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Biochemistry

Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para obter o índice de gotículas lipídicas (índice de LD) para estudar a dinâmica de triglicérides nas células cultivadas em experimentos de alta produtividade. O ensaio de índice de LD é um método fácil e confiável que usa BODIPY 493/503. Este ensaio não precisa de extração de lipídios dispendious ou análise de microscopia.

Abstract

O artigo mostra como implementar o ensaio de índice de LD, que é um ensaio sensível microplacas para determinar o acúmulo de triglicérides (TAGs) em gotículas lipídicas (LDs). Índice de LD é obtido sem extração de lipídios. Permite medir o teor de LDs em experimentos de alta produtividade em condições diferentes, tais como o crescimento em ricos ou mídia de nitrogênio empobrecido. Embora o método foi descrito pela primeira vez estudar o metabolismo de gotículas lipídicas em Saccharomyces cerevisiae, foi aplicado com sucesso para o basidiomiceto Ustilago maydis. Curiosamente, e porque LDs são organelas filogeneticamente conservadas em células eucarióticas, o método pode ser aplicado a uma grande variedade de células, do fermento para células de mamíferos. O índice de LD baseia o ensaio de recuperação de líquidos de fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503, sob condições de resfriamento, pela adição de células fixadas com formol. Iodo de potássio é usado como um quencher da fluorescência. A relação entre a fluorescência e pistas de densidade óptica é chamada índice de LD. Pistas são calculadas a partir de linhas retas obtidas quando BODIPY fluorescência e densidade óptica em 600 nm (OD600) são plotados contra adição de amostra. Qualidade de dados ideal é refletida por coeficientes de correlação iguais ou acima de 0,9 (r ≥ 0,9). Múltiplas amostras podem ser lidos simultaneamente, como pode ser implementada em uma microplaca. Desde BODIPY 493/503 é um lipofílico fluorescente tintura que partições para as gotículas lipídicas, pode ser usada em muitos tipos de células que se acumulam LDs.

Introduction

Gotículas lipídicas (LDs) são onipresentes corpos de gordura intracelulares, compostos por um núcleo de lipídios neutros, principalmente de TAGs e ésteres de esterol (SE). O núcleo é rodeado por uma monocamada de fosfolipídios que interage com proteínas como perilipin e enzimas envolvidas na síntese de lipídios neutros, como o diacilglicerol acil-transferase, carboxilase acetil-CoA e acil-CoA sintase1. Devido a seu comportamento dinâmico, a monocamada de fosfolipídeo também contém lipases triacilglicerol que hidrolisam TAGs e SE2. Dependendo do tipo de célula e organismo, lipídios neutros armazenados podem ser usados para gerar energia, ou sintetizam fosfolipídios e moléculas sinalizadoras. Em leveduras e outros fungos, o conteúdo do LDs muda em resposta a variações na proporção de nitrogênio/carbono em meios de cultura, indicando que a disponibilidade de nitrogênio diminuída pode ser a chave para aumentar a produção de lipídios neutros3,4 ,5. A produção de grandes quantidades de TAGs em levedura tem potencial uso em biotecnologia como fonte de biocombustíveis e na indústria alimentar. Alguns lipídeos armazenados contêm altas proporções de ácidos graxos poliinsaturados, como o ômega 3 e ômega 6, com importância nutricional e dietética 6,7,8,9,10 , 11. LDs de células de mamíferos, incluindo células humanas, também contêm TAGs e ésteres de colesterol. A monocamada de fosfolipídeo interage com o homólogo de mamíferos das proteínas descrito no fermento LDs e com uma proteína adicional, perilipin, que está ausente em S. cerevisiae12. Uma proposta que papel para a monocamada de fosfolípidos e suas proteínas associadas é para estabilizar a estrutura de LDs e permitir a interação do LDs com organelas como mitocôndrias, retículo endoplasmático, peroxissomos e vacúolos, principalmente para a troca de lipídios 13,14. Curiosamente, em humanos, LDs parecem estar envolvidos em patologias como a diabetes tipo 2, aterosclerose, esteatohepatite e doença coronariana, em que há um aumento no seu número 15,16,17 . Alguns tipos de vírus usam LDs como plataformas para montar os virions 2,18,19.

Devido as implicações de LDs em patologias humanas e seu potencial uso biotecnológico, a exata determinação experimental da formação de LDs é uma tarefa importante. Este artigo descreve um ensaio confiável baseado na recuperação da fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 4-diflúor-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obter um valor relativo do teor de lípidos neutros nas células. Com este ensaio, é possível acompanhar a dinâmica da acumulação de lípidos neutros em fungos como U. maydis e S. cerevisiaee também em células de mamíferos, sem a necessidade de extração de lipídios 20. O método foi aplicado pela primeira vez em S. cerevisiae para identificar as fosfatases da proteína e quinases envolveram na regulação do metabolismo lipídico. Isso foi possível sem extração de lipídios ou proteínas purificação21,22. LFR também tem sido utilizada para estabelecer a dinâmica da formação de LDs em macrófagos peritoneais23. O uso de BODIPY 493/503 tem algumas vantagens sobre outros corantes de lipídios neutros como Nilo vermelho. BODIPY 493/503 é altamente específico para lípidos neutros e tem um estreito espectro de emissão, facilitando a detecção simultânea de sinais de corantes como proteína fluorescente vermelha ou Mito-tracker, quando as amostras são analisadas por microscopia confocal. Infelizmente, BODIPY 493/503 é sensível ao fotobranqueamento, mas este processo pode ser evitado usando um reagente antiquenching durante a exposição à luz24.

Para realizar o ensaio LFR em células de levedura, que são cultivadas nas condições nutricionais desejadas e alíquotas sejam revogadas em momentos diferentes. Em seguida, as células são fixadas com formol, que preserva a integridade do LDs há meses, quando as células são armazenadas a 4 ° C. Outras técnicas de fixação devem ser evitadas, especialmente aqueles que utilizam metanol ou acetona gelada, uma vez que levam à degradação do LDs dentro das células,24. Para medir o índice de LD, em células fixadas em formol são suspensas em água para obter uma concentração definida. Então, eles são adicionados a uma solução contendo o fluoróforo BODIPY 493/503 saciada por KI, e quando o fluoróforo entra na célula e o associa com o LDs, há uma recuperação de sua fluorescência. Concomitante à medição de fluorescência (485 nm/510 nm), a concentração de células é quantificada através da medição da densidade óptica em 600 nm. Cada amostra é ler quatro vezes adicionando subsequentes 5 alíquotas de µ l de uma suspensão de células de formaldeído-fixo para o mesmo bem. Espaços em branco de fluorescência e absorção são adquiridos antes da adição de células. A qualidade de fluorescência e os dados de absorbância são avaliadas determinando a linearidade das medições: se r < 0.9, dados são descartados. O valor de r é importante porque basicamente a intensidade de fluorescência deve produzir uma resposta linear ao aumento das concentrações de célula. Se a concentração de células é muito alta, a linearidade é perdida. O ensaio LFR fornece um método rápido, simples e econômico para selecionar o fenótipo desejado do LD em experimentos de alta produtividade. Depois de selecionar as condições desejadas, o conteúdo do LD de células individuais pode ser estudado pela microscopia confocal, usando as mesmas células fixadas em formaldeído manchadas com BODIPY, fornecendo uma imagem de LDs na célula. Suas TAGs e conteúdo SE podem agora mais analisados por cromatografia em camada fina.

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Protocol

1. preparação de soluções e Buffers

  1. Para preparar 1 L de fosfato, tampão salino (PBS, pH 7), dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH a 7,0 com HCl e em seguida, adicione água para um volume final de 1 L. PBS pode ser feita como uma solução-mãe de 10x e armazenada à temperatura ambiente.
  2. Para preparar 10 mL da solução de fixação, adicione 1 mL de formol 37% para 9 mL de PBS para atingir uma concentração final de 3,7%. Prepare esta solução imediatamente antes da utilização.
    Cuidado: Use luvas para manipular a solução de formaldeído.
  3. Para preparar a solução têmpera (500 mM), dissolva 8,3 g de KI em 100 mL de água destilada. Preparar esta solução antes do uso e armazená-lo em temperatura ambiente.
  4. Para preparar a solução-mãe BODIPY 10 mM, dissolvem-se 10 mg de BODIPY 493/503 em 3,8 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO). Manter 100 alíquotas µ l no escuro a-70 ° C.
  5. Para preparar a solução de BODIPY 5 µM-têmpera, adicione 1 µ l de 10mm BODIPY 493/503 para 2 mL de solução que extingue a 500 mM. Para o ensaio LFR, uma concentração final de 5 µM de BODIPY é necessária.
  6. Para preparar a solução mineral, adicione 0,06 g de H3BO3, 0,14 g de MnCl2-4 H2O, 0,4 g de ZnCl2, 0,04 g de Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g de FeCl3-6 H2O e 0,4 g de CuSO 4-5 H2O para 1 L de água destilada.
  7. Para preparar a solução de sal, adicione 16 g de KH2PO4, 4G de at2para que4, 8 g de KCl, 2 g de MgSO4, 1 g de CaCl2e 8 mL de solução mineral para 1 L de água destilada.
  8. Para preparar o meio mínimo sem uma fonte de nitrogênio para U. maydis FB2 (a2b2), adicionar 10 g de glicose e 62,5 mL de solução de sal para 1 litro de água destilada, de acordo com o Holliday, et al 31. ajustar o pH a 7,0 e então dispense 100 mL dos meios de comunicação em frascos de 250 mL e esterilizá-los. Esterilização autoclave por 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) no ciclo de líquido ou filtro.
  9. Para preparar o meio de levedura peptona dextrose (YPD), adicione 5 g de fermento extrato, 2,5 g de peptona, e 5 g de glicose para 1 L de água destilada. Dispense a 100 mL de solução em frascos de 250 mL e esterilizá-los. Esterilização autoclave por 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) no ciclo de líquido ou filtro.

2. cultura do estado e fixação da pilha

Nota: Preserve a estrutura de LDs, fixando as células mais rapidamente possível. A fixação pode ser feita em tubos de microcentrifuge. Fixo de células podem ser mantidas a 4 ° C por até um mês se desidratação é evitada deixando uma fina camada de água.

  1. U. maydis células sob condições de cultura cresce relevantes para o estudo. Comece a cultura com uma OD inicial600 de 0,05 (1,15 × 106 células / mL). Incube as células a 28 ° C, 180 rpm por 24 h. Uma OD600 de 1 corresponde a 2,3 × 107 células / mL.
  2. No selecionado vezes, retirar uma alíquota de células. Para U. maydis, Retire 5 mL cada 2 h durante as primeiras 8 horas. Após 8 h de crescimento, alíquotas de 2 mL são suficientes.
  3. Medir a densidade óptica em 600 nm de cada alíquota.
  4. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C, utilizando uma centrífuga do tabletop. Desprezar o sobrenadante.
  5. Suspenda o sedimento das células em 1 mL de tampão de 3,7% de PBS-formaldeído. Incube as células durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  6. Após a incubação, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
  7. Lave o pellet de células duas vezes com um volume semelhante de água destilada (1ml). Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante após cada etapa de lavagem.
  8. Ajustar o centrifugado a 5 OD600 (1,15 x 108 células / mL) com água destilada, água (equação 1).
    Equation 1    Equação 1.
  9. Manter a amostra em 4 ° C até à sua utilização.

