Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Lipid indeks bestemmelse af flydende fluorescens opsving i svampe patogen Ustilago Maydis

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/57279
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 1
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

Her, beskriver vi en protokol for at opnå lipid droplet index (LD indeks) for at studere dynamikken i triglycerider i celler dyrkes i høj overførselshastighed eksperimenter. LD indeks assay er en nem og pålidelig metode, der bruger BODIPY 493/503. Denne analyse behøver ikke dispendious lipid udvinding eller mikroskopi analyse.

Abstract

Artiklen viser hvordan man gennemfører LD indeks assay, som er en følsom mikrotiterplade assay til at bestemme ophobning af triglycerider (TAGs) i lipid dråber (LDs). LD indeks er fremstillet uden lipid udvinding. Det giver mulighed for måling af LDs indhold i høj overførselshastighed eksperimenter under forskellige betingelser som vækst i rige eller nitrogen forarmet medier. Omend metoden blev beskrevet for første gang at studere droplet lipidmetabolismen i Saccharomyces cerevisiae, det blev anvendt til basidiomycete Ustilago maydis. Interessant nok, og fordi LDs er organelles Fylogenetisk bevaret i eukaryote celler, metoden kan anvendes til en lang række celler, fra gær til pattedyrsceller. LD-indekset er baseret på flydende fluorescens opsving assay (LFR) af BODIPY 493/503 quenching betingelser, ved tilsætning af celler fast med formaldehyd. Kalium jod bruges som et fluorescens quencher. Forholdet mellem fluorescens og ekstinktionen skråninger er opkaldt LD indeks. Pisterne er beregnet ud fra de lige linjer opnås når BODIPY fluorescens og optisk tæthed på 600 nm (OD600) afbildes mod prøven tilsætning. Optimal datakvalitet afspejles af korrelationskoefficienterne lig eller over 0,9 (r ≥ 0,9). Flere prøver kan læses samtidig, som det kan gennemføres i en mikrotiterplade. Da BODIPY 493/503 er en lipofile fluorescerende farvestof at partitioner i lipid dråber, kan det bruges i mange typer af celler, der ophobes LDs.

Introduction

Lipid dråber (LDs) er allestedsnærværende intracellulære fedt organer består af en kerne af neutrale lipider, hovedsagelig TAGs og sterol estere (SE). Kernen er omgivet af en éncellelag af fosfolipider, der interagerer med proteiner som perilipin og enzymer involveret i syntesen af neutrale lipider, som diacylglycerol acyl-transferase, acetyl-CoA carboxylase og acyl-CoA syntase1. På grund af dens dynamiske opførsel indeholder phospholipid éncellelag også triacylglycerol lipaser, der hydrolyserer TAGs og SE2. Celletype og organisme, gemte neutral lipider kan bruges til at generere energi, eller syntetisere fosfolipider og signalering molekyler. Gær og andre svampe, indholdet af LDs ændringer som reaktion på variationer af kvælstof/carbon forhold i dyrkningsmedier, der angiver, at nedsat kvælstof tilgængelighed kan være nøglen til at øge neutral lipid produktion3,4 ,5. Produktion af store mængder af TAGs i gær har en potentiel brug i bioteknologi som kilde til biobrændstof og i fødevareindustrien. Nogle lagrede lipider indeholder høje proportioner af flerumættede fedtsyrer som omega 3 og omega 6, med ernæringsmæssige og diætetiske vægt 6,7,8,9,10 , 11. LDs i pattedyrceller, herunder menneskeceller, også indeholde TAGs og kolesterol estere. Fosfolipid éncellelag interagerer med pattedyr homologe af de proteiner, der er beskrevet i gær LDs, og med en ekstra protein, perilipin, som er fraværende i S. cerevisiae12. En foreslået rolle for phospholipid éncellelag og dets tilknyttede proteiner er at stabilisere LDs struktur og tillade interaktion af LDs med organeller som mitokondrier, endoplasmatiske reticulum, peroxisomer og vacuoles, hovedsagelig for lipid udveksling 13,14. Interessant, i mennesker synes LDs at være involveret i sygdomme som type 2-diabetes, åreforkalkning, steatohepatitis og koronar hjertesygdom, hvor der er en stigning i deres nummer 15,16,17 . Nogle typer af virus bruge LDs som platforme til at samle virioner 2,18,19.

På grund af konsekvenserne af LDs i menneskelige patologier og deres potentielle bioteknologiske brug er nøjagtige eksperimentel bestemmelse af LDs dannelse en vigtig opgave. I denne artikel beskrives en pålidelig analyse baseret på genopretning af fluorescens (LFR) af BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), at få en relativ værdi af indholdet af neutrale lipider i celler. Med denne analyse er det muligt at følge dynamikken i ophobning af neutrale lipider i svampe som U. maydis og S. cerevisiae, og også i pattedyrceller, uden brug af lipid udvinding 20. Metoden blev anvendt for første gang i S. cerevisiae til at identificere protein fosfataser og kinaser involveret i regulering af lipid metabolisme. Dette var muligt uden lipid udvinding eller protein oprensning21,22. LFR er også blevet brugt til at etablere dynamikken i LDs dannelse i peritoneal makrofager23. Brug af BODIPY 493/503 har nogle fordele i forhold til andre neutrale lipid farvestoffer som Nilen rød. BODIPY 493/503 er meget specifik for neutral lipider og har en smal emission spektrum, lette den samtidige påvisning af signaler fra farvestoffer som rødt fluorescerende proteiner eller Mito-tracker, når prøverne er analyseret af Konfokal mikroskopi. Desværre BODIPY 493/503 er følsomme over for photobleaching, men denne proces kan undgås ved hjælp af en antiquenching reagens under eksponering for lys24.

For at udføre LFR assay i gærceller, de er kulturperler på de ønskede ernæringsmæssige betingelser, og etherlaget trækkes på forskellige tidspunkter. Næste, celler er rettet med formaldehyd, som bevarer integriteten af LDs måneder når celler opbevares ved 4 ° C. Andre fiksering teknikker bør undgås, især dem, der bruger methanol eller kolde acetone, eftersom de fører til nedbrydning af LDs inden celler24. For at måle LD indeks, er formaldehyd-fast celler suspenderet i vand for at opnå en defineret koncentration. Derefter, de føjes til en løsning, der indeholder fluorophore BODIPY 493/503 bratkølet af KI, og når fluorophore ind i cellen og associates med LDs, der er en genoprettelse af dets fluorescens. Samtidig til fluorescens målingen (485 nm/510 nm), koncentration af celler er kvantificeret ved måling af ekstinktionen på 600 nm. Hver prøve er læst fire gange ved at tilføje efterfølgende 5 µL delprøver af en formaldehyd-fast cellesuspension til samme godt. Tomme af fluorescens og absorbansen er erhvervet før tilsætning af celler. Kvaliteten af fluorescens og absorbans data evalueres ved at bestemme lineariteten af målingerne: Hvis f < 0,9, data er kasseret. R-værdien er vigtigt, fordi dybest set intensiteten af fluorescens skal producere en lineær respons til stigende celle koncentrationer. Hvis cellen er alt for høj, er lineariteten tabt. LFR analysen giver en hurtig, enkel og økonomisk metode til at vælge den ønskede LD fænotype i høj overførselshastighed eksperimenter. Når du har valgt de ønskede betingelser, kan LD indhold i individuelle celler studeres af Konfokal mikroskopi, ved hjælp af de samme formaldehyd-fast celler farves med BODIPY, hvilket giver et billede af LDs i cellen. Deres TAGs og SE indhold kan nu yderligere analyseres ved tyndtlagskromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fremstilling af buffere og løsninger

  1. For at forberede 1 L af phosphat bufferet saltvand (PBS, pH 7), 8 g NaCl, 0,2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 i 800 mL distillated vand opløses. PH indstilles til 7.0 med HCl, og derefter tilføje vand til en afsluttende bind 1 L. PBS kan være lavet som en 10 x stamopløsning og opbevares ved stuetemperatur.
  2. For at forberede 10 mL af fastsættelse af løsning, der tilsættes 1 mL af 37% formaldehyd til 9 mL PBS at nå frem til en endelig koncentration på 3,7%. Forberede denne løsning lige før brug.
    Forsigtig: Brug handsker til at håndtere formaldehyd løsning.
  3. For at forberede dæmper-løsningen (500 mM), 8,3 g KI i 100 mL destilleret vand opløses. Forberede denne løsning før brugen, og opbevar den ved stuetemperatur.
  4. For at forberede BODIPY 10 mM stamopløsning, 10 mg af BODIPY 493/503 i 3,8 mL af dimethylsulfoxid (DMSO) opløses. Holde 100 µL delprøver i mørke ved-70 ° C.
  5. For at forberede BODIPY 5 µM-quenching løsning, tilsæt 1 µL af 10 mM BODIPY 493/503-2 mL 500 mM quenching løsning. For LFR assay er en endelig koncentration på 5 µM af BODIPY påkrævet.
  6. For at forberede den mineral løsning, tilføje 0,06 g H3BO3, 0,14 g frihedsbevægelse2-4 H2O, 0,4 g af ZnCl2, 0,04 g Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g af FeCl3-6 H2O og 0,4 g CuSO 4-5 H2O til 1 L med destilleret vand.
  7. For at forberede den saltopløsning, tilføje 16 g KH2PO4, 4 g Na2så4, 8 g af KCl, 2 g af MgSO4, 1 g af CaCl2og 8 mL af mineral løsning til 1 L med destilleret vand.
  8. At forberede den minimale medium uden en nitrogen kilde for U. maydis FB2 (a2b2), tilsættes 10 g glukose og 62,5 mL af saltopløsning til 1 L destilleret vand, ifølge Holliday, et al. 31. pH 7.0 og derefter afpipetteres 100 mL af medierne i 250 mL målekolber og sterilisere dem. Autoklave i 20 min. på 15 psi (1,05 kg/cm2) på flydende cyklus eller filter sterilisere.
  9. For at forberede gæren pepton dextrose medium (YPD), tilføje 5 g gær extract, 2,5 g af pepton, og 5 g glucose til 1 L med destilleret vand. Give afkald på 100 mL opløsning i 250 mL målekolber og sterilisere dem. Autoklave i 20 min. på 15 psi (1,05 kg/cm2) på flydende cyklus eller filter sterilisere.

2. kultur tilstand og celle fiksation

Bemærk: Bevare strukturen i LDs ved fastsættelse af cellerne så hurtigt som muligt. Optagelse kan ske i microcentrifuge rør. Fast celler kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned, hvis dehydrering undgås efterlader et tyndt lag af vand.

  1. Vokse U. maydis celler under dyrkningsbetingelser relevante for undersøgelsen. Start kulturen med en indledende OD600 på 0,05 (1,15 × 106 celler / mL). Inkuber celler ved 28 ° C, 180 rpm i 24 timer. En OD600 1 svarer til 2,3 × 107 celler / mL.
  2. På den valgte gange, trække en alikvot af cellerne. For U. maydis, skal du trække 5 mL hver 2 h under de første 8 h. Efter 8 h af vækst er delprøver på 2 mL nok.
  3. Måle den optisk tæthed på 600 nm af hver delprøve.
  4. Der centrifugeres cellesuspension ved 14.000 x g i 1 min. ved 4 ° C ved hjælp af en bordplade centrifuge. Supernatanten.
  5. Suspendere pellet celler i 1 mL PBS-formaldehyd 3,7% buffer. Inkuber celler i 15 min. ved stuetemperatur.
  6. Efter inkubation, centrifugeres cellesuspension ved 14.000 x g i 1 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
  7. Vaske cellerne pellet to gange med en tilsvarende mængde destilleret vand (1 mL). Centrifugeres cellesuspension ved 14.000 x g i 1 min. ved 4 ° C. Supernatanten efter hver vask trin.
  8. Justere den celle pillen 5 OD600 (1,15 x 108 celler / mL) med destilleret vand (ligning 1).
    Equation 1    Ligning 1.
  9. Holde prøven ved 4 ° C indtil brug.

3. flydende fluorescens opsving Assay (LFR)

  1. Tænd spektrofotometrets og åbne Skanlt software. Klik på ny SESSIONog vælg START og derefter Varioskan Lux. Vælg protokol fra træet session, Angiv indstillingerne for fluorescens bølgelængder (excitation 485 nm/emission 510 nm; ekstinktionen 600 nm) og vælge automatisk photomultiplier gevinst. Excitation båndbredde, Vælg 12 nm. I optikken, Vælg top (excitation af prøven er fra toppen af brønden).
  2. Angiv en blid og kontinuerlig agitation (300 rpm). Vælg Kør pladen udog PAUSE indtil THE BRUGERHANDLING (tid brugt til tilsætning af prøven til brøndene). Gentag protokollen fem gange. Klik på Gem og skrive et navn for sessionen på SESSION NAVNEFELTET. Protokollen er nu klar til prøver analyser.
  3. Tilføje 200 µL af BODIPY 5 µM - bratkølet løsning til hver brønd med en 96 godt sort-klar bundplade.
  4. Pladen anbringes inde i spektrofotometrets kammer og Ruger 5 min. ved 30 ° C. Fra dette punkt, beskytte plade fra lys så meget som muligt.
  5. Klik på knappen START og læse fluorescens (excitation 485/emission 510) og OD600 svarende til de tomme felter.
  6. Tilføj 5 µL af formaldehyd-fast cellesuspension brønde under pausetid. Bland prøveeksemplarerne omhyggeligt med en pipette. Sætte pladen inde i spektrofotometrets og klik på Fortsæt. Derefter, prøverne vil blive behandlet i henhold til protokollen designet ovenfor.
  7. Gentag tre successive tilføjelser af 5 µL af cellesuspension. Kontroller, at cellerne ikke bundfald. (Figur 1).

4. beregninger af LD indeks

  1. For hver prøve i mikrotiterplade Absorbanserne afbildes af fluorescens og absorbans mod volumen af hver efterfølgende tilsætning (5 punkter, herunder tomme). I denne undersøgelse, skal du bruge Microsoft Excel software til beregningerne. At afbilde data, skal du indtaste volumen, fluorescens og absorbans data i første, anden og tredje kolonne i dataarket, henholdsvis. Vælg derefter den hele data med markøren, klik på Indsæt og vælg (XY) SCATTER.
  2. Vælg point for hver linje i grafen og Indsæt den respektive TENDENSLINJE med boksen Vis LIGNING valgt. Notér dig værdierne af skråninger på de to lige linjer, ifølge ligning 2:
    Equation 2    Ligning 2
    Hvor y = fluorescens eller optisk tæthed, x = volumen af prøven (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = hældning af fluorescens eller ekstinktionen linje og b = y-skæringspunkt.
  3. Opdele hældningen af linjen fluorescens af hældningen af linjen ekstinktionen at få LD indeks, ligning 3.
    Equation 3    Ligning 3
    LD indeks svarer til kvotienten af fluorescens og ekstinktionen skråninger.

5. kvalitet dataanalyse

  1. Beregnes korrelationskoefficienten af hver lige linje: Klik på Guiden funktion (fx) og vælge korrelation. Hvis f < 0,9, kassere data og Gentag aflæsninger. Hvis f ≥ 0,9, aflæsninger er pålidelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LFR, med BODIPY 493/503 som fluorescerende sonden er en pålidelig og nem metode til at studere det dynamiske ophobning af LDs i U. maydis, uanset vækstbetingelserne. Når cellerne blev kulturperler i YPD-medium, var der en stigning i LD-indekset i den eksponentielle fase, efterfulgt af et fald i den stationære fase (figur 2A). Derimod i celler dyrket under kvælstof sult, var der en støt stigning i LD indeks i begge eksponentielle og stationære faser (figur 2B). Fordi begge kulturer var startet med det samme optiske densitet (samme antal celler), viser resultaterne LFR assay høj evne til at detektere små ændringer i lipid indhold (figur 2). Følsomheden af metoden blev underbygget af Konfokal mikroskopi: YPD-celler indeholder mange små LDs hele hele cellen, mens under kvælstof sult der var en stor produktion af store LDs, typisk 4-5 LDs pr. celler, (figur 2, lige paneler A og B, henholdsvis). Da LD indeks ikke er en absolut værdi af neutrale lipid indhold, bør en standardkurve vedrørende LD indeks med mængden af triglycerider konstrueres. Denne metode blev brugt til at studere dynamikken i TAGs syntese i S. cerevisiae20. Baseret på hver standardkurven, LFR analysen kan være anvendes til faktor sats af lipid ophobning i celler.

LD indekset kan følges i overværelse af soraphen A, en specifik hæmmer af acetyl-CoA carboxylase, et enzym, der er afgørende for syntesen af fedtsyrer, der er indeholdt i TAGs gemt i LDs25. Hæmmer blev føjet til næringssubstratet efter 2 h af vækst i mangel af en nitrogen kilde, en tilstand, hvor celler viste den højere sats af lipid ophobning (figur 2B). I overensstemmelse med tidligere betænkninger i S. cerevisiae, resulterede tilsætning af soraphen-A i fuld hæmning af LD ophobning (figur 2B, lyseblå) 20,21.

For at yderligere undersøge mobilisering af LDs i U. maydis, blev celler dyrkes under kvælstof sult for 72 h overført til YPD-medium (figur 3). LD indeks faldt efter en eksponentiel funktion. Efter 24 h nåede LD indekset lignende værdier som observeret i celler dyrkes i YPD-medium uden stress på kvælstof mangel (figur 2A). Da cellerne var i stand til at mobilisere LDs akkumuleret under kvælstof sult, tyder resultatet på en reduktion af TAGs. En lignende reaktion blev rapporteret til S. cerevisiae i studiet af fosfataser involveret i regulering af lipid metabolisme21.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af de forskellige trin i LFR. Trin af kultur betingelser er repræsentant for U. maydis gær men kan tilpasses andre mikroorganisme eller type celler. URF, enheder af Recovery fluorescens; BD, bidistilled vand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dynamics af lipid dråber ophobning i U. maydis. Gærceller var vokset til 24 h på YPD-medium, høstet og suspenderet i a fersk YPD-medium (øverste venstre panel) eller i (B) minimal medium uden en nitrogen kilde (nederste venstre panel-mørkeblå). Under kvælstof sult, blev stigningen i LD indeks hæmmet ved at tilføje 192 nM soraphen A i kultur medier efter 2 h af vækst (B, lyseblå). n = 3, data er den gennemsnitlige ± SEM. Højre panel: Konfokal mikroskopi af LDs i cellen høstet på 24 h. (A) toppanelet: YPD-celler. B bundpanelet: celler uden en nitrogen kilde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: LDs mobilisering. Gærceller var vokset til 24 h på YPD-medium, høstet og dyrket i frisk YPD i 24 timer (kontrol) eller i minimal medium uden en nitrogen kilde til 72 h, derefter overført til frisk-YPD medium og rugede for yderligere 24 h. delprøver blev trukket tilbage på det angivne gange for begge kulturer til at måle mobilisering af LDs af LFR. Data blev monteret ved en eksponentiel henfald ligning (y = A·e-kt). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LFR er en roman metode, der blev anvendt for første gang at studere lipid metabolisme i S. cerevisiae og senere det var med held gennemført i U. maydis20,21. Selv om LD indekset ikke giver absolut værdi af TAGs akkumulerede i cellerne, det giver et hurtigt indtryk af lipid indholdet af celler, og fortolkning af data er ligetil sammenlignet LD indeks fra to eller flere forsøgsbetingelser. BODIPY 493/503 er meget specifik for neutral lipider, hovedbestanddelen af LDs, og den har en smal emission spektrum at lette den samtidige påvisning af andre signaler, der kommer fra farvestoffer som Mito-tracker eller CMAC blå når celler undersøges af Konfokal mikroskopi26. Ligesom mange fluorescerende molekyler, BODIPY 493/503 er følsomme over for photobleaching ved Fluorescens mikroskopi forsøg, men denne proces kan være nedsat ved at tilføje anti photobleaching reagenser under eksponering for lys27. Sammenfattende kan BODIPY 493/503 bruges i en bred vifte af celler til at studere ophobning og mobilisering af neutrale lipider21,22,23,28,29.

For metode skal fungere ordentligt, skal et tidspunkt tages i betragtning. Da OD600 bruges til beregning af LD indeks, bør morfologi af cellerne ikke har radikale ændringer under eksperimentet. Bevarelse af de intracellulære komponenter under fiksering af celler også er et afgørende skridt, og denne bevarelse skal omfatte LDs, der er hovedformålet med denne protokol. Om fastsættelse af cellerne med et passende stof er meget vigtigt for anvendelsen af denne metode til mange typer af celler uden problemer. Her, bruges vi formaldehyd til at fastsætte strukturerne af celler; aldehyd reagerer med amino grupper af proteiner. Det er blevet rapporteret, at andre aldehyder også bevare strukturerne i en bred vifte af celler og det lader til, at der ikke er væsentlige ændringer i protein struktur24,26. En ulempe af Formaldehyd er at det inducerer lille membran skader og vacuole dannelse nær den mitokondrielle og nukleare membraner, men disse negative effekter er fælles for alle aldehyd fiksering metoder26. Organiske opløsningsmidler som methanol eller acetone bør undgås, fordi de nedbrydes LDs i cellerne. Fiksering med organiske opløsningsmidler er baseret på dehydrering og udfældning af proteiner, der kan betragtes som en negativ effekt. Anvendelse af organiske opløsningsmidler er derudover tilknyttet uspecifik farvning.

Som enhver anden teknik, kan LD indeks assay have begrænsninger når gennemført til andre systemer. Problemer i udbredelsen af BODIPY på tværs af svampe cellevæggen, afhængighed af fluorescens fedtsyre sammensætningen, lipider og proteinindhold i intracellulære lipid organer30, til hinder for sammenligning af mængden af TAGs mellem forskellige arter eller endda med de samme celler dyrkes under forskellige ernæringsmæssige betingelser. Også er store morfologiske ændringer såsom overgangen til mycelium eller flokkulering celler nogle af de problemer, der kan findes.

LD indeks assay er en høj overførselshastighed metode, der kræver kort gange og små mængder af biomasse og reaktanter. Analysen er pålidelige, og de indhentede oplysninger er nøjagtige og reproducerbare. Desuden, det giver retningslinjer for forskning på dynamikken i lipid metabolisme i medicin, og det kan blive et værktøj i bioteknologi i high throughput screening af olieholdige organisme til produktion af biobrændstoffer eller feed olier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at offentliggørelse

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo en Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autónoma de México ( UNAM), og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP og 256520-GGS). Fundação de Amparo en Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas gøre Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Vi takket være QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo for den skematiske oversigt. Vi takker Dr. Miguel Tapia Rodríguez for værdifuld hjælp i den Konfokal mikroskopi af LDs. Vi vil gerne takke Dr. Bruno Bozaquel Morais for hans banebrydende arbejde med at udvikle teknikken i S. cerevisiae som vi tilpasset U. maydis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).

Tags

Biokemi spørgsmål 134 Lipid indeks lipid dråber basidiomycete fluorescens opsving BODIPY 493/503 Ustilago maydis
Lipid indeks bestemmelse af flydende fluorescens opsving i svampe patogen <em>Ustilago Maydis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli,… More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter