Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/57279
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 1
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

Burada, triacylglycerols hücrelerdeki yüksek üretilen iş deneylerde kültürlü dinamiklerini incelemek için lipid damlacık dizin (LD dizini) elde etmek için bir protokol açıklayın. LD dizin tahlil BODIPY 493/503 kullanır kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Bu tahlil dispendious lipid çekme ya da mikroskobu analiz ihtiyacı yok.

Abstract

Makale, triacylglycerols (Etiketler) lipid damlacıkları (LDs) birikimi belirlemek için bir hassas Mikroplaka tahlil LD dizin tahlil uygulamak gösterilmiştir. LD dizin lipid ayıklama elde edilir. O LDs içeriği zengin büyüme veya azot tükenmiş medya gibi farklı koşullar altında yüksek üretilen iş deneylerde ölçüm sağlar. Yöntem Saccharomyces cerevisiae, lipid damlacık metabolizmasında çalışmaya ilk kez açıklanan olsa basidiomycete Ustilago maydisbaşarıyla uygulandı. İlginçtir, ve LDs filogenetik korunmuş ökaryotik hücrelerde organellerin olduğundan, yöntem hücreleri, büyük bir çeşitlilik için Maya memeli hücreleri için uygulanabilir. LD dizin sıvı Floresans kurtarma tahlil (LFR) üzerinde su verme koşullarda BODIPY 493/503. formaldehit ile sabit hücreleri eklenmesiyle dayanmaktadır Potasyum iyot Floresans içki kullanılır. Floresan ve optik yoğunluk yamaçlar arasındaki oran LD dizin adı verilmiştir. Yamaçları ne zaman elde edilen düz çizgiler hesaplanan BODIPY floresan ve optik yoğunluk 600 nm (OD600) örnek ek karşı çizilen. En iyi veri kalitesi korelasyon katsayıları eşit veya 0,9 (r ≥ 0,9) yukarıda yansıtılır. Birden çok örneği aynı anda bir Mikroplaka uygulanabilir gibi okuyabilirsiniz. BODIPY 493/503 lipofilik bir floresan boya o bölümleri lipid damlacıkları olduğundan, LDs birikir hücreleri birçok türleri kullanılabilir.

Introduction

Lipid damlacıkları (LDs) her yerde birden bulunan hücre içi yağ nötr lipitler, esas olarak Etiketler ve sterol esterler (SE) özünü oluşan organlarıdır. Çekirdek perilipin ve enzim diacylglycerol açil transferaz, acetyl-CoA carboxylase ve asil-CoA synthase1gibi nötr lipitler sentezi yer gibi proteinler ile etkileşim bir monolayer fosfolipitler, çevrilidir. Dinamik davranış nedeniyle, Fosfolipid monolayer Etiketler ve SE2hidrolize triacylglycerol lipaz da içerir. Bağlı olarak hücre tipi ve organizma, saklı nötr lipitler enerji üretmek için kullanılabilir veya fosfolipitler ve sinyal molekülleri sentez. Maya ve diğer Mantarlar, yanıt olarak azot/karbon oranı düşük azot durumu tarafsız lipid üretim3,4 artırmak için anahtar olabilir gösteren kültür medyada değişimler LDs içeriğini değiştirir ,5. Yüksek miktarlarda Etiketler Maya üretimi bir potansiyel biyoteknoloji biyoyakıt ve gıda sektöründe kaynak olarak kullanıldı. Saklı bazı yağlar omega 3 ve omega 6, beslenme ve diyet önemi 6,7,8,9,10 ile gibi çoklu doymamış yağ asitleri yüksek oranlarda içerir , 11. insan hücreleri de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin LDs de içeren Etiketler ve kolesterol esterleri. Fosfolipid monolayer Maya LDs açıklanan proteinlerin homolog memeli ile ek bir protein yoktur perilipin ile etkileşim S. cerevisiae12. Bir rol Fosfolipid monolayer ve onun ilişkili proteinler için LDs yapısı stabilize etmek ve etkileşime LDS organelleri mitokondri, endoplazmik retikulum, tanımladıkları ve çarpıtmalar, esas olarak lipid değişimi için izin vermek için önerilen 13,14. İlginçtir ki, insanlarda, LDs patolojiler tip 2 diyabet, ateroskleroz, steatohepatitis ve Koroner kalp hastalığı, onların sayı 15,16,17 bir artış olduğu gibi yer gibi görünüyor . Biraz tip-in virüs LDs platformlar virions 2,18,19düzenlemek için kullanın.

İnsan patolojiler ve potansiyel Biyoteknolojik kullanımları LDS'de etkileri nedeniyle, LDs oluşumu tam deneysel belirlenmesi önemli bir görevdir. Bu makalede, floresan (LFR) BODIPY 493/503 kurtarma üzerinde dayalı güvenilir bir tahlil (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), hücrelerinde nötr lipitler içeriğini göreli değerini almak için. Bu tahlil ile nötr lipitler mantarlar U. maydis ve S. cerevisiaegibi ve aynı zamanda lipid ayıklama 20. , gerek kalmadan memeli hücrelerinde birikimi dinamikleri takip etmek mümkündür S. cerevisiae protein fosfatazlar tanımlamak için ilk kez yöntemi uygulandı ve söz konusu olursa kinaz lipid metabolizma düzenlenmesi. Bu lipid çekme ya da protein saflaştırma21,22mümkün oldu. LFR da LDs oluşumu Periton makrofajlar23yılında dinamikleri kurmak için kullanılmıştır. Kullanım BODIPY 493/503 Nil kırmızı diğer tarafsız lipid boyalar üzerinde bazı avantajları vardır. BODIPY 493/503 nötr lipitler için çok özel ve dar bir emisyon spektrum örnekleri tarafından confocal mikroskobu analiz edilir zaman boyalar gibi kırmızı floresan protein veya Mito-izci, gelen sinyalleri eşzamanlı algılama kolaylaştırmak. Ne yazık ki, BODIPY 493/503 photobleaching için hassas olduğunu, ancak bu işlem sırasında hafif24maruz antiquenching bir reaktif kullanarak önlenebilir.

Maya hücreleri LFR tahlil yapmak, onlar istenen beslenme koşulları altında kültürlü ve aliquots farklı zamanlarda çekilmiş. Daha sonra hücreler ne zaman hücreleri 4 ° C'de depolanan ay LDs bütünlüğünü korur formaldehit ile giderilen Diğer fiksasyon teknikleri, özellikle de onlar LDs bozulması hücreleri24içinde yol beri metanol veya soğuk aseton kullanarak kaçınılmalıdır. LD dizin ölçmek için hücreleri formaldehit sabit su içinde tanımlanmış bir konsantrasyon elde etmek için askıya alınır. Sonra fluorophore BODIPY 493/503 KI tarafından su içeren bir çözüm eklenir ve fluorophore hücreye girer ve LDs ile ilişkilendirir zaman onun Floresans kurtarılması yoktur. Floresans ölçüme (485 nm/510 nm) eşlik eden, hücre konsantrasyonu 600 optik yoğunluk ölçerek sayılabilir nm. Her örnek sonraki 5 µL aliquots formaldehit sabit hücre süspansiyon, sizin için de ekleyerek dört kere okunur. Boşlukları Absorbans ve floresan hücreleri toplamadan önce elde edilir. Floresan ve Absorbans veri kalitesi ölçümleri doğrusallık belirlenerek değerlendirilir: Eğer r < 0,9, veri atılır. R değeri önemli çünkü temelde floresan yoğunluğu artan hücre konsantrasyonları doğrusal bir yanıt üretmek gerekir. Hücre konsantrasyonu çok yüksek ise, doğrusallık kaybolur. LFR tahlil istenen LD fenotip yüksek üretilen iş deneylerde seçmek için hızlı, basit ve ekonomik bir yöntemdir. İstediğiniz koşulları seçtikten sonra tek tek hücreleri LD içeriğini confocal mikroskobu, BODIPY, hücre LDS'de görüntüsünü sağlayan ile lekeli aynı formaldehit sabit hücreleri kullanarak tarafından ele. Onların Etiketler ve SE içeriği şimdi daha da ince tabaka Kromatografi tarafından çözümlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması arabellekleri ve çözümleri

  1. Fosfat 1 litre hazırlamak için serum fizyolojik (PBS, pH 7) arabelleğe alınmış, 8 gram NaCl, 0.2 gram KCl, 1.44 g Na2HPO4, KH2PO4 ' te 800 mL distillated su 0,24 g geçiyoruz. 7.0 ile HCl pH ayarlama ve 10 x hisse senedi çözüm olarak yapılan ve oda sıcaklığında depolanan son hacmi 1 L. PBS için su ekleyin.
  2. Çözüm sabitleme 10 mL hazırlamak için 1 mL % 37 formaldehit son konsantrasyonu % 3.7 ulaşmak için PBS için 9 mL ekleyin. Bu çözüm sadece kullanmadan önce hazırlayın.
    Dikkat: eldiven formaldehit çözüm işlemek için kullanın.
  3. Şoklama çözüm (500 mM) hazırlamak için KI 8.3 g distile su 100 ml geçiyoruz. Bu çözüm kullanmadan önce hazırlamak ve oda sıcaklığında saklayın.
  4. BODIPY 10 mM hisse senedi çözüm hazırlamak için 10 mg BODIPY 493/503 Dimetil sülfoksit (DMSO) 3.8 ml geçiyoruz. -70 ° C'de 100 µL aliquots bıraktığımız
  5. BODIPY 5 µM Şoklama çözüm hazırlamak 10 mm BODIPY 500 mM çözüm Şoklama 493/503-2 mL 1 µL ekleyin. LFR tahlil için BODIPY 5 mikron son bir konsantrasyon gereklidir.
  6. Mineral çözüm hazırlamak için H3BO 0,06 g ekleyin4-2 H2O, 0.1 g FeCl3-6 H2O ve 0.4 g CuSO çalışma MoO3, MnCl2-4 H2O, 0.4 g ZnCl2, 0,04 g Na20.14 g 4-5 H2O 1 litre saf su için.
  7. Tuz solüsyonu hazırlamak KH2PO4,4, KCl 8 g, 2 g MgSO4, CaCl21 g ve 1 litre için mineral çözüm 8 mL distile su böylece Na24 g 16 g ekleyin.
  8. U. maydis FB2 (a2b2), bir nitrojen kaynağı olmadan en az orta hazırlamak için 10 g glikoz ve tuz solüsyonu 62.5 mL distile su, 1 litre Holliday göre et al. ekleyin. 31. pH 7,0 için ayarlamak ve sonra 100 mL 250 mL şişe medya dağıtmak ve onları sterilize. Otoklav 20 dk, 15 psi (1,05 kg/cm2) sıvı döngüsü veya filtre için sterilize.
  9. Maya pepton dekstroz orta (YPD) hazırlamak 5 g maya ekstresi, pepton, 2.5 g ve 5 g glikoz 1 litre için distile su ekleyin. 100 mL 250 mL şişe çözümde dağıtmak ve onları sterilize. Otoklav 20 dk, 15 psi (1,05 kg/cm2) sıvı döngüsü veya filtre için sterilize.

2. Kültür durumu ve hücre fiksasyon

Not: hücreleri en kısa zamanda düzelterek LDs yapısını korumak. Fiksasyonun microcentrifuge tüplerde yapılabilir. Dehidratasyon su ince bir tabaka bırakarak kaçınılması Eğer sabit hücreleri 4 ° C'de en fazla bir ay için tutulabilir.

  1. U. maydis hücreler kültür koşullar altında ilgili çalışma için büyümek. Kültür bir ilk OD600 0,05 ile başlamak (1.15 × 106 hücre / mL). Hücreleri 28 ° c, 180 rpm 24 h için kuluçkaya. 1 bir OD600 2.3 × 107 hücrelere karşılık gelen / mL.
  2. Seçili, kez, çekilme hücrelerin bir aliquot. U. maydis, için 5 mL her 2 h ilk 8 h sırasında geri alıyorum. Büyüme 8 h sonra aliquots 2 ml yeterlidir.
  3. 600 optik yoğunluk ölçmek her aliquot nm.
  4. 14.000 x g masa üstü bir santrifüj kullanarak 4 ° C'de 1 dk. için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.
  5. PBS-formaldehit % 3.7 arabelleği 1 mL hücrelerde Pelet askıya alma. Oda sıcaklığında 15 dk için hücreleri kuluçkaya.
  6. Kuluçka sonra santrifüj kapasitesi 14.000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de hücre süspansiyon Süpernatant atmak.
  7. Hücreleri Pelet iki kez distile su (1 mL) benzer bir hacmi ile yıkayın. 14.000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi Süpernatant her yıkama adımdan sonra atın.
  8. Hücre Pelet 5 OD600 ayarlamak (1.15 x 108 hücre / mL) ile distile su (Denklem 1).
    Equation 1    Denklem 1.
  9. Örnek 4 ° C'de kullanımı kadar tutun.

3. sıvı Floresans kurtarma tahlil (LFR)

  1. Spektrofotometre üzerinde açmak ve Skanlt yazılımını açın. Tıkırtı üstünde yeni oturumve Başlat ve sonra Varioskan Luxseçin. İletişim kuralı oturum ağacından seçin, Floresans dalga boylarında (uyarma 485 nm/emisyon 510 nm; optik yoğunluk 600 nm) ayarlarını girin ve otomatik photomultiplier kazanç seçin. Uyarma için bant genişliği, select 12 nm. Optik, üst seçin (uyarma örnek olduğunu iyi en baştan).
  2. Nazik ve sürekli ajitasyon (300 rpm) girin. Plaka dışarı koşmakve Duraklat kadar kullanıcı eylemi (kuyuları örneğine eklenmesi için kullanılan zaman) seçin. Protokol beş kez tekrarlayın. Kaydet ' i tıklatın ve Oturum adı alanıüzerinde oturum için bir ad yazın. İletişim kuralı artık örnekleri analizleri için hazırdır.
  3. BODIPY 5 µM-200 µL çözüm 96 de siyah-clear alt plaka her şey için su ekleyin.
  4. Plaka Spektrofotometre odası yerleştirin ve 30 ° C'de 5 dk kuluçkaya Bu noktadan sonra mümkün olduğu kadar ışık plaka korumak.
  5. Başlat düğmesini tıklatın ve floresan (uyarma 485/emisyon 510) ve boşlukları için karşılık gelen OD600 okuyun.
  6. 5 µL formaldehit sabit hücre Süspansiyon sırasında duraklama süresini wells için ekleyin. Örnekleri dikkatle pipet ile karıştırın. Spektrofotometre içinde plaka koymak ve devam' ı tıklatın. O zaman, örnekleri üzerinde tasarlanmış protokolüne göre işlenir.
  7. Hücre süspansiyon 5 µL üç art arda ekleme yineleyin. Hücreleri değil çökelti emin olun. (Şekil 1).

4. hesaplamalar LD dizin

  1. Mikroplaka her örnek için bir grafik Floresans ve birbirini izleyen her ek (5 puan boş dahil) hacmi karşı Absorbans arsa. Bu çalışmada, hesaplamalar için Microsoft Excel yazılımı kullanın. Verileri çizmek, ilk olarak, birim, floresan ve Absorbans veri girmek için veri sayfası, ikinci ve üçüncü sütunun anılan sıraya göre. Sonra imleci ile tüm verileri seçin, EKLE'yi tıklatın ve (XY) dağılım seçin.
  2. Grafikte her noktalarını seçin ve ilgili TREND çizgisi DENKLEMİ göster kutusunu seçili ekleyin. Denklem 2 göre iki düz çizgiler yamaçları değerleri yazın:
    Equation 2    Denklem 2
    Nerede y floresan veya optik yoğunluk, x = örnek hacmi = (0, 5, 10, 15, 20 µL), m floresan veya optik yoğunluk hat ve b eğim = y kesişim noktası =.
  3. Floresans çizgisinin eğimini LD dizin, denklem 3 almak için optik yoğunluk çizgisinin eğimini tarafından bölün.
    Equation 3    Denklem 3
    LD dizin Floresans sayının karşılık gelir ve optik yoğunluk yamaçlarında.

5. veri kalitesi analizi

  1. Her düz çizgi korelasyon katsayısını hesaplar: İşlev Sihirbazı ' nda (fx) tıklatın ve korelasyonseçin. Eğer r < 0.9, verilerini atmak ve okumalar yineleyin. R ≥ 0,9, okuma güvenilir iseniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LFR, ile BODIPY 493/503 floresan sonda olarak büyüme koşulları LDs U. maydis, ne olursa olsun içinde dinamik birikimi çalışmaya güvenilir ve kolay bir yöntemdir. Hücreleri YPD-ortamda kültürlü, durağan faz (şekil 2A) bir düşüş ardından bir artış LD dizin veya üssel faz sırasında oldu. Buna ek olarak, azot açlık altında yetiştirilen hücrelerde, her iki Üstel ve sabit aşamaları (şekil 2B) LD dizinde sürekli bir artış vardı. Her iki kültürler aynı optik yoğunluk (benzer hücre sayısı) ile başlatılan çünkü lipid içerik (Şekil 2) küçük değişiklikleri algılamak için yüksek kapasiteli LFR testin sonuçları. Yöntem duyarlılığını confocal mikroskobu tarafından doğrulanmıştır: YPD-hücreleri içeren tüm hücre boyunca birçok küçük LDs iken azot açlık altında önemli bir üretim (Şekil 2, büyük LDS, genellikle 4-5 LDs hücreleri, başına paneller A ve B, sırasıyla sağ). LD dizin tarafsız lipid içeriğin bir mutlak değer olmadığından, LD dizin triacylglycerols miktarı ile ilgili bir standart eğri inşa edilmelidir. Bu yaklaşım S. cerevisiae20Etiketler sentezinde dinamiklerini incelemek için kullanıldı. Her standart eğri dayalı, LFR tahlil olabilir için belirli hücrelerin lipid birikimi oranı kullanılır.

LD dizin soraphen A, belirli bir inhibitörü olan acetyl-CoA carboxylase, LDs25içinde depolanan Etiketler bulunan yağ asitlerinin sentezi için gerekli bir enzim huzurunda izlenebilir. Engelleyici kültür ortamına büyüme yokluğunda bir nitrojen kaynağı, hücrelerin lipid birikimi (şekil 2B) daha yüksek oranda gösterdi bir koşul 2 h sonra eklendi. S. cerevisiae ' in önceki raporları doğrultusunda soraphen-A ek LD birikimi (2B şekil, açık mavi) 20,21tam inhibisyonu sonuçlandı.

U. maydisLDS'de seferberlik daha ayrıntılı araştırmaya, azot açlık için 72 h altında yetiştirilen hücrelerin YPD-orta (şekil 3) devredilmiştir. Bir Üstel fonksiyon takip LD dizin azalmıştır. 24 saat sonra LD dizin YPD-ortamda azot devamsızlık (şekil 2A) stres olmadan kültürlü hücrelerdeki gözlemlenen benzer değerlere ulaştı. Hücreleri azot açlık sırasında biriken LDs seferber etmek başardık, sonuç Etiketler içerik bir azalma gösteriyor. Benzer bir yanıt S. cerevisiae için fosfatazlar lipid metabolizma21yönetmelikte yer alan çalışma sırasında bildirildi.

Figure 1
Şekil 1: LFR adımlar şematik gösterimi. Belgili tanımlık merdiven kültür koşullardan U. maydis Maya için temsilcisi vardır ama diğer mikroorganizma veya hücre türüne adapte edilebilir. URF, kurtarma Floresans birimlerinin; BD, bidistilled su. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: lipid damlacıkları birikimi U. maydis dinamiği. Maya hücreleri YPD-orta 24 h yetiştirilen, hasat ve (A) taze YPD ortamda askıya (üst sol panel) veya (B) en az orta bir nitrojen kaynağı (alt sol paneli-lacivert) olmadan. Azot açlık altında LD Endeksi artış 192 nM soraphen A kültür medya büyüme (B, açık mavi) 2 h sonra ekleyerek inhibe. n = 3, veri çoğu ortalama ± SEM Doğru kapı aynası: LDS hücredeki confocal mikroskobu hasat 24 h (A) üst panel: YPD-hücreleri. (B) alt paneli: bir nitrojen kaynağı olmayan hücreler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: LDs seferberlik. Maya hücreleri YPD-orta 24 h yetiştirilen, hasat ve taze YPD 24 h (kontrol) için yetiştirilen veya içinde en az belirtilen içine kapanık 72 h için bir nitrojen kaynağı olmadan orta sonra taze-YPD orta transfer edilen ve ek 24 h Aliquots için inkübe kez LDs LFR tarafından seferberlik ölçmek her iki kültürler için. Veri bir üstel çürüme denklemle ile donatılmış (y A·e-kt=). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LFR başarıyla yapıldı lipid metabolizma S. cerevisiae ve daha sonra eğitim ilk kez uygulanan bir yöntemdir roman U. maydis20,21' uygulanmaktadır. LD dizin hücrelerinde birikmiş Etiketler mutlak değerini vermek değil rağmen hücre lipid içeriği hakkında hızlı bir fikir sağlar ve ne zaman iki veya daha fazla deneysel koşullar dizinden LD karşılaştırılır verilerin yorumlanması basittir. BODIPY 493/503 nötr lipitler, LDs ana bileşeni için çok özel ve dar bir emisyon spektrum boyalar Mito-izci veya CMAC mavi gibi hücreleri confocal tarafından incelendiği zaman gelen diğer sinyalleri eşzamanlı algılama kolaylaştırmak vardır mikroskopi26. Çok floresan moleküller gibi BODIPY 493/503 Floresans mikroskobu deneyler sırasında photobleaching için hassas olduğunu, ancak bu işlem sırasında ışık27maruz photobleaching reaktifler ekleyerek Azaltılabilecek. Özetle, BODIPY 493/503 hücreleri geniş bir birikimi ve seferberlik nötr lipitler21,22,23,28,29eğitim için kullanılabilir.

Düzgün çalışması için yöntemi, bir ara göz önüne alınması gerekir. OD600 LD dizin hesaplanması için kullanıldığından, hücre morfolojisi deneme sırasında radikal değişiklikler olmamalıdır. Hücre içi bileşenleri koruma hücreleri fiksasyonu sırasında da önemli bir adım ve bu koruma bu iletişim kuralını temel amacı vardır LDs içermelidir. Uygun bir karışımla hücreleri tamir çok bu yöntem uygulama sağlayan herhangi bir sorun olmadan hücrelerin önemlidir. Burada, formaldehit hücrelerin yapıları düzeltmek için kullanılan; Aldehid proteinler amino grupları ile tepki verir. Diğer aldehitler de geniş bir hücre yapıları korumak ve görünüşe göre olmadığı önemli değişiklikler protein yapısı24,26yılında bildirilmiştir. Bir dezavantajı formaldehit küçük zar hasar neden olmaktadır ve çarpıtma oluşumu mitokondrial ve nükleer membran, ama, bu olumsuz etkileri yakınındaki bütün aldehid fiksasyon yöntemleri26için ortak olduğunu. Çünkü onlar hücrelerdeki LDs aşağılamak metanol veya aseton gibi organik çözücüler kaçınılmalıdır. Fiksasyon organik çözücüler ile su kaybı ve yağış olumsuz bir etkisi düşünülebilir proteinlerin temel alır. Ayrıca, organik solvent kullanımı non-spesifik boyama ile ilişkilidir.

Herhangi bir diğer teknik, LD dizin tahlil diğer sistemlere uygulanan sınırlamaları olabilir. BODIPY Difüzyon mantar hücre duvarı, Floresans bağımlılığı yağ asidi kompozisyonu, lipidler ve hücre içi lipid organları30, protein içeriği türü arasında sorunlar Etiketler miktarı karşılaştırılması engel farklı türler arasında veya aynı hücrelerle bile farklı beslenme koşulları altında büyüdü. Ayrıca, büyük morfolojik değişiklikler miselyum veya hücre flokülasyon geçiş gibi bazı bulunabilir sorunları vardır.

LD dizin tahlil kısa kez ve biyokütle ve Reaktanları küçük miktarda gerektiren bir yüksek üretilen iş yöntemidir. Tahlil ve güvenilir veri elde doğru ve tekrarlanabilir. Buna ek olarak, lipid metabolizması tıpta dinamikleri üzerinde araştırma için yönergeler sağlar ve biyoteknoloji biyoyakıt üretimi için oleaginous organizmanın yüksek üretilen iş tarama için bir araç haline veya yağlar besleme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar açıklama yok

Acknowledgments

Bu eser hibe tarafından desteklenen Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-YUDUM-20170864), Programa de Apoyo Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autonoma de México () UNAM) ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP ve 256520-yumurta). Fundação de Amparo bir Pesquisa yapmak Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas Nosso Estado yapın: E 26/103.353/2011). Biz QFB sayesinde. Oscar Iván Luqueño Bocardo şematik genel bakış. Biz Dr Miguel Tapia Rodríguez LDS confocal mikroskobu değerli yardım için teşekkür ederim. Dr. Bruno Bozaquel Morais U. maydisiçin uyarlanmış S. cerevisiae teknikte gelişmekte olan öncü çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).

Tags

Biyokimya sayı: 134 Lipid dizin lipid damlacıkları basidiomycete Floresans kurtarma BODIPY 493/503 Ustilago maydis
Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen <em>Ustilago Maydis</em> sıvı Floresans kurtarma tarafından
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli,… More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter