Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Lipid indeks fastsettelse av flytende fluorescens utvinning i Fungal patogen Ustilago Maydis

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/57279
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 1
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å få lipid slippverktøy indeksen (LD index) for å studere dynamikken i triacylglycerols i cellene kulturperler høy gjennomstrømming eksperimenter. LD indeks analysen er en enkel og pålitelig metode som bruker BODIPY 493/503. Denne analysen trenger ikke dispendious lipid utvinning eller mikroskopi analyse.

Abstract

Artikkelen viser hvordan du implementerer LD indeks analysen, som er en følsom microplate analysen å bestemme akkumulering av triacylglycerols (TAGs) i lipid dråper (LDs). LD indeks oppnås uten lipid ekstraksjon. Det kan måle LDs innholdet i høy gjennomstrømming eksperimenter under ulike forhold som vekst i rik eller nitrogen utarmet media. Men metoden ble beskrevet for første gang å studere lipid slippverktøy stoffskiftet i Saccharomyces cerevisiae, den ble brukt til basidiomycete Ustilago maydis. Interessant, og fordi LDs er organelles phylogenetically bevart i eukaryote celler, metoden kan brukes til et stort utvalg av celler, fra gjær til pattedyrceller. LD indeksen er basert på flytende fluorescens utvinning analysen (LFR) av BODIPY 493/503 under slukke forhold, med tillegg av celler fast med formaldehyd. Kalium jod brukes som en fluorescens avsluttes. Forholdet mellom fluorescensen og optisk densitet bakken heter LD indeks. Bakkene beregnes fra de rette linjene hentes når BODIPY fluorescens og optisk tetthet på 600 nm (OD600) plottes mot prøven tillegg. Optimal kvalitet gjenspeiles av korrelasjonskoeffisienter som er lik eller over 0,9 (r ≥ 0,9). Flere eksempler kan leses samtidig som det kan gjennomføres i en microplate. Siden BODIPY 493/503 er en lipofile fluorescerende farge som partisjoner i lipid dråper, kan den brukes i mange typer celler som akkumuleres LDs.

Introduction

Lipid dråper (LDs) er allestedsnærværende intracellulær fett organer består av en kjerne av nøytrale lipider, hovedsakelig koder og sterol estere (SE). Kjernen er omgitt av en monolayer av fosfolipider som samhandler med proteiner som perilipin og enzymer som er involvert i syntesen av nøytrale lipider, som diacylglycerol acyl-transferase, acetyl-CoA carboxylase og acyl-CoA syntase1. På grunn av sin dynamiske virkemåten inneholder også phospholipid monolayer triacylglycerol lipases som hydrolyze koder og SE2. Avhengig av celle type og organisme, lagrede nøytral lipider kan brukes til å generere energi, eller syntetisere fosfolipider og signalnettverk molekyler. I gjær og annen sopp, innholdet i LDs endringer i svaret til variasjoner i nitrogen/karbon forholdet i kultur media, indikerer at redusert nitrogen tilgjengelighet kan være nøkkelen til å øke nøytral lipid produksjon3,4 ,5. Produksjon av store mengder TAGs i gjær har en potensiell bruk i bioteknologi som kilde til biodrivstoff i næringsmiddelindustrien. Noen lagrede lipider inneholder høye andelen flerumettede fettsyrer, som omega 3 og omega 6, med ernæringsmessige og kosttilskudd vekt, 6,,7,,8,,9,,10 , 11. LDs av pattedyrceller, inkludert menneskelige celler, også inneholder koder og kolesterol estere. Phospholipid monolayer samhandler med pattedyr homologe proteiner beskrevet i gjær LDs, og med en ekstra protein, perilipin, som er fraværende i S. cerevisiae12. En foreslått rolle for phospholipid monolayer og tilhørende proteiner er å stabilisere LDs strukturen og tillate samspillet av LDs med organeller mitokondriene, endoplasmatiske retikulum, peroxisomes og vacuoles, hovedsakelig for lipid exchange 13,14. Interessant, i mennesker synes LDs å være involvert i patologi som type 2 diabetes, atherosclerosis, steatohepatitis og koronar hjertesykdom, som det er en økning i deres nummer 15,16,17 . Noen typer virus bruker LDs som plattformer for å montere virions 2,18,19.

Implikasjonene av ld i menneskelig patologi og deres potensielle bioteknologisk bruk har nøyaktige eksperimentell bestemmelse av LDs dannelsen en viktig oppgave. Denne artikkelen beskriver en pålitelig analysen basert på utvinning av fluorescens (LFR) av BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), for å få en relative verdien av innholdet i nøytral lipider i celler. Med denne analysen er det mulig å følge dynamikken i akkumulering av nøytrale lipider i sopp som U. maydis og S. cerevisiae, og også i pattedyrceller, uten behovet av lipid utvinning 20. Metoden ble brukt for første gang i S. cerevisiae å identifisere protein phosphatases og kinaser involvert i regulering av lipid metabolisme. Dette var mulig uten lipid utvinning eller protein rensing21,22. LFR har også blitt brukt til å etablere dynamikken i LDs formasjonen i peritoneal makrofager23. Bruk av BODIPY 493/503 har noen fordeler fremfor andre nøytral lipid fargestoffer Nilen rødt. BODIPY 493/503 er svært spesifikke for nøytral lipider og har en smal utslipp spektrum, tilrettelegge samtidige påvisning av signaler fra fargestoffer som røde fluorescerende protein eller Mito-bane, når prøvene er analysert av AC confocal mikroskopi. Dessverre BODIPY 493/503 er følsom for photobleaching, men denne prosessen kan unngås ved hjelp av en antiquenching reagens ved eksponering for lys24.

For å gjennomføre LFR analysen i gjærceller, de er kultivert under ønsket ernæringsmessige forhold og dele er trukket til forskjellige tider. Deretter er celler løst med formaldehyd, som beholder integriteten til LDs måneder når cellene lagres på 4 ° C. Andre fiksering teknikker bør unngås, spesielt de med metanol eller kald aceton, siden de føre til nedbrytning av LDs innenfor cellene24. For å måle LD indeksen, er formaldehyd-fast celler suspendert i vann for å få en definert konsentrasjon. Deretter legges de til en løsning som inneholder fluorophore BODIPY 493/503 slukket av KI, og når fluorophore kommer inn i cellen, og knytter ld, det er en utvinning av sin fluorescens. Samtidig til fluorescens måling (485 nm/510 nm), konsentrasjonen av celler er kvantifisert ved å måle optisk densitet ved 600 nm. Hvert utvalg leses fire ganger av legge påfølgende 5 µL dele en formaldehyd-fast celle suspensjon til samme godt. Tomme fluorescens og absorbansen er ervervet før tillegg av celler. Kvaliteten på fluorescensen og absorbansen data evalueres ved å bestemme linearitet av målinger: Hvis r < 0,9, data forkastes. R-verdien er viktig fordi utgangspunktet intensiteten av fluorescens skal produsere en lineær respons på økende celle konsentrasjoner. Hvis cellen konsentrasjonen er for høy, er linearitet tapt. LFR analysen gir en rask, enkel og økonomisk metode for å velge ønsket LD fenotypen høy gjennomstrømming eksperimenter. Når du har valgt ønsket forhold, kan LD innholdet i enkeltceller studeres ved AC confocal mikroskopi, bruker de samme formaldehyd-fast cellene med BODIPY, gir et bilde av ld i cellen. Sine koder og SE innhold kan nå videre analyseres av tynt lag kromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av buffere og løsninger

