Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Lipide Index bepaling door vloeibare fluorescentie herstel in de schimmel pathogeen Ustilago Maydis

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/57279
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 1
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschrijven we een protocol om te verkrijgen van de lipide druppel index (LD index) om te bestuderen van de dynamiek van triacylglycerolen in cellen gekweekt in high-throughput experimenten. De LD index bepaling is een gemakkelijke en betrouwbare methode die gebruikmaakt van BODIPY 493/503. Deze test hoeft niet dispendious lipide extractie of microscopie analyse.

Abstract

Het artikel toont hoe de uitvoering van de LD-index bepaling, die is een gevoelige microplate-test om te bepalen van de accumulatie van triacylglycerolen (TAGs) in lipide druppels (LDs). LD index wordt verkregen zonder lipide extractie. Het staat voor het meten van de LDs inhoud in high-throughput experimenten onder verschillende omstandigheden zoals de groei in de rijke of stikstof uitgeput media. Hoewel de methode werd voor het eerst tot de studie van het metabolisme van de druppel lipide in Saccharomyces cerevisiae, het met succes op de lange Ustilago maydis toegepast werdbeschreven. Interessant, en omdat LDs organellen fylogenetisch bewaard in eukaryote cellen zijn, de methode kan worden toegepast op een groot aantal cellen, uit gist aan zoogdiercellen. De LD-index is gebaseerd op de kwantitatieve analyse van vloeibare fluorescentie, herstel (LFR) van de BODIPY 493/503 blussen omstandigheden, door de toevoeging van cellen vast met formaldehyde. Kalium jodium wordt gebruikt als een fluorescentie-quencher. De verhouding tussen de fluorescentie en de optische dichtheid hellingen heet LD index. Hellingen zijn berekend op basis van de rechte lijnen verkregen wanneer BODIPY fluorescentie en optische dichtheid bij 600 nm (OD600) wordt afgezet tegen de toevoeging van de steekproef. Optimale kwaliteit komt tot uiting door correlatie coëfficiënten gelijk of boven 0.9 (r ≥ 0.9). Meerdere monsters kunnen gelijktijdig worden gelezen als het kan worden uitgevoerd in een microplate. Aangezien BODIPY 493/503 een lipofiele fluorescerende kleurstof die partities in de lipide druppels is, kan het worden gebruikt in vele soorten cellen die zich ophopen van LDs.

Introduction

Lipide druppels (LDs) zijn alomtegenwoordige intracellulaire vet organen bestaat uit een kern in neutrale lipiden, voornamelijk TAGs en plantensterolen esters (SE). De kern is omgeven door een monolayer van fosfolipiden die met eiwitten zoals perilipin en enzymen die betrokken zijn bij de synthese van neutrale lipiden, zoals de diacylglycerol acyl-transferase, acetyl-CoA carboxylase en acyl-CoA synthase1 samenwerkt. Als gevolg van het dynamische gedrag bevat de fosfolipide enkelgelaagde ook triacylglycerol lipasen die gehydrolyseerd TAGs en SE2. Afhankelijk van het celtype en organisme, opgeslagen neutrale lipiden kunnen worden gebruikt voor het genereren van energie, of synthetiseren fosfolipiden en signalering moleculen. In gist en andere schimmels, de inhoud van LDs verandert in reactie op variaties in de stikstof/koolstofverhouding in de cultuur-media, die aangeeft dat de beschikbaarheid van de verminderde stikstof de sleutel wellicht tot het verhogen van de neutrale lipide productie3,4 ,5. De productie van grote hoeveelheden van TAGs in gist heeft een potentiële gebruik in biotechnologie als bron van biobrandstoffen en in de voedingsindustrie. Sommige opgeslagen lipiden bevatten hoge verhoudingen van meervoudig onverzadigde vetzuren zoals omega 3 en omega 6, met voeding en dieet belang 6,7,8,9,10 , 11. LDs van zoogdiercellen, met inbegrip van menselijke cellen, ook TAGs en cholesterol esters daarvan bevatten. De fosfolipide enkelgelaagde interageert met de homologe zoogdieren van de eiwitten in de gist LDs beschreven, en een extra eiwit, perilipin, die afwezig is in S. cerevisiae12. Een voorgestelde rol voor de fosfolipide enkelgelaagde en de bijbehorende eiwitten is te stabiliseren van de LDS-structuur en de interactie van LDs met organellen als mitochondriën, endoplasmatisch reticulum en peroxisomen vacuolen, voornamelijk voor lipide uitwisseling 13,14. Interessant is dat bij de mens lijken LDs te worden betrokken bij aandoeningen zoals diabetes type 2, atherosclerose, steatohepatitis en coronaire hart-en vaatziekten, waarin sprake is van een toename van hun nummer 15,16,17 . Sommige soorten virussen LDs gebruiken als platformen te monteren de virionen 2,18,19.

Als gevolg van de gevolgen van de LDs in menselijke pathologieën en hun potentiële biotechnologische gebruik is de exacte experimentele bepaling van de formatie van de LDs een belangrijke taak. Dit artikel beschrijft een betrouwbare test gebaseerd op het herstel van de fluorescentie (LFR) van BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), om een relatieve waarde van de inhoud van neutrale lipiden in cellen. Met deze test is het mogelijk om te volgen de dynamiek van de accumulatie van neutrale lipiden in schimmels zoals U. maydis en S. cerevisiae, en ook in zoogdiercellen, zonder de noodzaak van lipide extractie 20. De methode werd toegepast voor de eerste keer in S. cerevisiae te identificeren van het eiwit phosphatases en kinases betrokken bij de regulering van lipide metabolisme. Dit was mogelijk zonder lipide extractie of eiwit zuivering21,22. LFR is ook gebruikt om de dynamiek van de LDS-formatie in peritoneale macrofagen23. Het gebruik van BODIPY 493/503 heeft enkele voordelen ten opzichte van andere neutrale lipide kleurstoffen Nile rood. BODIPY 493/503 is zeer specifiek voor neutrale lipiden en heeft een smalle emissiespectrum, vergemakkelijken de simultane detectie van de signalen van kleurstoffen zoals rode fluorescerende eiwit of Mito-tracker, wanneer de monsters worden geanalyseerd door confocale microscopie. Helaas, BODIPY 493/503 is gevoelig voor photobleaching, maar dit proces kan worden vermeden door het gebruik van een antiquenching-reagens tijdens blootstelling aan licht24.

Voor het uitvoeren van de bepaling van de LFR in gistcellen, ze zijn gekweekt onder de gewenste voeding voorwaarden en aliquots op verschillende tijdstippen zijn ingetrokken. Vervolgens worden cellen bevestigd met formaldehyde, die de integriteit van LDs behoudt maandenlang wanneer cellen worden opgeslagen bij 4 ° C. Andere technieken van fixatie moeten worden vermeden, vooral die met behulp van methanol of koude aceton, aangezien zij tot de afbraak van de LDs binnen de cellen24 leiden. Voor het meten van de LD-index, zijn formaldehyde-vaste cellen opgehangen in water te verkrijgen van een bepaalde concentratie. Vervolgens worden deze toegevoegd aan een oplossing met de fluorophore BODIPY 493/503 uitgeblust door KI, en wanneer de fluorophore de cel invoert en aan de LDs koppelt, er is een herstel van de fluorescentie. Gelijktijdige op de fluorescentie-meting (485 nm/510 nm), de concentratie van cellen wordt gekwantificeerd door het meten van de extinctie op 600 nm. Elk monster wordt vier keer gelezen door latere 5 µL aliquots van een formaldehyde-vaste celsuspensie goed aan hetzelfde toe te voegen. Spaties van fluorescentie en absorptie zijn vóór de toevoeging van cellen verkregen. De kwaliteit van de fluorescentie en de extinctie gegevens worden geëvalueerd aan de hand van de lineariteit van de metingen: als r < 0.9, gegevens worden verwijderd. De r-waarde is belangrijk omdat in principe de intensiteit van de fluorescentie een lineaire respons aan toenemende concentraties van de cel produceren moet. Als de cel concentratie te hoog, is de lineariteit verloren. De assay LFR biedt een snelle, eenvoudige en goedkope methode om te selecteren van het gewenste fenotype LD in high-throughput experimenten. Na het selecteren van de gewenste voorwaarden, kan de inhoud van de LD van afzonderlijke cellen worden bestudeerd door confocale microscopie, met behulp van dezelfde formaldehyde-vaste cellen gekleurd met BODIPY, een afbeelding van de LDs in de cel. Hun TAGs en SE inhoud kunnen nu verder worden geanalyseerd door Dunnelaagchromatografie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van Buffers en oplossingen

  1. Ter voorbereiding van 1 L fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7), Los 8 g NaCl, 0.2 g van KCl, 1,44 g nb2HPO4, 0,24 g van KH2PO4 in 800 mL distillated water. Breng de pH op 7.0 met HCl, en voeg vervolgens water voor een eindvolume van 1 L. PBS kan worden gemaakt als een 10 x stockoplossing en bewaard bij kamertemperatuur.
  2. Ter voorbereiding van 10 mL van de vaststelling van de oplossing, voeg 1 mL van 37% formaldehyde 9 ml PBS te bereiken een eindconcentratie van 3,7%. Bereid deze oplossing vlak voor gebruik.
    Let op: Gebruik handschoenen om de formaldehyde-oplossing.
  3. Ter voorbereiding van het blussen-oplossing (500 mM), Los 8.3 g KI in 100 mL gedestilleerd water. Deze oplossing vóór gebruik voor te bereiden en op te slaan bij kamertemperatuur.
  4. Los 10 mg van BODIPY 493/503 in 3,8 mL dimethylsulfoxide (DMSO) ter voorbereiding BODIPY 10 mM stockoplossing. 100 µL aliquots houden in het donker bij 70 ° C.
  5. Voeg 1 µL van 10 mM BODIPY 493/503 tot 2 mL 500 mM blussen oplossing ter voorbereiding BODIPY 5 µM-blussen oplossing. Voor de LFR assay is een eindconcentratie van 5 µM van BODIPY vereist.
  6. Ter voorbereiding van de minerale oplossing, Voeg 0.06 g H3BO3, 0,14 MnCl2-4 H2O, 0.4 g van ZnCl2, 0,04 g Na,2g MoO4-2 H2O, 0,1 g van FeCl3-6 H2O en 0,4 g CuSO 4-5 H2O tot 1 L gedestilleerd water.
  7. Voeg ter voorbereiding van de zoutoplossing, 16 g KH2PO4, 4 g Na,2dus4, 8 g van KCl, 2 g van MgSO4, 1 g CaCl2en 8 mL van minerale oplossing tot 1 liter gedistilleerd water.
  8. Ter voorbereiding van de minimaal medium zonder een stikstofbron voor U. maydis FB2 (a2b2), 10 g glucose en 62,5 mL zoutoplossing toevoegen aan 1 liter gedistilleerd water, volgens Holliday, et al.. 31. Breng de pH op 7.0 afzien van 100 mL van de media in maatkolven van 250 mL en ze te steriliseren. Autoclaaf gedurende 20 minuten op 15 psi (1.05 kg/cm2) op vloeibare cyclus of filter steriliseren.
  9. Ter voorbereiding van het Gist-pepton dextrose medium (YPD), voeg 5 g gist extract, 2,5 g pepton, en 5 g glucose aan 1 liter gedistilleerd water. Afzien van 100 mL van de oplossing in maatkolven van 250 mL en ze te steriliseren. Autoclaaf gedurende 20 minuten op 15 psi (1.05 kg/cm2) op vloeibare cyclus of filter steriliseren.

2. cultuur voorwaarde en fixatie van de cel

Opmerking: Behoud van de structuur van de LDs door de cellen zo spoedig mogelijk op te lossen. De fixatie kan worden gedaan in microcentrifuge buizen. Vaste cellen kunnen bij 4 ° C gedurende maximaal één maand worden bewaard als uitdroging wordt vermeden waardoor een dun laagje water.

  1. Groeien U. maydis cellen onder de kweekomstandigheden relevant voor de studie. De cultuur beginnen met een eerste OD600 van 0,05 (1,15 × 10-6 cellen / mL). Incubeer de cellen bij 28 ° C, 180 rpm gedurende 24 uur. Een OD600 1 correspondeert met 2.3 × 107 cellen / mL.
  2. Op de geselecteerde tijd, trekken een aliquoot deel van de cellen. Trekken voor U. maydis, 5 mL elke 2 h tijdens de eerste 8 h. Na 8 uur van groei zijn hoeveelheden van 2 mL voldoende.
  3. Meten van de extinctie op 600 nm van elk aliquot.
  4. Centrifugeer de celsuspensie bij 14.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C met behulp van een tafelblad centrifuge. Verwijder het supernatant.
  5. Opschorten van de pellet van de cellen in 1 mL PBS-formaldehyde 3,7% buffer. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Na de incubatie, centrifugeer de celsuspensie bij 14.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  7. Wassen van de cellen pellet tweemaal met een vergelijkbare hoeveelheid gedestilleerd water (1 mL). Centrifugeer de celsuspensie bij 14.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. Verwijder het supernatant na elke stap wassen.
  8. Aanpassen van de cel pellet op 5 OD600 (1.15 x 108 cellen / mL) met gedestilleerd water (vergelijking 1).
    Equation 1    Vergelijking 1.
  9. Houd het monster bij 4 ° C tot en met het gebruik ervan.

3. vloeibare Fluorescence Recovery Assay (LFR)

  1. Zet de spectrofotometer en de Skanlt-software niet openen. Klik op Nieuw sessieen kies START en vervolgens Varioskan Lux. Selecteer PROTOCOL van de sessie-boom, voert u de instellingen voor de fluorescentie golflengten (excitatie 485 nm/emissie 510 nm; optische dichtheid 600 nm) en kiest u automatische fotomultiplicator winst. Voor de bandbreedte van de excitatie, selecteer 12 nm. In de optica, Selecteer boven (excitatie van het monster is vanaf de bovenkant van de put).
  2. Voer een zachte en voortdurende agitatie (300 rpm). Selecteer Plaat RUN OUTen Onderbreken totdat de actie van de gebruiker (keer gebruikt voor de toevoeging van het monster aan de putjes). Herhaal het protocol vijf keer. Klik op Opslaan en schrijf een naam voor de sessie op het Veld naam de sessie. Het protocol is nu klaar voor de analyses van de monsters.
  3. Voeg toe 200 µL van het BODIPY 5 µM - uitgeblust oplossing aan elk putje van een 96 goed zwart-clear bodemplaat.
  4. Plaats de plaat binnen de spectrofotometer kamer en incubeer 5 min bij 30 ° C. Vanaf dit punt, de plaat boven licht zoveel mogelijk te beschermen.
  5. Klik op de knop START en lees de fluorescentie (excitatie 485/emissie 510) en de OD600 overeenkomt met de blanks.
  6. Voeg 5 µL van de formaldehyde-vaste celsuspensie de putjes tijdens de pauze tijd. Meng de monsters zorgvuldig met de pipet. Zet de plaat binnen de spectrofotometer en klik op Doorgaan. De monsters worden vervolgens verwerkt volgens het protocol ontworpen boven.
  7. Herhaal drie opeenvolgende toevoegingen van 5 µL celsuspensie. Zorg ervoor dat de cellen niet doen neerslaan. (Figuur 1).

4. de berekeningen van de LD-Index

  1. Voor elk monster in de microplate, uitzetten van fluorescentie en extinctie tegen het volume van elke opeenvolgende toevoeging (5 punten met inbegrip van de blanco) in een grafiek. In deze studie werd door Microsoft Excel software te gebruiken voor de berekeningen. De gegevens uitzetten, voert u het volume, fluorescentie en absorptie-gegevens in de eerste, tweede en derde kolom van het gegevensblad, respectievelijk. Selecteer vervolgens de hele gegevens met de cursor, klikt u op invoegen en selecteer (SPREIDINGS).
  2. Selecteert u de punten voor elke regel in de grafiek en voeg de respectieve TRENDLIJN met het selectievakje Vergelijking weergeven is geselecteerd. Noteer de waarden van de hellingen van de twee rechte lijnen, volgens vergelijking 2:
    Equation 2    Vergelijking 2
    Waarin y = fluorescentie- of optische dichtheid, x = hoeveelheid monster (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = helling van de fluorescentie of optische dichtheid lijn, en b = y-snijpunt.
  3. Verdeel de helling van de fluorescentie-lijn door de helling van de lijn van de optische dichtheid te krijgen van de LD-index, vergelijking 3.
    Equation 3    Vergelijking 3
    De LD-index correspondeert met het quotiënt van fluorescentie en optische dichtheid hellingen.

5. data kwaliteitsanalyse

  1. Berekent de correlatiecoëfficiënt van elke rechte lijn: Klik op de Functie WIZARD (fx) en kies correlatie. Als r < 0.9, negeren van de gegevens en herhaal de lezingen. Als r ≥ 0.9, lezingen betrouwbaar zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LFR, met BODIPY 493/503 als de fluorescente sonde is een betrouwbare en eenvoudige methode om te studeren de dynamische accumulatie van LDs in U. maydis, ongeacht de voorwaarden voor groei. Toen cellen werden gekweekt in YPD-medium, was er een toename van de LD-index tijdens de exponentiële fase, gevolgd door een daling in de stationaire fase (figuur 2A). Daarentegen in de cellen onder stikstof honger geteeld, was er een gestage toename van de LD-index in beide de exponentiële en stationaire fasen (figuur 2B). Omdat beide culturen waren begonnen met de dezelfde optische dichtheid (vergelijkbaar aantal cellen), blijkt uit de resultaten de hoge capaciteit van de LFR assay voor het detecteren van kleine veranderingen in het vetgehalte (Figuur 2). De gevoeligheid van de methode werd bevestigd door confocale microscopie: YPD-cellen bevatten vele kleine LDs gedurende de hele cel, terwijl onder stikstof honger er een belangrijke productie van grote LDs meestal 4-5 LDs per cellen, (Figuur 2 was, panelen A en B, recht respectievelijk). Aangezien de LD-index niet een absolute waarde van het neutrale vetgehalte is, moet een standaard curve betreffende de LD-index met het bedrag van de triacylglycerolen worden geconstrueerd. Deze aanpak werd gebruikt voor het bestuderen van de dynamiek van TAGs synthese in S. cerevisiae20. Gebaseerd op elke standaard curve, de LFR bepaling kan worden gebruikt om te bepalen het tarief van lipide accumulatie in cellen.

De LD-index kan worden gevolgd in de aanwezigheid van soraphen A, een specifieke inhibitor van het acetyl-CoA carboxylase, een enzym dat essentieel is voor de synthese van vetzuren die zijn vervat in de TAGs opgeslagen in LDS-25. De Inhibitor van de omwenteling werd toegevoegd aan het kweekmedium na 2U van groei in het ontbreken van een stikstofbron, een aandoening waarbij cellen het hogere tarief van lipide accumulatie (figuur 2B toonde). Volgens eerdere rapporten in S. cerevisiae, resulteerde de toevoeging van soraphen-A in de volledige remming van LD accumulatie (figuur 2B, lichtblauw) 20,21.

Verder onderzoek doen naar de mobilisatie van LDs in U. maydis, werden cellen onder stikstof honger voor 72 h geteeld overgedragen aan YPD-medium (Figuur 3). LD-index daalde na een exponentiële functie. De LD-index bereikt na 24 h, gelijkaardige waarden die waargenomen in cellen gekweekt in YPD-medium zonder de stress van stikstof afwezigheid (figuur 2A). Aangezien de cellen waren in staat om het mobiliseren van de LDs verzameld gedurende stikstof honger, suggereert het resultaat een afname van de labels wordt inhoud. Een soortgelijke reactie werd gemeld voor S. cerevisiae tijdens de studie van phosphatases die betrokken zijn bij de regulering van lipide metabolisme21.

Figure 1
Figuur 1: schematische weergave van de stappen betrokken bij het LFR. De stappen van de kweekomstandigheden zijn representatief voor U. maydis gist maar kunnen worden aangepast aan andere micro-organismen of soort cellen. URF, eenheden van herstel fluorescentie; BD, bidistilled water. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: dynamiek van lipide druppels accumulatie in U. maydis. Gistcellen waren gegroeid gedurende 24 uur in YPD-medium, geoogst en geschorst in (A) verse YPD-medium (Top linker paneel) of in (B) minimaal medium zonder een stikstofbron (onderkant linker paneel-donker blauw). Onder stikstof honger, was de stijging van de index van de LD geremd door toevoeging van 192 nM soraphen A in de media cultuur na 2U van groei (B, lichtblauw). n = 3, gegevens zijn de gemiddelde ± SEM. Rechter paneel: confocale microscopie van LDs in cel geoogst 24 h. (A) bovenste paneel: YPD-cellen. (B) onderste paneel: cellen zonder een stikstofbron. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: LDs mobilisatie. Gistcellen waren gegroeid gedurende 24 uur in YPD-medium, geoogst en verbouwd in frisse YPD gedurende 24 uur (control) of in minimaal middellange zonder een stikstofbron voor 72 uur, vervolgens overgebracht naar de vers-YPD medium en bebroede voor extra 24 h. Aliquots worden ingetrokken op de aangegeven tijden voor beide culturen om te meten de mobilisatie van LDs door LFR. Gegevens was uitgerust met een exponentiële afname vergelijking (y = A·e-kt). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LFR is een nieuwe methode die werd toegepast voor de eerste keer om te studeren het lipide metabolisme in S. cerevisiae en later het werd met succes geïmplementeerd in U. maydis20,21. Hoewel de LD-index geen absolute waarde van de labels in cellen opgebouwde geeft, het biedt een snelle idee van het vetgehalte van cellen en de interpretatie van de gegevens is eenvoudig wanneer LD index van twee of meer experimentele omstandigheden worden vergeleken. BODIPY 493/503 is zeer specifiek voor neutrale lipiden, de belangrijkste component van de LDs, en het heeft een smalle emissiespectrum vergemakkelijken de simultane detectie van andere signalen van kleurstoffen zoals Mito-tracker of CMAC blauw wanneer cellen worden bestudeerd door confocale microscopie26. Net als vele fluorescerende moleculen, BODIPY 493/503 is gevoelig voor photobleaching tijdens fluorescentie microscopie experimenten, maar dit proces kan worden verlaagd door anti photobleaching reagentia tijdens de blootstelling aan licht27toe te voegen. Kortom, kan BODIPY 493/503 worden gebruikt in een breed bereik van cellen te bestuderen van de accumulatie en de mobilisatie van neutrale lipiden21,22,23,28,29.