3. ensaio de recuperação de fluorescência líquido (LFR)

  1. Ligar o espectrofotômetro e abra o software de Skanlt. Clique na nova sessãoe escolha Iniciar e, em seguida, Varioskan Lux. Selecione o protocolo de árvore de sessão, digite as configurações para os comprimentos de onda de fluorescência (excitação 485 nm/emissão 510 nm; densidade óptica 600 nm) e escolha ganho automático fotomultiplicador. Para largura de banda de excitação, selecione 12 nm. Na ótica, selecione superior (excitação da amostra é de cima do poço).
  2. Insira uma agitação suave e contínua (300 rpm). Selecione Executar placa para forae Pausa até que a ação do usuário (tempo utilizado para a adição da amostra aos poços). Repeti o protocolo cinco vezes. Clique em salvar e escreva um nome para a sessão sobre o Campo de nome de sessão. O protocolo está agora pronto para as análises de amostras.
  3. Adicione 200 µ l do BODIPY 5 µM - saciada solução a cada poço um 96 bem preto-desobstruídos da placa de base.
  4. Coloque a placa dentro da câmara de espectrofotômetro e incubar 5 min à 30 ° C. A partir deste ponto, protege a placa de luz, tanto quanto possível.
  5. Clique no botão Iniciar e lê a fluorescência (485 excitação/emissão 510) e o OD600 correspondentes para os espaços em branco.
  6. Adicione 5 µ l de suspensão de célula de formaldeído-corrigido nos poços durante o tempo de pausa. Misture as amostras cuidadosamente com pipeta. Colocar a placa dentro do espectrofotómetro e clique em continuar. Em seguida, as amostras serão processadas de acordo com o protocolo projetado acima.
  7. Repita três adições sucessivas de 5 µ l de suspensão de células. Certifique-se que as células não se precipitar. (Figura 1).

4. os cálculos do índice de LD

  1. Para cada amostra em microplate, traça a curva de fluorescência e absorvância contra o volume de cada adição sucessiva (5 pontos, incluindo o espaço em branco). Neste estudo, use o software Microsoft Excel para os cálculos. Para plotar os dados, insira o volume, fluorescência e dados de absorbância na primeira, segunda e terceira coluna da folha de dados, respectivamente. Em seguida, selecione os dados com o cursor, clique em inserir e selecione dispersão (XY).
  2. Selecione os pontos para cada linha no gráfico e insira a respectiva Linha de tendência com a caixa Mostrar equação selecionada. Anote os valores das inclinações das duas linhas retas, de acordo com a equação 2:
    Equation 2    Equação 2
    Onde y = fluorescência ou densidade óptica, x = volume de amostra (0, 5, 10, 15, 20 µ l), m = inclinação da fluorescência ou linha de densidade óptica e b = intercepção de y.
  3. Divida o declive da linha de fluorescência pelo declive da linha de densidade óptica para obter o índice de LD, equação 3.
    Equation 3    Equação 3
    O índice de LD corresponde ao quociente da fluorescência e densidade óptica pistas.

5. análise de qualidade de dados

  1. Calcular o coeficiente de correlação de cada reta: clique sobre o Assistente de função (fx) e escolha CORREL. Se r < 0.9, descartar os dados e repetir as leituras. Se r ≥ 0,9, as leituras é confiável.

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Representative Results

LFR, com BODIPY 493/503 como sonda fluorescente é um método confiável e fácil para estudar a dinâmica acumulação de LDs em U. maydis, independentemente das condições de crescimento. Quando as células foram cultivadas em meio YPD, houve um aumento no índice de LD durante a fase exponencial, seguido por um declínio na fase estacionária (Figura 2A). Em contraste, em células cultivadas em fome de nitrogênio, houve um aumento constante no índice LD em ambas os exponenciais e fixas as fases (Figura 2B). Porque ambas as culturas foram iniciadas com a mesma densidade óptica (número semelhante de células), os resultados mostram a alta capacidade do ensaio LFR para detectar pequenas alterações no conteúdo lipídico (Figura 2). A sensibilidade do método foi corroborada pela microscopia confocal: YPD-células contêm muitos pequeno LDs em toda a célula inteira, enquanto sob inanição de nitrogênio, houve uma importante produção de LDs grande, normalmente de 4-5 LDs por células, (Figura 2, bem os painéis A e B, respectivamente). Desde que o índice de LD não é um valor absoluto do conteúdo lipídico neutro, deve ser construída uma curva padrão relativas ao índice de LD com a quantidade de triglicérides. Esta abordagem foi utilizada para estudar a dinâmica da síntese de TAGs em S. cerevisiae20. O ensaio LFR baseado em cada curva-padrão, pode ser usado para determinar a taxa de acúmulo de lipídios nas células.

O índice de LD pode ser seguido na presença de soraphen A, um inibidor específico da carboxilase acetil-CoA, uma enzima que é essencial para a síntese de ácidos graxos contidos nas TAGs armazenados em LDs25. O inibidor foi adicionado ao meio de cultura após 2 h de crescimento na ausência de uma fonte de nitrogênio, uma condição na qual células mostraram a maior taxa de acúmulo de lipídios (Figura 2B). Acordo com os relatórios anteriores no S. cerevisiae, a adição de soraphen-A resultou na inibição completa da LD acumulação (Figura 2B, luz-azul) 20,21.

Para investigar mais a mobilização de LDs em U. maydis, cultivados sob inanição de nitrogênio para 72 h foram transferidos para YPD-médio (Figura 3). Índice de LD diminuiu após uma função exponencial. Após 24h, o índice de LD atingiu valores semelhantes às observadas nas células cultivadas em meio YPD sem o estresse da ausência de nitrogênio (Figura 2A). Uma vez que as células foram capazes de mobilizar o LDs acumulado durante a fome de nitrogênio, o resultado sugere uma redução do teor de TAGs. Uma resposta semelhante foi relatada por S. cerevisiae durante o estudo de fosfatases envolvidas na regulação do metabolismo de lipídios21.

Figure 1
Figura 1: representação esquemática das etapas envolvidas na LFR. Os passos das condições de cultura são representativos para o U. maydis fermento, mas podem ser adaptados para outros microorganismos ou tipo de células. URF, unidades de recuperação de fluorescência; BD, água bidestilada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: dinâmica do acúmulo de gotículas lipídicas em U. maydis. Células de levedura foram cultivadas por 24 h em YPD e médias, colhidas e suspensa em YPD-meio (A) fresco (painel esquerdo superior) ou no meio (B) mínimo sem uma fonte de nitrogênio (parte inferior esquerda do painel azul-escuro). Sob inanição de nitrogênio, o aumento no índice de LD foi inibido pela adição de 192 nM soraphen A na cultura mídia após 2 h de crescimento (B, luz-azul). n = 3, os dados são da média ± SEM. Painel direito: microscopia confocal de LDs em células colhidas em 24 h. (A) painel superior: YPD-células. (B) painel inferior: células sem uma fonte de nitrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: mobilização de LDs. Células de levedura foram cultivadas por 24 h em YPD e médias, colhidas e crescidas em YPD fresco por 24 h (controle) ou no mínimo médio sem uma fonte de nitrogênio para 72 h, em seguida, transferidos para meio fresco-YPD e incubadas por alíquotas adicionais h. 24 foram retirados para o indicado vezes para ambas as culturas medir a mobilização do LDs pela LFR. Dados foi montados por uma equação de decaimento exponencial (y = A·e-kt). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

LFR é um novo método que foi aplicado pela primeira vez estudar o metabolismo de lipídios em S. cerevisiae e mais tarde foi com êxito implementado em U. maydis20,21. Embora o índice de LD não dá um valor absoluto das marcas acumuladas nas células, ele fornece uma ideia rápida do conteúdo lipídico das células, e a interpretação dos dados é direta quando índice LD de duas ou mais condições experimentais são comparados. BODIPY 493/503 é altamente específico para lípidos neutros, o principal componente do LDs, e tem um estreito espectro de emissão, facilitando a detecção simultânea de outros sinais provenientes de corantes como Mito-tracker ou CMAC azul quando as células são estudadas por confocal microscopia26. Como muitas moléculas fluorescentes, BODIPY 493/503 é sensível ao fotobranqueamento durante experimentos de microscopia de fluorescência, mas este processo pode ser diminuído pela adição anti fotobranqueamento reagentes durante a exposição à luz,27. Em resumo, BODIPY 493/503 pode ser usado em uma ampla gama de células para estudar a acumulação e a mobilização de lípidos neutros21,22,23,28,29.

Para o método funcione corretamente, algum ponto deve ser tida em conta. Desde que o OD600 é utilizado para o cálculo do índice de LD, a morfologia das células não deve ter mudanças radicais durante o experimento. A preservação dos componentes intracelulares durante a fixação das células também é uma etapa crítica, e essa preservação deve incluir o LDs, que são o principal objectivo do presente protocolo. Fixar as células com um composto apropriado é muito importante para a aplicação deste método a muitos tipos de células, sem qualquer problema. Aqui, usamos o formaldeído para corrigir as estruturas das células; o aldeído reage com os grupos aminoácidos de proteínas. Tem sido relatado que outros aldeídos também preservar as estruturas de uma ampla variedade de células, e parece que não há mudanças significativas na estrutura da proteína24,26. Uma desvantagem do formaldehyde é que induz danos de membrana pequena e formação do vacúolo perto mitocondrial e as membranas nucleares, mas, esses efeitos negativos são comuns a todos os aldeído fixação métodos26. Solventes orgânicos como o metanol ou acetona devem ser evitados porque eles se degradem o LDs nas células. Fixação com solventes orgânicos baseia-se na desidratação e precipitação de proteínas, que pode ser considerado um efeito negativo. Além disso, o uso de solvente orgânico é associado com coloração não específica.

Como qualquer outra técnica, o ensaio de índice de LD poderá ter limitações quando implementado para outros sistemas. Problemas na difusão de BODIPY através da parede celular fúngica, a dependência da fluorescência na composição de ácidos graxos, o tipo de lipídios e o conteúdo de proteína dentro de corpos de lipídios intracelular30, impedem a comparação da quantidade de TAGs entre espécies diferentes ou mesmo com as mesmas células cultivadas sob diferentes condições nutricionais. Além disso, grandes mudanças morfológicas tais como a transição para o micélio ou floculação das células são alguns dos problemas que podem ser encontrados.

Ensaio de índice de LD é um método de alta produtividade que requer vezes curto e pequenas quantidades de biomassa e reagentes. O ensaio é confiável, e os dados obtidos são precisos e reprodutíveis. Além disso, fornece orientações para a pesquisa sobre a dinâmica do metabolismo lipídico na medicina, e isso pode se tornar uma ferramenta em biotecnologia para o rastreio de alto rendimento do organismo das oleaginosas para a produção de biocombustíveis ou alimentar óleos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgação

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM,) e o Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Nós graças a QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo para o Visão geral esquemático. Dr. Miguel Tapia Rodríguez Agradecemos a ajuda valiosa na microscopia confocal de LDs. Gostaríamos de agradecer o Dr. Bruno Bozaquel Morais por seu trabalho pioneiro no desenvolvimento da técnica em S. cerevisiae que adaptamos para U. maydis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

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References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122, (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25, (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100, (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14, (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59, (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8, (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831, (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90, (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63, (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7, (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21, (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121, (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5, (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35, (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283, (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81, (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10, (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17, (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6, (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. Plenum. New York. 575-595 (1974).
Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo <em>Ustilago Maydis</em>
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Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

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