  1. For å forberede 1 L fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7), løses 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 i 800 mL distillated vann. Justere pH 7.0 med HCl, og deretter legge vann til et endelig antall 1 L. PBS kan gjøres som en 10 x lagerløsning og oppbevares ved romtemperatur.
  2. For å forberede 10 mL fikse løsning, legge til 1 mL av 37% formaldehyd 9 mL PBS nå en siste konsentrasjon av 3,7%. Klargjør denne løsningen bare før bruk.
    Advarsel: Hansken brukes til å håndtere formaldehyd løsningen.
  3. For å forberede den slukker-løsningen (500 mM), løses 8.3 g KI i 100 mL destillert vann. Forberede denne løsningen før bruk og oppbevares ved romtemperatur.
  4. For å forberede BODIPY 10 mM lagerløsning, løses 10 mg av BODIPY 493/503 i 3,8 mL dimethyl sulfoxide (DMSO). Holde 100 µL dele i mørket på-70 ° C.
  5. For å forberede BODIPY 5 µM-slukker løsning, Legg 1 µL av 10 mM BODIPY 493/503 til 2 mL 500 mM slukke løsning. LFR analysen er en siste konsentrasjon på 5 µM til BODIPY nødvendig.
  6. For å forberede den mineral løsningen, legge 0,06 g H3BO3, 0,14 g av MnCl2-4 H2O, 0.4 g av ZnCl2, 0.04 g av Na2MoO4-2 H2O, 0.1 g av FeCl3-6 H2O og 0,4 g CuSO 4-5 H2O 1 L destillert vann.
  7. For å forberede salt løsning, legge 16 g KH2PO4, 4 g av Na2så4, 8 g av KCl, 2 g MgSO4, 1 g CaCl2og 8 mL av mineral løsning 1 L destillert vann.
  8. Å forberede minimal medium uten en nitrogen kilde for U. maydis FB2 (a2b2), legge til 10 g av glukose og 62.5 mL salt løsning 1 L destillert vann, ifølge Holliday, et al. 31. justere pH 7.0 dispensere 100 mL media i 250 mL flasker og sperre. Autoclave etter 20 min på 15 psi (1.05 kg/cm2) på flytende syklus eller filter sterilisere.
  9. For å forberede den gjær pepton druesukker mediet (YPD), legger du til 5 g av gjær ekstra, 2.5 g av pepton og 5 g av glukose til 1 L destillert vann. Dispensere 100 mL løsningen i 250 mL flasker og sperre. Autoclave etter 20 min på 15 psi (1.05 kg/cm2) på flytende syklus eller filter sterilisere.

2. kultur tilstand og celle fiksering

Merk: Bevare strukturen i ld ved å feste cellene så snart som mulig. Fiksering kan gjøres i microcentrifuge rør. Fast cellene kan holdes på 4 ° C i opptil en måned hvis dehydrering unngås forlate et tynt lag av vann.

  1. Vokse U. maydis celler under oppdrettsforholdene relevante for studier. Start kultur med en innledende OD600 av 0,05 (1,15 × 106 celler / mL). Inkuber cellene på 28 ° C, 180 rpm for 24 timer. En OD600 1 tilsvarer 2.3 × 107 celler / mL.
  2. På den tid, ta ut en aliquot av cellene. For U. maydis, trekke 5 mL hver 2t under første 8 h. Etter 8 h vekst er dele 2 mL nok.
  3. Måle optisk densitet ved 600 nm i hver aliquot.
  4. Sentrifuge celle suspensjon 14 000 x g for 1 min på 4 ° C ved hjelp av en tabletop sentrifuge. Kast nedbryting.
  5. Utsette pellets cellene i 1 mL av PBS-formaldehyd 3,7% buffer. Inkuber cellene i 15 min ved romtemperatur.
  6. Etter inkubasjon, sentrifuge celle suspensjon 14 000 x g for 1 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
  7. Vask celler pellet to ganger med en lignende mengde destillert vann (1 mL). Sentrifuge celle suspensjon 14 000 x g for 1 min på 4 ° C. Kaste nedbryting etter hvert vask trinn.
  8. Justere celle pellet 5 OD600 (1.15 x 108 -cellers / mL) med destillert vann (formel 1).
    Equation 1    Formel 1.
  9. Holde prøven på 4 ° C før bruk.

3. flytende fluorescens utvinning analysen (LFR)

  1. Slå på spektrofotometeret og åpne Skanlt programvare. Klikk på ny økt, og velg START og deretter Varioskan Lux. Velg protokoll fra økt treet, angir innstillingene for fluorescens bølgelengdene (eksitasjon 485 nm/utslipp 510 nm, optisk densitet 600 nm) og velger automatisk photomultiplier gevinst. For eksitasjon båndbredde, Velg 12 nm. Optikk, Velg øverst (magnetisering av prøven er fra toppen av brønnen).
  2. Angi en mild og kontinuerlig agitasjon (300 rpm). Velg Kjør PLATE utog PAUSE til BRUKERHANDLING (tidsforbruket for tillegg av prøven fordelt). Gjenta protokollen fem ganger. Klikk Lagre og skrive inn et navn for økt på Økt NAVNEFELTET. Protokollen er nå klar for prøver analyser.
  3. Legge til 200 µL av BODIPY 5 µM - slukket løsning i hver brønn av en 96 godt svart-klare bunnplaten.
  4. Plasser platen inne spektrofotometer kammeret og Inkuber 5 min på 30 ° C. Fra dette punktet, beskytte platen fra lys så mye som mulig.
  5. Klikk START -knappen og Les fluorescens (eksitasjon 485/utslipp 510) og OD600 tilsvarer de tomme feltene.
  6. Legge til 5 µL av formaldehyd-fast celle suspensjon fordelt under pausetid. Bland prøvene nøye med pipette. La platen i spektrofotometeret og klikk Fortsett. Deretter vil prøvene bli behandlet i henhold til protokollen utviklet over.
  7. Gjenta tre påfølgende tillegg av 5 µL av cellen suspensjon. Kontroller at cellene ikke føre. (Figur 1).

4. beregning av LD indeksen

  1. For hver prøve i microplate, kan du lage en grafisk fremstilling av fluorescens og absorbansen mot volumet av hver påfølgende tillegg (5 poeng inkludert tomt). I denne studien bruk Microsoft Excel programvare for beregninger. Tegne inn dataene, skriver du inn volumet, fluorescens og absorbansen dataene i først, andre og tredje kolonne i dataarket, henholdsvis. Velg hele data med markøren, klikk Sett inn og velg PUNKTDIAGRAMMER (XY).
  2. Velg poeng for hver linje i diagrammet og setter inn den tilsvarende TRENDLINJEN merket av for Vis ligning . Skriv ned verdiene for av de to rette linjene, ifølge ligning 2:
    Equation 2    Ligning 2
    Hvor y = fluorescens eller optisk densitet, x = volum av prøve (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = skråningen av fluorescens eller optisk densitet linje og b = y-skjæringspunktet.
  3. Dele skråningen av fluorescens linjen av skråningen av optisk densitet linjen for å få LD indeksen, Formel 3.
    Equation 3    Formel 3
    LD indeksen tilsvarer kvotienten av fluorescens og optisk densitet bakker.

5. kvalitet dataanalyse

  1. Beregne korrelasjonskoeffisienten til hver rett linje: på FUNKSJONSVEIVISEREN (fx) og velg korrelasjon. Hvis r < 0,9, forkaste data og gjenta målingene. Hvis r ≥ 0,9, målinger er pålitelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LFR, med BODIPY 493/503 som fluorescerende sonden er en pålitelig og lett å studere dynamisk akkumulering av LDs i U. maydis, uansett vekst betingelsene. Når celler ble kultivert i YPD-medium, var det en økning i LD indeksen i eksponentiell fasen etterfulgt av en nedgang i stasjonære fase (figur 2A). I kontrast i celler dyrket under nitrogen sult, var det en jevn økning i LD indeksen i begge eksponentiell og stasjonære faser (figur 2B). Fordi begge kulturer ble startet med samme optisk tetthet (tilsvarende antall celler), viser resultatene høy kapasitet av LFR analysen å oppdage små endringer i lipid innhold (figur 2). Følsomheten til metoden ble bekreftet av AC confocal mikroskopi: YPD-cellene inneholder mange små LDs gjennom hele cellen, mens under nitrogen sult det var en viktig produksjon av store LDs, vanligvis 4-5 LDs per celler (figur 2, høyre paneler A og B, henholdsvis). Siden LD indeksen ikke er en absolutt verdi nøytral lipid innhold, bør en standardkurve knyttet LD indeksen med mengden av triacylglycerols være konstruert. Denne tilnærmingen ble brukt til å studere dynamikken i TAGs syntese i S. cerevisiae20. Basert på hver standardkurve, LFR analysen kan brukes til determinate frekvensen av lipid akkumulering i celler.

LD indeksen kan følges i nærvær av soraphen A, en bestemt inhibitor av acetyl-CoA carboxylase, et enzym som er nødvendig for syntesen av fettsyrer finnes i kodene lagret i LDs25. Inhibitor ble lagt til kultur mediet etter 2 timer med veksten i fravær av en nitrogen kilde, en tilstand der cellene viste høyere frekvensen av lipid opphopning (figur 2B). I samsvar med tidligere rapporter i S. cerevisiae, resulterte tillegg av soraphen-A i full hemming av LD opphopning (figur 2B, lys blå) 20,21.

For ytterligere å undersøke mobilisering av LDs i U. maydis, ble celler dyrket under nitrogen sult 72 h overført til YPD-middels (Figur 3). LD indeks redusert etter en eksponentiell funksjon. Etter 24 timer nådde LD indeksen like verdier som observert i celler kultivert i YPD-medium uten stress nitrogen fravær (figur 2A). Siden cellene var i stand til å mobilisere ld akkumulert under nitrogen sult, antyder resultatet en reduksjon i TAGs innholdet. Et lignende svar ble rapportert for S. cerevisiae under studiet av phosphatases involvert i regulering av lipid metabolisme21.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av trinnene involvert i LFR. Trinnene i oppdrettsforholdene er representative for U. maydis gjær, men kan tilpasses andre microorganism eller type celler. URF, enheter av utvinning fluorescens; BD, bidistilled vann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: dynamikk av lipid dråper ansamling i U. maydis. Gjærceller var vokst for 24 timer i YPD-medium, høstet og suspendert i (A) ferske YPD mellomstore (øverste venstre panel) eller (B) minimal medium uten en nitrogen kilde (nedre venstre panel-mørk blå). Under nitrogen sult, var økningen i LD indeksen hemmet ved å legge til 192 nM soraphen A i kultur media etter 2 timer med vekst (B, lys blå). n = 3, er gjennomsnittlig ± SEM. Høyre panel: AC confocal mikroskopi av LDs i celle høstes ved 24 h. (A) toppanelet: YPD-celler. (B) nedre panelet: celler uten en nitrogen kilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: LDs mobilisering. Gjærceller var vokst for 24 timer i YPD-medium, høstet og dyrket i frisk YPD 24 h (kontroll) eller i minimal uten en nitrogen kilde for 72 timer, deretter overført til frisk-YPD middels og inkubert for ekstra 24 h. dele ble trukket på angitt ganger for begge kulturer å måle mobilisering av LDs av LFR. Data var utstyrt med en eksponensiell decay ligning (y = A·e-kt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LFR er en ny metode som ble brukt for første gang å studere lipid stoffskiftet i S. cerevisiae og senere var vellykket gjennomført i U. maydis20,21. LD indeksen ikke gir en absoluttverdien koder akkumulert i celler, det gir en rask idé av lipid innhold av celler og tolkning av data er ukomplisert sammenlignet LD indeks fra to eller flere eksperimentelle forhold. BODIPY 493/503 er svært spesifikke for nøytral lipider, hovedkomponenten i LDs, og den har en smal utslipp spektrum tilrettelegge samtidige påvisning av andre signaler kommer fra fargestoffer som Mito-tracker eller CMAC blå når celler er studert av AC confocal mikroskopi26. Som mange fluorescerende molekyler, BODIPY 493/503 er følsom for photobleaching under fluorescens mikroskopi eksperimenter, men denne prosessen kan reduseres ved å legge anti photobleaching reagenser under eksponering lys27. I sammendraget, kan BODIPY 493/503 brukes i en rekke celler for å studere akkumulering og mobilisering av nøytrale lipider,21,,22,,23,,28,,29.

For metoden skal fungere riktig må tidspunkt tas i betraktning. OD600 brukes for beregning av LD indeksen, ha morfologi av cellene ikke radikale endringer under eksperimentet. Bevaring av intracellular komponenter under fiksering av celler er også et avgjørende skritt, og denne bevaring bør inneholde LDs, som er det viktigste formålet med denne protokollen. Feste cellene med en passende sammensatt er svært viktig for anvendelse av denne metoden for mange typer celler uten problem. Her brukte vi formaldehyd for å fikse strukturer av celler. aldehyd reagerer med amino grupper av proteiner. Det har blitt rapportert at andre aldehyder også bevare strukturene i en rekke celler og det synes at det ikke er vesentlige endringer i proteiner struktur24,26. En ulempe med formaldehyd er at det medfører liten membran skade og vacuole formasjonen nær den mitokondrie og kjernefysiske membraner, men, disse negative effekter er felles for alle aldehyd fiksering metoder26. Organiske løsemidler som metanol eller aceton bør unngås fordi de forringe ld i cellene. Fiksering med organiske løsemidler er basert på dehydrering og nedbør av proteiner, som kan betraktes som en negativ effekt. I tillegg er bruk av organisk løsemiddel knyttet ikke-spesifikk farging.

Som alle andre teknikk, kan LD indeks analysen ha begrensninger når implementert for andre systemer. Problemer i spredningen av BODIPY over fungal cellen vegg, avhengigheten av fluorescensen fettsyrer komposisjon, lipider og proteininnholdet i intracellulær lipid organer30, utelukke sammenligning av mengden av kodene mellom forskjellige arter eller til og med de samme cellene vokst under ulike ernæringsmessige forhold. Store morfologiske endringer som overgangen mycel eller flocculation celler er også noen av problemene som kan bli funnet.

LD indeks analysen er en høy gjennomstrømming metode som krever kort tid og små mengder biomasse og reaktantene. Analysen er pålitelig, og dataene innhentet er nøyaktig og reproduserbar. I tillegg gir retningslinjer for forskning på dynamikken i lipid stoffskiftet i medisin, og det kan bli et verktøy i bioteknologi for høy gjennomstrømming screening av oleaginous organisme for produksjon av biodrivstoff eller mate oljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke til avsløring

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo en Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autónoma de México ( UNAM), og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP og 256520-GGS). Fundação de Amparo en Pesquisa gjøre Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas gjøre Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Vi takket være QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo den skjematisk oversikt. Vi takker Dr. Miguel Tapia Rodríguez for verdifull hjelp i AC confocal mikroskopi av LDs. Vi ønsker å takke Dr. Bruno Bozaquel Morais for sitt banebrytende arbeid i å utvikle teknikken i S. cerevisiae som vi tilpasset U. maydis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).

Tags

Biokjemi problemet 134 Lipid indeks lipid dråper basidiomycete fluorescens utvinning BODIPY 493/503 Ustilago maydis
Lipid indeks fastsettelse av flytende fluorescens utvinning i Fungal patogen <em>Ustilago Maydis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli,… More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter