिकाओं की आकृति विज्ञान प्रयोग के दौरान क्रांतिकारी परिवर्तन नहीं होना चाहिए । कोशिकाओं के निर्धारण के दौरान intracellular घटकों का संरक्षण भी एक महत्वपूर्ण कदम है, और इस संरक्षण LDs, जो इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य है शामिल करना चाहिए । किसी भी समस्या के बिना कोशिकाओं के कई प्रकार के लिए इस विधि के आवेदन के लिए एक उपयुक्त यौगिक के साथ कोशिकाओं फिक्सिंग बहुत महत्वपूर्ण है. यहां, हम कोशिकाओं की संरचनाओं को ठीक करने के लिए formaldehyde का इस्तेमाल किया; एल्डिहाइड प्रोटीन के अमीनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है । यह बताया गया है कि अन्य aldehydes भी कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के ढांचे को संरक्षित और ऐसा लगता है कि प्रोटीन संरचना में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं कर रहे हैं24,26. formaldehyde का एक नुकसान यह है कि यह छोटी झिल्ली क्षति और mitochondrial और परमाणु झिल्ली के पास vacuole गठन लाती है, लेकिन, इन नकारात्मक प्रभाव सभी एल्डिहाइड निर्धारण विधियों के लिए आम है26। मेथनॉल या एसीटोन की तरह कार्बनिक सॉल्वैंट्स से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे कोशिकाओं में LDs नीचा । कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ निर्धारण निर्जलीकरण और प्रोटीन है, जो एक नकारात्मक प्रभाव माना जा सकता है की वर्षा पर आधारित है । इसके अलावा, कार्बनिक विलायक का उपयोग गैर विशिष्ट धुंधला के साथ जुड़ा हुआ है ।

किसी भी अंय तकनीक के रूप में, LD सूचकांक परख सीमाओं जब अंय प्रणालियों के लिए लागू हो सकता है । कवक कोशिका दीवार के पार BODIPY के प्रसार में समस्याएं, फैटी एसिड संरचना पर प्रतिदीप्ति की निर्भरता, लिपिड के प्रकार और intracellular लिपिड शरीर के भीतर प्रोटीन सामग्री30, बाधा टैग की मात्रा की तुलना करें विभिंन प्रजातियों के बीच या भी एक ही कोशिकाओं के साथ विभिंन पोषण शर्तों के तहत हो । साथ ही, बड़े रूपात्मक परिवर्तन जैसे mycelium या कोशिकाओं के flocculation में संक्रमण कुछ ऐसी समस्याएं हैं जो मिल सकती हैं ।

LD सूचकांक परख एक उच्च प्रवाह विधि है कि छोटे समय और बायोमास और reactants की छोटी मात्रा की आवश्यकता है । परख विश्वसनीय है, और डेटा प्राप्त सही और reproducible हैं । इसके अलावा, यह चिकित्सा में लिपिड चयापचय की गतिशीलता पर अनुसंधान के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है, और यह जैव ईंधन या फ़ीड तेलों के उत्पादन के लिए चिकना जीव के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए बायोटेक्नोलॉजी में एक उपकरण बन सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास कुछ नहीं है प्रकटीकरण

Acknowledgments

यह काम पलाश Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-२०१७०८६४), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117) द्वारा समर्थित था-Universidad Nacional Autónoma de México ( उणां), व Consejo Nacional डे Ciencia y Tecnología (CONACyT २५४९०४-JPP व २५६५२०-GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa do रियो डी जनेरियो (FAPERJ-Cientistas do Nosso Estado: E 26/103.353/2011) । हम QFB के लिए धंयवाद । योजनाबद्ध सिंहावलोकन के लिए ऑस्कर Iván Luqueño Bocardo. हम LDs के फोकल माइक्रोस्कोप में बहुमूल्य मदद के लिए Dr. Miguel टापिया Rodríguez धंयवाद । हम एस cerevisiae में तकनीक विकसित करने में अपने अग्रणी काम के लिए डॉ ब्रूनो Bozaquel मोरैस शुक्रिया अदा करना चाहता हूं कि हम यू. मेडिसके लिए अनुकूलित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

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References

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कवक रोगज़नक़ में तरल प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा लिपिड सूचकांक निर्धारण <em>Ustilago मेडिस</em>
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Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

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