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Biochemistry

Lipid-Index Bestimmung von flüssigen Fluoreszenz Erholung der pilzliche Erreger Ustilago Maydis

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um der Lipid-Tröpfchen (LD Index) erreichen, um die Dynamik der Triacylglyzerole in Zellen im Hochdurchsatz-Experimente zu studieren. Die LD-Index-Assay ist eine einfache und zuverlässige Methode, die BODIPY 493/503 verwendet. Dieser Assay benötigt keine Dispendious Lipid-Extraktion oder Mikroskopie-Analyse.

Abstract

Der Artikel zeigt, wie die LD-Index-Assay, implementieren, die eine sensible Mikrotestplatte Assay zu bestimmen, die Anhäufung von Triacylglyzerole (TAGs) in Lipid-Tröpfchen (LDs) ist. LD-Index wird ohne Lipid-Extraktion gewonnen. Es ermöglicht die Messung des LDs-Inhalts im Hochdurchsatz-Experimente unter verschiedenen Bedingungen wie Wachstum im Reich oder Stickstoff aufgebraucht Medien. Wenn auch die Methode zum ersten Mal den Fettstoffwechsel von Tröpfchen in Saccharomyces Cerevisiae, studieren beschrieben wurde war es erfolgreich auf Basidiomycete Ustilago Maydisangewendet. Interessant ist, und weil LDs Zellorganellen in eukaryotischen Zellen phylogenetisch konserviert sind, kann die Methode auf eine Vielzahl von Zellen, von Hefe für Säugerzellen angewendet werden. Der LD-Index basiert auf der flüssigen Fluoreszenz Erholung Assay (LFR) von BODIPY 493/503 abschrecken Bedingungen durch die Zugabe von Zellen mit Formaldehyd. fixiert Kalium-Jod dient als ein Fluoreszenz-Durstlöscher. Das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz und die optische Dichte Hänge ist LD Index benannt. Neigungen werden berechnet von den geraden Linien erreicht, wenn BODIPY Fluoreszenz und Extinktion bei 600 nm (OD600) werden gegen Probe zusätzlich dargestellt. Optimale Datenqualität spiegelt sich durch Korrelationskoeffizienten gleich oder über 0,9 (R ≥ 0,9). Mehrere Proben können gleichzeitig gelesen werden, wie es in einer Mikrotestplatte umgesetzt werden kann. Da BODIPY 493/503 eine lipophile Leuchtstoff färben die Partitionen in der Lipid-Tröpfchen ist, kann es in vielen Arten von Zellen verwendet werden, die Kirche Jesu Christi zu sammeln.

Introduction

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Lipid-Tröpfchen (LDs) sind allgegenwärtige intrazellulären Fett Körper, bestehend aus einem Kern von neutralen Lipiden, vor allem TAGs und Sterol Ester (SE). Der Kern ist umgeben von einer Monoschicht von Phospholipiden, die mit Proteinen wie Perilipin und Enzyme beteiligt an der Synthese von neutralen Lipiden, wie Diacylglycerol Acyl-Transferase, Acetyl-CoA Carboxylase und Acyl-CoA-Synthase-1interagiert. Durch sein dynamisches Verhalten enthält die Phospholipid-Monolayer auch Triacylglycerol Lipasen, die TAGs und SE2Hydrolyseneigung. Je nach Zelltyp und Organismus gespeicherten neutralere Lipiden können verwendet werden, um Energie zu erzeugen, oder synthetisieren Phospholipide und Signalmoleküle. In Hefen und anderen Pilzen ändert den Inhalt des LDs in Reaktion auf eine sich ändernde Stickstoff/Kohlenstoff-Verhältnis in Kulturmedien, darauf hinweist, dass verminderte Stickstoffverfügbarkeit möglicherweise der Schlüssel zu neutral Lipid Produktion3,4 zu erhöhen ,5. Die Produktion von hohen Mengen von TAGs in der Hefe hat eine mögliche Verwendung in der Biotechnologie als Quelle von Biokraftstoffen und in der Lebensmittelindustrie. Einige gespeicherte Lipide enthalten hohe Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Omega-3 und Omega-6, mit Ernährungs- und diätetische Bedeutung 6,7,8,9,10 , 11. LDs von Säugerzellen, einschließlich der menschlichen Zellen enthalten auch TAGs und Cholesterin-Ester. Die Phospholipid-Monolayer interagiert mit den Säugetieren homologe Proteine, die in der Hefe LDs beschrieben und mit einem zusätzlichen Protein, Perilipin, der abwesend ist in S. Cerevisiae12. Eine vorgeschlagene Rolle für die Phospholipid-Monolage und seiner damit verbundenen Proteine, die LDs-Struktur zu stabilisieren und damit die Interaktion von LDs mit Organellen als endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Peroxisomen und Vakuolen, vor allem für Lipid Austausch ist 13,14. Interessanterweise scheinen beim Menschen, LDs Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, Arteriosklerose, Steatohepatitis und koronare Herzkrankheit, in dem gibt es eine Zunahme der Zahl 15,16,17 beteiligt sein . Einige Arten von Viren nutzen LDs als Plattformen zusammenzubauen Virionen 2,18,19.

Aufgrund der Auswirkungen der lokalen Entwicklungsstrategie in menschliche Pathologien und deren biotechnologische Einsatzmöglichkeit ist die genaue experimentelle Bestimmung der LDs-Bildung eine wichtige Aufgabe. Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige Assays basierend auf die Erholung der Fluoreszenz (LFR) von BODIPY 493/503 (4, 4-Difluoro-1, 3, 5, 7, 8-Pentamethyl-4-Bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacene), um einen relativen Wert des Inhalts der neutrale Lipide in den Zellen zu bekommen. Mit diesem Test ist es möglich, die Dynamik der Anhäufung von neutralen Lipiden in Pilzen wie U. Maydis und S. Cerevisiae, und auch in Säugetierzellen, ohne die Notwendigkeit von Lipid-Extraktion 20. folgen Die Methode angewendet wurde, zum ersten Mal in S. Cerevisiae zu identifizieren, die Protein-Phosphatasen und Kinasen beteiligt die Regulierung des Fettstoffwechsels. Dies war möglich ohne Lipid-Extraktion oder Protein Reinigung21,22. LFR wurde auch verwendet, um die Dynamik der LDs-Formation im peritonealen Makrophagen23zu etablieren. Die Verwendung von BODIPY 493/503 hat einige Vorteile gegenüber anderen neutral Lipid-Farbstoffe als Nil rot. BODIPY 493/503 ist hochspezifisch für neutrale Lipide und hat einen schmalen Emissionsspektrum erleichtern die simultane Detektion der Signale von Farbstoffen wie rot fluoreszierende Protein oder Mito-Tracker, wenn die Proben durch konfokale Mikroskopie analysiert werden. Leider BODIPY 493/503 ist empfindlich gegenüber Immunofluoreszenz, aber dieser Prozess kann mithilfe einer antiquenching Reagenz während der Exposition gegenüber Licht24vermieden werden.

Zur Durchführung der LFR Assay in Hefezellen, sie sind unter den gewünschten Ernährungs-Bedingungen kultiviert und Aliquote sind zu unterschiedlichen Zeitpunkten zurückgezogen. Als nächstes werden Zellen mit Formaldehyd, fixiert, die die Integrität des LDs monatelang bewahrt wenn Zellen bei 4 ° c gelagert werden Ndere Fixierung sollte vermieden werden, vor allem diejenigen, die mit Methanol oder kaltem Aceton, da sie zum Abbau der LDs innerhalb der Zellen24führen. Um den LD-Index zu messen, sind Formaldehyd-feste Zellen im Wasser zu einer definierten Konzentration ausgesetzt. Dann werden sie zu einer Lösung mit der Fluorophor BODIPY 493/503 abgeschreckt durch KI hinzugefügt, und wenn der Fluorophor die Zelle betritt und die LDs ordnet, gibt es eine Erholung der seine Fluoreszenz. Begleitende der Fluoreszenz-Messung (485 nm/510 nm), die Konzentration der Zellen wird quantifiziert durch die Messung der optischen Dichte bei 600 nm. Jede Probe wird viermal gelesen, indem nachfolgende 5 µL Aliquots Formaldehyd fixiert Zellsuspension zu gleich gut. Rohlinge von Fluoreszenz und Absorption sind vor der Zugabe von Zellen erworben. Die Qualität der Fluoreszenz und die Extinktion-Daten werden durch die Bestimmung der Linearität der Messungen ausgewertet: Wenn R < 0.9, Daten werden verworfen. Der R-Wert ist wichtig, weil im Grunde die Intensität der Fluoreszenz eine lineare Reaktion auf steigenden Zelle Konzentrationen produzieren sollte. Wenn die Zellkonzentration zu hoch ist, ist die Linearität verloren. Der LFR-Test bietet eine schnelle, einfache und wirtschaftliche Methode, um wählen die gewünschte LD-Phänotyp im Hochdurchsatz-Experimente. Nach der Auswahl der gewünschten Bedingungen, kann der LD-Inhalt der einzelnen Zellen durch konfokale Mikroskopie, Verwendung der gleichen Formaldehyd-feste Zellen befleckt mit BODIPY, bietet ein Bild von der Kirche Jesu Christi in der Zelle untersucht werden. Ihre TAGs und SE Inhalte können jetzt weiter durch Dünnschichtchromatographie analysiert werden.

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Protocol

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1. Vorbereitung der Puffer und Lösungen

  1. Zur Vorbereitung von 1 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7), 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 in 800 mL distillated Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit HCl, und fügen Sie Wasser für ein Endvolumen von 1 L. PBS als ein 10 x-Stammlösung und bei Raumtemperatur gelagert werden kann.
  2. Fügen Sie 1 mL 37 % Formaldehyd um 10 mL der Lösung Befestigung vorzubereiten hinzu, 9 mL PBS, eine Endkonzentration von 3,7 % zu erreichen. Diese Lösung kurz vor dem Einsatz vorzubereiten.
    Achtung: Benutzen Sie Handschuhe, um die Formaldehyd-Lösung zu behandeln.
  3. Zur Vorbereitung der abschrecken-Lösung (500 mM) lösen Sie 8,3 g Ki in 100 mL destilliertem Wasser. Diese Lösung vor Gebrauch zubereiten und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
  4. BODIPY 10 mM Stammlösung vorbereiten, lösen Sie 10 mg von BODIPY 493/503 in 3,8 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Halten Sie 100 µL-Aliquots in der Dunkelheit bei-70 ° C.
  5. Fügen Sie zur Vorbereitung BODIPY 5 µM-abschrecken-Lösung 1 µL 10 mM BODIPY 493/503 bis 2 mL 500 mM abschrecken Lösung. Für die LFR-Assay ist eine Endkonzentration von 5 µM BODIPY erforderlich.
  6. Zur Vorbereitung der Mineralien-Lösung hinzufügen 0,06 g H3BO3, 0,14 g MnCl2-4 H2O, 0,4 g ZnCl2, 0,04 g Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g FeCl3-6 H2O und 0,4 g CuSO 4-5 H2O, 1 L destilliertes Wasser.
  7. Zur Vorbereitung der Salzlösung zugeben Sie 16 g KH2PO4, 4 g Na2SO4, 8 g KCl 2 g MgSO4, 1 g CaCl2und 8 mL Mineral-Lösung zu 1 L Wasser destilliertem.
  8. Zur Vorbereitung der minimalen Medium ohne Stickstoffquelle für U. Maydis FB2 (a2b2), 1 L destilliertes Wasser, 10 g Glukose und 62,5 mL Kochsalzlösung hinzufügen, nach Holliday, Et Al. 31. sterilisieren sie den pH-Wert auf 7,0 einstellen und dann 100 mL der Medien in 250 mL Flaschen zu verzichten. Autoklaven für 20 min bei 15 Psi (1,05 kg/cm2) auf flüssigen Zyklus oder Filter zu sterilisieren.
  9. Um die Hefe Pepton Traubenzucker Medium (YPD) vorzubereiten, fügen Sie 5 g Hefe-Extrakt, 2,5 g Pepton, und 5 g Glukose zu 1 L destilliertes Wasser hinzu. 100 mL der Lösung in 250 mL Flaschen zu verzichten und sie zu sterilisieren. Autoklaven für 20 min bei 15 Psi (1,05 kg/cm2) auf flüssigen Zyklus oder Filter zu sterilisieren.

(2) Kultur Zustand und Zelle Fixierung

Hinweis: Bewahren Sie die Struktur der lokalen Entwicklungsstrategie durch die Fixierung der Zellen so bald wie möglich. Die Fixierung erfolgt in Mikrozentrifugenröhrchen. Fixe Zellen können bis zu einen Monat lang bei 4 ° C gehalten werden, wenn Austrocknung vermieden wird, so dass eine dünne Schicht des Wassers.

  1. Wachsen Sie U. Maydis Zellen unter Kulturbedingungen für das Studium relevant. Starten Sie die Kultur mit einer anfänglichen OD600 von 0,05 (1,15 × 106 Zellen / mL). Inkubation der Zellen bei 28 ° C, 180 u/min für 24 h. Ein OD600 von 1 entspricht 2,3 × 107 Zellen / mL.
  2. Bei den ausgewählten Zeiten zurückziehen ein Aliquot der Zellen. Zurückziehen Sie für U. Maydis 5 mL alle 2 h in den ersten 8 h. Nach 8 h des Wachstums Aliquote von 2 mL genügen.
  3. Messung die optische Dichte bei 600 nm jedes aliquoten.
  4. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 14.000 x g für 1 min bei 4 ° C mit einer Tischplatte Zentrifuge. Verwerfen Sie den überstand.
  5. Das Pellet der Zellen in 1 mL PBS-Formaldehyd 3,7 % Puffer auszusetzen. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur.
  6. Nach der Inkubation Zentrifugieren der Zellsuspension bei 14.000 x g für 1 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
  7. Waschen Sie die Zellen Pellet zweimal mit einem ähnlichen Volumen von destilliertem Wasser (1 mL). Zentrifugieren der Zellsuspension bei 14.000 x g für 1 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Waschschritt.
  8. Passen Sie die Zelle Pellet bis 5 OD600 (1,15 x 108 Zellen / mL) mit destilliertem Wasser (Gleichung 1).
    Equation 1    Gleichung 1.
  9. Halten Sie die Probe bei 4 ° C, bis seine Verwendung.

3. flüssige Fluoreszenz-Recovery-Assay (LFR)

  1. Schalten Sie das Spektrophotometer und öffnen Sie die Skanlt-Software. Klicken Sie auf NEW SESSION, und wählen Sie START und dann Varioskan Lux. Wählen Sie Protokoll aus der Sitzung Struktur, geben Sie die Einstellungen für die Fluoreszenz-Wellenlängen (Erregung 485 nm/Emission 510 nm; optische Dichte 600 nm) und automatische Photomultiplier Gain. Bei der Anregung Bandbreite wählen Sie 12 nm. Wählen Sie in der Optik, oben (Anregung der Stichprobe ist von der Spitze des Brunnens).
  2. Geben Sie eine sanfte und ständige Unruhe (300 u/min). Wählen Sie Platte laufen herausund PAUSE bis die BENUTZERAKTION (Zeit für die Zugabe der Probe in die Vertiefungen). Wiederholen Sie das Protokoll fünf Mal. Klicken Sie auf Speichern , und geben Sie einen Namen für die Sitzung auf dem Feld "NAME" SESSION. Das Protokoll ist jetzt bereit für die Proben-Analysen.
  3. Fügen Sie 200 µL BODIPY 5 µM - Lösung in jede Vertiefung eine 96 gut schwarz-Clear Bodenplatte abgeschreckt.
  4. Die Platte im Inneren der Kammer Spektralphotometer und inkubieren Sie 5 min bei 30 ° C. Schützen Sie ab diesem Zeitpunkt die Platte aus Licht so weit wie möglich.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche " START " und lesen Sie die Fluoreszenz (Erregung 485/Emission 510) und die OD600 entspricht die Rohlinge.
  6. Fügen Sie 5 µL Zellsuspension Formaldehyd fixiert in den Vertiefungen während der Pausenzeit. Vermengen Sie die Proben mit der Pipette vorsichtig. Setzen Sie die Platte im Inneren das Spektrophotometer und klicken Sie auf weiter. Dann werden die Proben nach dem Protokoll entwickelt, über verarbeitet.
  7. Wiederholen Sie drei aufeinander folgende Ergänzungen von 5 µL Zellsuspension. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht überstürzen zu tun. (Abbildung 1).

4. Berechnung des Indexes LD

  1. Für jede Probe in die Mikrotestplatte Grundstück ein Diagramm der Fluoreszenz und Extinktion gegen die Lautstärke jeder aufeinanderfolgenden Zugabe (5 Punkte einschließlich der Leerzeichen). Verwenden Sie in dieser Studie Microsoft Excel Software für die Berechnungen. Plot-Daten, geben Volumen, Fluoreszenz und Extinktion Daten in der ersten, zweiten und dritten Spalte des Datenblatts, beziehungsweise. Wählen Sie dann die ganzen Daten mit dem Cursor, klicken Sie auf einfügen und wählen Sie (XY) streuen.
  2. Wählen Sie die Punkte für jede Linie im Diagramm, und fügen Sie die jeweiligen TRENDLINIE mit Feld Zeigen Gleichung ausgewählt. Notieren Sie die Werte von den Hängen des die zwei geraden Linien nach Gleichung 2:
    Equation 2    Gleichung 2
    Wo y = Fluoreszenz oder optische Dichte, X = Volumen der Probe (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = Steigung der Fluoreszenz oder optische Dichte Linie und b = y-Achsenabschnitt.
  3. Teilen Sie die Steigung der Fluoreszenz-Linie durch die Steigung der Linie optische Dichte den LD-Index, Gleichung 3 abgerufen.
    Equation 3    Gleichung 3
    Der LD-Index entspricht dem Quotienten der Fluoreszenz und optische Dichte Pisten.

5. Qualität der Datenanalyse

  1. Der Korrelationskoeffizient jeder geraden zu berechnen: Klicken Sie auf den Funktions-Assistenten (fx) und wählen Sie CORREL. Wenn r < 0.9, die Daten zu verwerfen und wiederholen Sie die Messwerte. Wenn r ≥ 0,9, Lesungen zuverlässig sind.

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Representative Results

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LFR, mit BODIPY 493/503 als fluoreszierende Sonde ist eine zuverlässige und einfache Methode, der dynamische Ansammlung von LDs in U. Maydis, unabhängig davon die Wachstumsbedingungen zu studieren. Wenn Zellen in YPD-Medium kultiviert wurden, gab es eine Zunahme der LD-Index in der exponentiellen Phase, gefolgt von einem Rückgang in der stationären Phase (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu gab es in den Zellen unter Stickstoff Hunger gewachsen, eine stetige Zunahme der LD-Index in die exponentielle und stationären Phasen (Abb. 2 b). Da beide Kulturen mit die gleiche optische Dichte (ähnliche Anzahl von Zellen) gestartet wurden, zeigen die Ergebnisse die hohe Kapazität des LFR Assays, kleine Änderungen in der Fettgehalt (Abbildung 2) zu erkennen. Die Empfindlichkeit der Methode wurde durch konfokale Mikroskopie bestätigt: YPD-Zellen enthalten viele kleine LDs während der ganzen Zelle, während unter Stickstoff Hunger eine wichtige Produktion von großen Kirche Jesu Christi, in der Regel 4-5 LDs pro Zellen (Abbildung 2 war, gerade Platten A und B, beziehungsweise). Da der LD-Index keinen absoluten Wert des neutralen Lipidgehalts ist, sollte eine Standardkurve im Zusammenhang mit der LD-Index mit der Menge der Triacylglyzerole konstruiert werden. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Dynamik des TAGs Synthese in S. Cerevisiae20zu studieren. Basierend auf jedem standard-Kurve, die LFR-Assay kann werden verwendet, um bestimmte die Rate der Lipid-Akkumulation in den Zellen.

Der LD-Index kann in Gegenwart von Soraphen A, einen spezifischen Inhibitor des Acetyl-CoA Carboxylase, ein Enzym, das verfolgt werden, die unerlässlich für die Synthese von Fettsäuren in den TAGs in LDs25gespeichert ist. Die Inhibitor wurde das Kulturmedium nach 2 h des Wachstums in der Abwesenheit einer Stickstoff-Quelle, eine Bedingung hinzugefügt in die Zellen die höhere Rate der Lipid-Akkumulation (Abb. 2 b) zeigte. Im Einklang mit früheren Berichten in S. Cerevisiae, führte die Zugabe von Soraphen-A die vollständige Hemmung der LD Akkumulation (Abbildung 2 b, hellblau) 20,21.

Um die Mobilisierung der LDs in U. Maydisweiter zu untersuchen, wurden Zellen gewachsen unter Stickstoff Hunger für 72 h YPD-Medium (Abbildung 3) übertragen. LD-Index sank nach einer Exponentialfunktion. Nach 24 Stunden erreicht der LD-Index ähnliche Werte auf, die in Zellen in YPD-Medium kultiviert, ohne den Stress der Stickstoff Abwesenheit (Abbildung 2A) beobachtet. Da die Zellen der LDs während Stickstoff Hunger angesammelt mobilisieren konnten, schlägt das Ergebnis eine Verringerung der Inhalt des TAGs. Eine ähnliche Reaktion wurde während der Studie von Phosphatasen beteiligt an der Regulation des Lipid-Stoffwechsel-21für S. Cerevisiae berichtet.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte in der LFR. Die Schritte der Kulturbedingungen sind repräsentativ für U. Maydis Hefe aber können auf andere Mikroorganismen oder Zellen angepasst werden. URF, Einheiten der Recovery Fluoreszenz; BD, Bidistilled Wasser. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Dynamik der Lipid-Tröpfchen-Akkumulation in U. Maydis. Hefezellen wurden für 24 h in YPD-Medium angebaut, geerntet und in (A) frisches YPD-Medium suspendiert (oben links) oder in (B) minimaler Medium ohne Stickstoffquelle (untere linke Panel-dunkelblau). Unter Stickstoff Hunger war die Zunahme der LD-Index durch Hinzufügen von 192 nM Soraphen A in den Kulturmedien nach 2 h des Wachstums (B, hellblau) gehemmt. n = 3, Daten sind der Mittelwert ± SEM Rechten Seite: konfokale Mikroskopie von LDs in Zelle geerntet um 24 h (A) Oberseite: YPD-Zellen. (B) Bodenplatte: Zellen ohne eine Stickstoff-Quelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: LDs Mobilisierung. Hefezellen wurden für 24 h in YPD-Medium angebaut, geerntet und in frischen YPD für 24 h (Kontrolle) angebaut oder in minimale mittlere ohne Stickstoffquelle für 72 h, dann frisch YPD Medium übertragen und für weitere 24 h. Aliquote inkubierten wurden zurückgezogen zu den o.g. Zeiten für beide Kulturen, die Mobilisierung der LDs von LFR zu messen. Daten wurde durch eine exponentielle Zerfall Gleichung ausgestattet (y = A·e-kt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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LFR ist eine neuartige Methode, die angewendet wurde, zum ersten Mal um den Fettstoffwechsel in S. Cerevisiae und später zu studieren, es erfolgreich war, umgesetzt U. Maydis20,21. Obwohl der LD-Index keinen absoluten Wert der Variablen in Zellen angesammelt geben, freuen Sie sich auf einen schnellen Überblick der Lipidgehalt der Zellen und die Interpretation der Daten ist einfach, wenn LD Index von zwei oder mehr experimentellen Bedingungen verglichen. BODIPY 493/503 ist hochspezifisch für neutrale Lipide, die Hauptkomponente von der Kirche Jesu Christi, und es hat einen schmalen Emissionsspektrum erleichtern die simultane Detektion der anderen Signale aus Farbstoffen wie Mito-Tracker oder CMAC blau wenn Zellen durch konfokale untersucht werden Mikroskopie-26. Wie viele fluoreszierende Moleküle BODIPY 493/503 ist empfindlich gegenüber Immunofluoreszenz während der Fluoreszenz-Mikroskopie-Experimente, aber dieser Prozess kann durch das Hinzufügen von anti-Immunofluoreszenz Reagenzien während der Exposition gegenüber Licht27verringert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen BODIPY 493/503 in einer Vielzahl von Zellen lässt sich um der Ansammlung und der Mobilisierung der neutralen Lipiden21,22,23,28,29zu studieren.

Für die Methode ordnungsgemäß funktioniert muss irgendwann berücksichtigt werden. Da die OD600 für die Berechnung des Indexes LD verwendet wird, sollten die Morphologie der Zellen radikale Veränderungen während des Experiments keinen. Die Erhaltung der intrazellulären Komponenten während der Fixierung der Zellen ist auch ein wichtiger Schritt, und diese Erhaltung gehört der Kirche Jesu Christi, die das Hauptziel dieses Protokolls sind. Befestigung der Zellen mit einer entsprechenden Verbindung ist sehr wichtig für die Anwendung dieser Methode für viele Arten von Zellen ohne Probleme. Hier haben wir Formaldehyd verwendet, um die Strukturen der Zellen zu beheben; der Aldehyd reagiert mit Aminogruppen von Proteinen. Es wurde berichtet, dass andere Aldehyde auch die Strukturen einer Vielzahl von Zellen erhalten und es scheint, dass es keine wesentliche Änderungen in der Protein-Struktur-24,-26. Ein Nachteil von Formaldehyd ist, dass es kleine Membranschäden induziert und Vakuole Bildung in der Nähe der mitochondrialen und Kernmembran, aber, diese negativen Auswirkungen sind in allen Aldehyd Fixierung Methoden26. Organische Lösungsmitteln wie Methanol oder Aceton sollte vermieden werden, da sie die LDs in den Zellen abgebaut. Fixierung mit organischen Lösungsmitteln basiert auf die Austrocknung und Fällung von Proteinen, die eine negative Wirkung angesehen werden kann. Darüber hinaus ist die Verwendung von organischen Lösungsmitteln unspezifische Färbung zugeordnet.

Wie jede andere Technik hätte die LD-Index-Assay Einschränkungen bei anderen Systemen umgesetzt. Probleme bei der Verbreitung von BODIPY über den Pilz Zellwand, die Abhängigkeit der Fluoreszenz Fettsäurezusammensetzung, die Art der Lipide und der Proteingehalt im intrazellulären Lipid stellen30, entgegen den Vergleich der Höhe des TAGs zwischen verschiedenen Arten oder sogar mit den gleichen Zellen unter verschiedenen Ernährungsbedingungen angebaut. Auch sind große morphologische Veränderungen wie dem Übergang zu Myzel oder Ausflockung der Zellen einige der Probleme, die gefunden werden können.

LD-Index-Assay ist eine Hochdurchsatz-Methode, die kurze Zeit und geringe Mengen an Biomasse und Reaktionspartner erfordert. Der Assay ist zuverlässig und die gewonnenen Daten sind genau und reproduzierbar. Zusätzlich, es enthält Richtlinien für die Forschung auf die Dynamik des Fettstoffwechsels in der Medizin, und es könnte ein Instrument in der Biotechnologie für die Hochdurchsatz-Screening von Ölsaaten Organismus für die Erzeugung von Biokraftstoffen oder Öle zu ernähren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zur Offenlegung

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo ein Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autónoma de México () UNAM) und Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP und 256520-GGS). Fundação de Amparo eine Pesquisa Rio De Janeiro (FAPERJ-Cientistas Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Wir dank QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo für die schematische Übersicht. Wir danken Dr. Miguel Tapia Rodríguez für die wertvolle Hilfe in der konfokalen Mikroskopie von LDs. Wir möchten danken Dr. Bruno Bozaquel Morais für seine Pionierarbeit bei der Entwicklung der Technik in S. Cerevisiae , die wir für U. Maydisangepasst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Lipid-Index Bestimmung von flüssigen Fluoreszenz Erholung der pilzliche Erreger <em>Ustilago Maydis</em>
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Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

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