Voor de methode te laten functioneren, moet rekening worden gehouden met sommige punt. Aangezien de OD600 wordt gebruikt voor de berekening van de LD-index, moet de morfologie van de cellen niet radicale veranderingen tijdens het experiment. Het behoud van de intracellulaire componenten tijdens de fixatie van de cellen is tevens een belangrijke stap en deze bewaring dient de LDs, die de belangrijkste doelstelling van dit protocol. Vaststelling van de cellen met een passende verbinding is zeer belangrijk voor de toepassing van deze methode voor veel soorten cellen zonder enig probleem. Hier, we formaldehyde gebruikt om te herstellen van de structuren van de cellen; de aldehyde reageert met de amino groepen van eiwitten. Men heeft gerapporteerd dat andere aldehyden ook de structuren van een breed scala van cellen behouden en het lijkt erop dat er zich niet significante veranderingen in de eiwitten structuur24,26. Een nadeel van formaldehyde is dat het kleine membraan schade induceert en vacuole vorming in de buurt van de mitochondriale en nucleaire membranen, maar deze negatieve effecten gelden voor alle aldehyde fixatie methoden26. Organische oplosmiddelen zoals methanol of aceton moeten worden vermeden omdat ze de LDs in de cellen degraderen. Fixatie met organische oplosmiddelen is gebaseerd op de uitdroging en precipitatie van eiwitten, die kan worden beschouwd als een negatief effect. Bovendien, wordt het gebruik van organische oplosmiddelen geassocieerd met niet-specifieke kleuring.

Als een andere techniek wellicht de LD index bepaling beperkingen wanneer uitgevoerd naar andere systemen. Problemen bij de verspreiding van BODIPY over de schimmel celwand, de afhankelijkheid van de fluorescentie van vetzuur samenstelling, het type van lipiden en het gehalte aan andere melkeiwitten binnen intracellulaire lipide organen30, beletsel voor de vergelijking van de hoeveelheid TAGs tussen verschillende soorten of zelfs met dezelfde cellen gegroeid onder verschillende omstandigheden van de voeding. Grote morfologische veranderingen zoals de overgang naar het mycelium of flocculatie van cellen zijn ook enkele van de problemen die gevonden kunnen worden.

LD index assay is een hoog-productie-methode die korte tijd en kleine hoeveelheden biomassa en reactanten vereist. De test is betrouwbaar, en de verkregen gegevens nauwkeurig en reproduceerbaar. Daarnaast bevat het richtlijnen voor het onderzoek op de dynamiek van lipiden-metabolisme in de geneeskunde, en het kan een hulpmiddel in de biotechnologie voor de high-throughput screening van oliehoudende organisme voor de productie van biobrandstoffen worden of feed oliën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te openbaarmaking

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo een Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(van de Universidad Nacional Autónoma de México UNAM), en Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP en 256520-GGS). Fundação de Amparo een Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-v doen Nosso Estado: E 26/103.353/2011). We dankzij QFB. Oscar Iván Club Luqueño Bocardo voor het schematisch overzicht. Wij bedanken Dr. Miguel Tapia Rodríguez voor de waardevolle hulp bij de confocal microscopie van LDs. Wij willen Dr. Bruno Bozaquel Morais bedanken voor zijn pionierswerk in de ontwikkeling van de techniek in S. cerevisiae , dat wij voor U. maydisaangepast.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).

Tags

Biochemie kwestie 134 lipide index lipide druppels lange fluorescentie recovery BODIPY 493/503 Ustilago maydis
Lipide Index bepaling door vloeibare fluorescentie herstel in de schimmel pathogeen <em>Ustilago Maydis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli,… More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter