Summary
כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.
Abstract
המערכת החיסונית מעיים ממלא תפקיד חיוני בשמירה על המכשול את תפקוד מערכת העיכול על ידי יצירת סובלנית התגובות אנטיגנים תזונתיים וחיידקים commensal בעת טעינת תגובות חיסוניות יעילה כדי enteropathogenic מיקרובים. בנוסף, כבר ברור כי החסינות המקומית מעיים יש השפעה עמוקה על חסינות מרוחק ומערכתית. לכן, חשוב ללמוד איך תגובה חיסונית מעיים הוא המושרה ומהי התוצאה אוטואימונית של התגובה. . הנה, פרוטוקול מפורט מתואר על הבידוד של לימפוציטים מפני מהאתרים אינדוקטיבית המעי הדק של פייה רקמת הלימפה הקשורים בטן ותיקונים בלוטות לימפה mesenteric ניקוז ואתרי אפקטור כמו פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי. שיטה זו מבטיחה בידוד של מספר גדול של לימפוציטים רקמות במעיים קטן עם טוהר האופטימלי ואת הכדאיות מינימלי זיהום compartmental לחצות בתוך אילוצי זמן מקובל. היכולת הטכנית לבודד לימפוציטים ותאים חיסוניים אחרים רקמות מעיים מאפשר את הבנת התגובות החיסונית זיהומים במערכת העיכול, סרטן ומחלות דלקתיות.
Introduction
מערכת העיכול (GI) יש הרבה קיפולים בליטות המייצג את הממשק הגדול המפריד בין הגוף הפנימיים ואת הסביבה החיצונית. המערכת החיסונית מעיים ממלא תפקיד חיוני בשמירה על הפונקציה מכשול של דרכי העיכול. הוא כל הזמן נחשף אנטיגנים תזונתיים commensal חיידקים, חיידקים פתוגניים. בתור שכזה, זה חייב להישאר סובלני כדי אנטיגנים מזון וחיידקים commensal תוך שמירה על יכולת לייצר במהירות תגובה חיסונית יעיל חיידקים enteropathogenic1. מערכת החיסון במעי יכול להיות מבחינה אנטומית מחולק אתרי אינדוקטיבית, איפה לימפוציטים נאיביים מופעלים על ידי אנטיגן הצגת תאים נושאת אנטיגנים של רירית המעי, ואתרי אפקטור, שבו מופעל לימפוציטים להפעיל ספציפי אפקטור פונקציות2. האתרים אינדוקטיבית מהווים את המבנה הלימפה מאורגן של טלאים של פייה (PP) זה סוקר לומן מעיים ישירות דרך הפעולה של תאים מיוחדים מ', את אזורי ניקוז בלוטות לימפה mesenteric (MLN). האתרים אפקטור מורכב מוסקולריס פרופריה (LP), אשר הוא רקמת החיבור שמתחת קרום המרתף, האפיתל במעי, שכבה תא בודד הממוקם מעל קרום המרתף המכיל intraepithelial הנרתיק לימפוציטים (אישור IEL). לימפוציטים הם השחקנים המרכזיים של חסינות מסתגלת לתווך הגנה מפני זיהומים, סרטן, עשוי גם לתרום immunopathology במחלות דלקתיות. חשוב ולהבין רלוונטיות גבוהה ללמוד לימפוציטים אלה ברורים אנטומי תאי הרירית טוב יותר שלהם אינדוקציה ופונקציות אפקטור.
פרוטוקול יחסית פשוטה ואחידה על הבידוד של לימפוציטים של תאים אלה יש צורך כפי ומאיצות מספר חוקרים חקר מערכת החיסון אירועים המתרחשים במעי. מספר קבוצות המחקר פורסמו הפרוטוקולים חולקים מספר תהליכים דומים עבור בידוד תאים חיסוניים העכבר קטן תאי המעי3,4,5,6,7 . עם זאת, ישנם מספר הבדלים טכניים בין השאר בהתאם המוקד של פרוטוקול בודדים. לדוגמה, תוך התמקדות לבודד את התאים החיסוניים מ אריך הנגן, פרוטוקול אחד בוחן את ההשפעה של digestions אנזימטיות שונות על הכדאיות התא, התא סמן משטח ביטוי ההרכב של תאים חיסוניים מבודד5. פרוטוקול אחר מדגיש שיטה לשחזור מהיר עבור בידוד של לימפוציטים ללא צפיפות צנטריפוגה6. לבסוף, פרוטוקולים מסוימים קיימים גם לצורך בידוד תאי phagocytes משכבות רקמות שונות של המעי הדק7. כאן מוצג מאוד לשחזור פרוטוקול המאפשר בידוד רציפה של לימפוציטים אוכלוסיות של תא MLN, PP, LP ו אישור IEL של המעי הדק.
אנו מתמקדים בידוד אוכלוסיות נקיים במיוחד מן LP ו אישור IEL מדורים, חופשיים במידה רבה של מזהמים של תאים מעיים אחרים. זה נעשה שימוש נרחב פרוטוקול מפיק תשואה גבוהה של לימפוציטים טהור מקסימאלית בר -קיימא תוך זמן מקובל אילוצים4,8,9,10,11,12. פרוטוקול זה גם מבטיח את הבידוד של לימפוציטים מן התא LP ו אישור IEL עם זיהום compartmental לחצות מינימלי, ומאפשר הזדמנות בתום ללמוד לימפוציטים בקרונות אלה ברורים. יכול להיות נתון לימפוציטים מבודד מניפולציות נוספות כמו ניתוח תזרים cytometric או אנליזה פונקציונלית. פרוטוקול זה יושם בהצלחה את בידודה של לימפוציטים העכבר המעי הדק, המעי הגס במהלך זיהומים חיידקיים כגון ליסטריה, סלמונלה typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis זיהומים ובתנאים דלקתיות כמו קוליטיס כימית - ו פתוגן-induced. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד תאים חיסוניים מולדים כגון תאים דנדריטים, מקרופאגים, נויטרופילים ומונוציטים העכבר המעי הדק, המעי הגס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויים בבעלי חיים היו לפי הנחיות המכון הלאומי לבריאות ואושר על ידי סטוני ברוק אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה.
הערה: ודא כי כל האישורים מוענקות לפני ביצוע הליכים.
1. פתרון הכנה
-
HGPG (HEPES,-גלוטמין פניצילין/סטרפטומיצין, gentamycin), 100 ×
- לערבב 59.6 g HEPES (500 מ"מ הסופי), 14.6 g L-גלוטמין (200 מ"מ הסופי), 1 × 106 U פניצילין (2,000 U/mL הסופי), סטרפטומיצין 1 g (2 מ"ג/מ"ל הסופי) ו- 2.5 מ"ג גנטמיצין (5 µg/mL הסופי). להוסיף RPMI 1640 עד 500 מ"ל. להתאים את ה-pH 7.5 באמצעות NaOH (לפני ההתאמה, המאגר הוא צהוב/כתום עם pH בסביבות 6.0). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. Aliquot, חנות ב-20 ° C עד 1 שנה או ב 4 ° C עד כחודש.
-
מאגר HEPES-ביקרבונט, 10 x
- לערבב 23.8 g HEPES (100 מ מ הסופי), 21 גרם NaHCO3 (250 מ מ הסופי) ומוסיפים מים עד 1000 מ"ל. להתאים את ה-pH ל 7.2 עם HCl. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.45 μm. לאחסן בטמפרטורת החדר. ה-pH משתנה לאורך זמן. מחדש להתאים את ה-pH מעת לעת.
-
הקציר מדיה (~ עכברים בקבוק 1/2)
- עד 500 מ"ל RPMI 1640, להוסיף 25 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום (5% הסופי), 5 מ ל 100 × HGPG. לאחסן עד 6 חודשים ב 4 º C.
-
Dithioerythritol (DTE) פתרון (40 מ ל/קטן המעי)
- מערבבים 50 מ ל 10 × תמיסת מלח מאוזנת הנקס, Ca2+- ומ ג2+-חינם, 50 מ ל 10 × HEPES-ביקרבונט מאגר ולאחר 50 מ ל חום-לא פעיל העובר שור סרום (10% הסופי). להוסיף 350 מ ל H2O ו- 15.4 מ"ג dithioerythritol/100 מ"ל (1 מ מ הסופי). להכין את זה טרי לפני השימוש.
-
Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון (50 מ ל/קטן המעי)
- מערבבים 50 מ ל 10 × תמיסת מלח מאוזנת הנקס, Ca2+- ומ ג2+-חינם עם 5 מ ל 100 × HGPG. להוסיף 445 מ ל H2O. להוסיף 260 µL 0.5 M EDTA/100 מ ל (1.3 מ מ הסופי). להכין את זה טרי לפני השימוש.
-
Collagenase פתרון (30 מ ל/LP)
- עד 500 מ"ל RPMI, להוסיף 50 מל FBS (10% FBS הסופי), 5 מ ל 100 × HPGP, 1 מ"ל 0.5 M MgCl2 (1 מ מ הסופי) ו 1 מ"ל 0.5 M CaCl2 (1 מ מ הסופי). הוסף collagenase, מסוג I (100 סופי U/mL). להכין את זה טרי לפני השימוש.
-
דחיסות צבע (ג'י) פתרונות
- להכין 1 × DG פתרון מניות על ידי ערבוב פתרון מניות 90 מ ל די. ג'י (עיין טבלה של חומרים) עם 10 מ"ל של 10 × PBS. לשמור על סטריליות ב 4 º C.
- להכין פתרון די. ג'י 44% (8 מ ל/אישור IEL, 8 מ ל/LP) על ידי ערבוב 44 מ של פתרון מניות 1 × DG ו 56 mL RPMI 1640. להכין את זה טרי לפני השימוש.
- להכין פתרון די. ג'י 67% (5 מ ל/אישור IEL, 5 מ ל/LP) על ידי ערבוב 67 מ"ל של פתרון מניות 1 × DG ו- 33 mL RPMI 1640. להכין את זה טרי לפני השימוש.
2. בידוד של בלוטות לימפה Mesenteric, מעיים, ולא של Peyer טלאים
- המתת חסד העכבר באמצעות הרדמה פחמן דו-חמצני ונקע בצוואר הרחם משני. הנח את העכבר על גבו, לרסס עם 70% אתנול. להשתמש במספריים לעשות חתך קו האמצע, ופתח את העור, דופן הבטן לחשוף חלל הצפק.
- לאתר של caecum, להשתמש מלקחיים למשוך בעדינות את caecum למטה. להשתמש בזהירות. זוז ימינה, חשיפת הרשת MLN כולו, אשר מיושר עם המעי הגס המעי הדק מלקחיים.
הערה: מפה של בלוטות לימפה mesenteric שרשרת וניקוז לימפטי של המעיים היה בעבר מתואר13. - לזהות את הצומת התחתון של הרשת, ממוקם קרוב אל המעי. השתמש ערכה אחת של מלקחיים לאחוז השומן/מצע המעי סביבו ולהסיר בעדינות את השרשרת MLN מלמטה למעלה על-ידי tweezing את השומן סביב הצומת לימפה עם עוד זוג מלקחיים.
- הנח את השרשרת MLN על מגבת נייר לחלח עם מדיה הקציר. להסיר שומן/מצע המעי על ידי גלגול את השרשרת על המגדל נייר חליצה השומן עם שתי קבוצות של מלקחיים. מניחים את MLN בתקשורת קר הקציר עבור שלבים בידוד מאוחר יותר.
הערה: טיפול ישיר (i) של הצמתים זו אינה מומלצת. במקום זאת, לאחוז השומן/מצע המעי סביבם. (ii) זה קריטי כדי להסיר כמה שיותר שומן/מצע המעי ככל האפשר כדי לשפר את יכולת הקיום תא - חותכים המעי הדק מתחת את שריר הסוגר מולדת ומעל המעי באמצעות מספריים. המעי, צא מהחנייה באיטיות מ מעי אל התריסריון באמצעות ערכה אחת של מלקחיים תוך הסרת המצורפת מצע המעי/השומן באמצעות עוד זוג מלקחיים.
- במקום המעי על מגבת נייר לחלח עם מדיה הקציר, להקניט שומן/מצע המעי כל שנותר מחוץ עם שתי קבוצות של מלקחיים.
הערה: (i) הקפד להסיר כמה שיותר שומן/מצע המעי ככל האפשר עבור תשואה אופטימלית התא ואת הכדאיות. (ii) לשמור את המעי לחלח לאורך כל זה, את הפעולות הבאות על-ידי החלת הקציר מדיה מעת לעת. - לאסוף המדבקות של פייה על-ידי הסרתם מהמעי במספריים מעוגלים. להשתמש ויבתר היקף או זכוכית מגדלת במידת הצורך (למתחילים); התיקונים של פייה רוב צריך להיות גלוי לעין המיומנת. לאסוף המדבקות של פייה (אופייני) 5-11 המעי הדק. התיקונים של המקום Peyer בתקשורת קר הקציר עבור שלבים בידוד מאוחר יותר.
הערה: של Peyer תיקונים קטנים, בעיקר סביב גבשושיות וזיזים הדקיקים שבדופן החיצוני מול הקו של מצע המעי המצורף. - השתמש הצד השטוח של שקופית מלקחיים, בעדינות לכיוון מעי התריסריון לגרש את תוכן צואתי, ריר. אני חוזר פעם להסיר את רוב הליחה.
הערה: הסרת לא שלם של ריר ניתן להקטין את הכדאיות תא, תשואות. ובכל זאת, יש להקפיד להחליק המעי בעדינות כדי למנוע בנוכחות אחר villi או פגיעה קרום המרתף. - להשתמש במספריים בסדר עם קצה קהה על נקודה אחת, להוסיף הצד הקהה לתוך המעי, וחתך המעי longitudinally מן התריסריון אל מעי. רוחבית לחתוך המעי שנפתחו לחתיכות ~ 2-ס מ. מקם את החלקים במעיים צינור חרוטי 50-mL עם 25 מ ל מדיה קר הקציר עבור שלבים בידוד מאוחר יותר.
הערה: לשמור את המספריים לחלח עם מדיה תסייע להם להחליק ללא מאמץ דרך המעי.
3. בידוד של לימפוציטים מן האתרים אינדוקטיבית
- לבודד לימפוציטים מ- MLN על-ידי בריא בעדינות דרך מסננת תא 70-מיקרומטר באמצעות הבוכנה של מזרק 3-mL. רחץ תא strainer עם 5 מ של קציר קר מדיה.
- צניפה MLN-תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.
הערה: מאגר פירוק תאי הדם האדומים ניתן להסיר תאי דם אדומים אם הדימום אירעה במהלך ההסרה. - לבודד לימפוציטים מ טלאים של פייה מאת המקננת טלאים של פייה 15-mL צינור חרוטי המכיל 5 מ"ל prewarmed collagenase פתרון 37 ° C ו- 220 סל"ד למשך 30 דקות.
- מערבולת 15 s בהגדרה המרבית ואת המסנן מתעכל רקמות, תגובת שיקוע לתוך צינור חרוטי 50-mL דרך מסננת תא 70-מיקרומטר. בעדינות מביצועם החלקים הנותרים רקמות באמצעות הבוכנה של מזרק 3-mL ולשטוף את מסננת תא 5 מ של קציר קר מדיה.
- גלולה תיקון התאים של פייה על ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 ° C, resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.
הערה: Peyer של בידוד טלאים אולי יש לימפוציטים פרופריה. מוסקולריס מזהמים לימפוציטים intraepithelial הנרתיק.
4. בידוד של לימפוציטים intraepithelial הנרתיק של המעי הדק
- לשטוף את החלקים של המעי הדק שלוש פעמים עם 25 מ של קציר קר מדיה על ידי היפוך הצינור 10 פעמים, נותן את החלקים במעיים ליישב שנוטפת תגובת שיקוע.
הערה: חתיכות רקמה להתפשר בקלות לתחתית של התחתית. אם הם לא, זה אינדיקציה כי מצע המעי/שמנה מדי נשאר צמוד או שהם קשורים בועת אוויר. - להוסיף 20 מ של פתרון DTE prewarmed 50-mL צינור חרוטי המכילה חתיכות במעי ולהעביר ל 50-mL siliconized Erlenmeyer בקבוקון המכיל בר-מערבבים. מערבבים ב 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש סל ד 220 על פגים במשך 20 דקות מגנט גדול מבחוץ + בקבוקי שתייה צידניות להחזיק את stir-בר ולהעביר את רקמת ואת הפתרון בחזרה אל הצינור חרוט 50-mL.
- מערבולת הצינור מקסימום הגדרת העברה ס' 10 את תגובת שיקוע לתוך צינור חרוטי 50-mL החדש דרך מסננת תא 70-מיקרומטר נזהר לשמור את חתיכות רקמה על הצינור המקורי. אל תמחק את תגובת שיקוע; תגובת שיקוע מכיל לימפוציטים intraepithelial הנרתיק. צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 10 מ"ל ולאחסן על קרח.
- להוסיף 20 מ של פתרון DTE prewarmed 50-mL צינור חרוטי המכילה חתיכות במעי ולהעביר חזרה ל 50-mL siliconized Erlenmeyer הבקבוק המכילה בר-מערבבים. מערבבים ב 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש סל ד 220 על פגים במשך 20 דקות מגנט גדול מבחוץ + בקבוקי שתייה צידניות להחזיק את stir-בר ולהעביר את רקמת ואת הפתרון בחזרה אל הצינור חרוט 50-mL.
הערה: DTE הוא סוכן צמצום המעשיר לימפוציטים intraepithelial הנרתיק. - מערבולת הצינור מקסימום הגדרת העברה ס' 10 את תגובת שיקוע דרך מסננת תא 70-מיקרומטר לתוך הצינור הקודם המכיל תאים תגובת שיקוע של הטיפול DTE הראשון (מתוך שלב 4.3).
הערה: מעיים החלקים הנותרים משמשים כדי לבודד לימפוציטים מ פרופריה. מוסקולריס. בקרת איכות: פיסת רקמה יכול להיות מוסר ובדק בהיסטולוגיה כדי להבטיח בתאי אפיתל נוכחים קרום המרתף לא נפגע. - צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו את תגובת שיקוע ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא ב 8 מ של 44% פתרון די. ג'י בטמפרטורת החדר (RT).
- העברה מ ל 8 44% DG פתרון תא ההשעיה לתוך ø 17 מ"מ x 100 בסגנון מ מ 14-mL צינור עגול-התחתון פוליפרופילן. ביסוד 5 מ של RT 67% DG פתרון. צנטריפוגה ב 1600 × g למשך 20 דקות ב RT ללא שימוש בבלמים.
הערה: ייתכן pretreated צינורות עם סרום שור כדי למנוע תאים נדבקות הקירות שפופרת. - שימו לב כי התאים קיימא להקים להקה (באפי המעיל)-הממשק 44% 67%, תאים מתים כמה תאי האפיתל הם בסרט mucoid בחלק העליון של מעבר הצבע, כדוריות דם אדומות הם בגדר. להסיר את השכבה העליונה של המילוי ההדרגתי אל תוך ~ 2 ס מ של הממשק על ידי השאיפה ואקום. השתמש פיפטה פסטר כדי לקצור את המעיל באפי-הממשק ומעבירים אותם אל צינור חרוטי 50-mL המכיל 40 מ"ל הקציר קר מדיה.
- צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.
5. בידוד של לימפוציטים פרופריה. מוסקולריס מן המעי הדק
- להסיר תאים אפיתל רקמת המעי חתיכות על-ידי הוספת 25 מ של פתרון EDTA prewarmed הבקבוקון המכיל את החלקים הנותרים מעיים. מערבבים את הבקבוק ב 37 ° C ו סל ד 220 על פגים במשך 30 דקות להשתמש מגנט גדול מבחוץ + בקבוקי שתייה צידניות כדי להחזיק את stir-בר ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה תוך שמירה על חתיכות מעיים בתוך הבקבוק.
הערה: (i) EDTA היא chelator סידן מטרות סידן תלוית צמתי ומקדם הניתוק של תאי אפיתל המעי. (ii תגובת שיקוע) צריך להיות מעונן, עשוי לשמש כדי לבודד את חברת החשמל אם רצוי באוסף שלהם. - חזור על שלב 5.1.
הערה: תגובת שיקוע צריך להיות פחות מעונן בעקבות זה הדגירה. בקרת איכות: פיסת רקמה יכול להיות מוסר ובדק בהיסטולוגיה כדי להבטיח בתאי אפיתל המעי הוסרו קרום המרתף לא נפגע. מדגם תגובת שיקוע, גם יכול להיות מוערך על ידי cytometry זרימה כדי לאשר את לויקוציטים (CD45+ תאים) נעדרים. - להוסיף 50 מ של RT הקציר מדיה הבקבוקון. מערבבים בקצרה עם מגנט. תנו חתיכות מעיים ליישב ולמחוק בקפידה את תגובת שיקוע.
הערה: שלב זה מבטיח את ההסרה של EDTA לפני collagenase עיכול כמו EDTA חלבונית collagenase על ידי chelating הסידן שהוא קריטי לתפקוד collagenase. - להוסיף 30 מ של פתרון prewarmed collagenase הבקבוקון ומערבבים חתיכות מעיים 37 ° C ו סל ד 220 על פגים למשך 45 דקות.
- העברת רקמות מתעכל ואת תגובת שיקוע צינור חרוטי 50-mL על-ידי סינון דרך מסננת תא 70-מיקרומטר. בעדינות מביצועם הנותרים חתיכות רקמה באמצעות הבוכנה של מזרק 3-מ ל מחית דרך המסנן. לשטוף את המסנן עם 10 מ"ל של קציר קר מדיה.
- צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא ב 8 מ של טמפרטורת הסביבה 44% DG פתרון.
- העברה מ ל 8 44% DG פתרון תא ההשעיה לתוך ø 17 מ"מ x 100 בסגנון מ מ 14-mL צינור עגול-התחתון פוליפרופילן. ביסוד 5 מ של טמפרטורת הסביבה 67% DG פתרון. Centrifuge את מעברי צבע בטמפרטורת החדר ו g × 1600 עבור 20 דקות עם בלי בלמים.
- להסיר את שכבת השומן למעלה על ידי השאיפה ואקום. השתמש פיפטה פסטר לקצור את המעיל באפי ממשק, העברת צינור חרוטי 50-mL המכיל 40 מ"ל הקציר קר מדיה.
- צניפה תאים על-ידי צריך שתוציאו ב g × 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר תא בתקשורת הקציר קר 1 מ"ל. ספירת התאים קיימא באמצעות trypan blue הדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מתואר (איור 1). לימפוציטים בתוך mucosa מעיים אינדוקטיבית, אתרי אפקטור מאורגנים במובהק. Peyer של ותיקונים (PP) בלוטות לימפה mesenteric (MLN) מכילים לימפוציטים מאורגן היטב באזורים תא T, B-cell זקיקים, ואילו האפיתל במעי כוללת לימפוציטים המופצים יותר diffusely. פרופריה. מוסקולריס (LP) מכיל הן לימפוציטים diffusely מבוזרת והן לימפוציטים הכלול בתוך מבנים הלימפה מאורגן כמו זקיקי הלימפה מבודד (איי) ו- cryptopatches. כל תא החיסון מעיים מאופיין גם הרכב ייחודי של לימפוציטים קבוצות משנה (איור 2). MLN הוא יוכפל לאחר המרתו המורכב αβ T תאים (~ 70%), בעוד PP לימפוציטים הם בעיקר בתאי B (~ 80%). קומפוזיציה לימפוציט LP הוא במידה רבה תלויי-מתח אבל מורכב בעיקר תאים αβ T ותאי B. נבדל התאים מעיים אחרים, לימפוציטים המתגוררים האפיתל הם בעיקר בתאי T γδ (כ 60%) ואת αβ T תאים עם בעיקרו של דבר אין תאי B. הפרופורציות ברורים של αβ T cell קבוצות משנה קיימים גם בתוך מקומות נפרדים אנטומיים של המעיים. התאים αβ T באריך הנגן הם בעיקר CD4+ T תאים (~ 70%), בעוד CD8α+ T תאים (~ 85%) שולטים בתא intraepithelial הנרתיק לימפוציטים (אישור IEL). CD8α+ αβ T תאים בתוך התאים LP ו אישור IEL לבטא את homodimer CD8αα או את heterodimer CD8αβ ואילו האתר אינדוקטיבית CD8α+ αβ T תאים יוכפל לאחר המרתו לבטא את heterodimer CD8αβ (איור 3). הרוב המכריע של γδ T תאים בתוך התא אישור IEL אקספרס גם CD8α, בעוד γδ T תאים הנמצאים בחוסר MLN CD8α (איור 3). בלי קשר לדברים כלליים, ההרכב של לימפוציטים קבוצות משנה יכול להשתנות בין זנים העכבר, עשוי להיות משתנה עם הגיל או מחלה. ככזה, ניתוח זהיר של לימפוציטים אוכלוסיות בתוך רירית המעי-מצב יציב צריכה להתבצע בנימה רקע מנוצל עבור המניפולציות ניסיוני.
תא התשואה יכול להשתנות במידה רבה בהתאם הלחץ ואת הגיל של עכברים, ובתנאים ניסיוני המשמש. רווקה, חיה תאים אפשר לסמוך על hemocytometer או מכונת ספירה תא אוטומטית באמצעות trypan blue הדרה. המספר של לימפוציטים מחושבים: תא ספירת × CD45+ תאי (%) שער 3 × לימפוציטים (%) בשער 4 (איור 2). כ 15 × 106 MLN לימפוציטים, 5-10 × 106 PP לימפוציטים, 2-5 × 106 LP לימפוציטים ו- 3-6 × 106 אישור IEL ניתן לקבל מ- C57Bl/6 או Balb/c העכבר 8 ל 12-בת תמימה. לחלופין, חרוזים ספירה מבוססת זרימה ניתן לכמת תא אוכלוסיות לפרסמה כי איבוד תאים מתרחשת במהלך תהליך צביעת. בסופו של דבר, עקביות ספירת הטכניקה חייבת להישמר בתוך המעבדה על מנת להבטיח כי ניתן לבצע השוואות המתאים לאורך ניסויים.
ב פרוטוקול זה, משמש לטיפול DTE להעשיר את אישור IEL, שבעקבותיה באה EDTA טיפול להסרת IEC לבידוד אופטימלי של לימפוציטים מועשר. שני טיפולי DTE מספיקים לבודד > אישור IEL-95%. ניתן למצוא מספר קטן מאוד של לימפוציטים גם בטיפול EDTA. לימפוציטים אלה דומים תערובת של לימפוציטים אישור IEL ו- LP (איור 4). השוואה של DTE טיפול וטיפול משולב DTE-EDTA לבודד את אישור IEL גם בוצעה. טיפול DTE-EDTA בשילוב מגבירה את חברת החשמל זיהום בהכנת אישור IEL (איור 5) ומקטינה את התשואות הסופי של תאים חיסוניים בשידור חי לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע מומלץ לבודד לימפוציטים מן התאים מעיים. הוא מסיר תאים מתים, רבים בתאי אפיתל, ריר, לקדם את הבידוד של לימפוציטים מועשר ושעות באופן דרסטי הפחתת cytometry זרימה רכישה (איור 6).
איור 1 . תרשים זרימה של בידוד פרוטוקול. DTE, dithioerythritol. EDTA, חומצה ethylenediaminetetraacetic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . Cytometry זרימה gating אסטרטגיה לאוכלוסיות לימפוציט רקמות מעיים. המתלים תא בודד שהוכנו מן בלוטות לימפה mesenteric (MLN), פרופריה. מוסקולריס (LP), של פייה טלאים (PP) תא intraepithelial הנרתיק לימפוציטים (אישור IEL) היו מוכתמים הכדאיות ניתן לתיקון צבע (למשל חי/מת) הבא התווית על-ידי פלורסנט נוגדנים: CD45 זיהוי תאים hematopoietic, CD19 עבור תאים B, CD3ε עבור T תאים, תא T β קולטן (TCR) עבור αβ T תאים, TCRδ עבור γδ T תאים, CD8α על CD8α+ αβ T CD4 עבור CD4 והתאים+ αβ T תאים. שער 0 הראה קדימה פיזור (FSC) - A לצד פיזור (האס) - A מאפיינים. שער 1 לזהות תאים בודדים. שער 2 לזהות תאים חיים. שער 3 לזהות תאים hematopoietic. שער 4 לימפוציטים מזוהה בהתבסס על מאפייני FSC-A/האס-A. שער 5 לזיהוי תאי T ותאי B. שער 6 מזוהה αβ T תאים ותאים γδ T בין תאי T הכולל. שער 7 מזוהה CD8α+ ו CD4+ T תאים באוכלוסיה αβ T cell. אחוזים (בגופן אדום) בתוך חלקות מדומה תואמות התדירות של תאים בתוך השער המצוין בקרב האוכלוסייה הורים הקודמת. שער 0 ושער 1 להציג אירועים הכולל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . OfCD8α פנוטיפ+ αβ T תאים, γδ T תאים ברקמות מעיים. הביטוי של CD8β על ידי CD8α+ αβ T תאים וביטוי CD8α על ידי תאים γδ T מתוארים. אחוזים (בגופן אדום) בתוך היסטוגרמות תואמות התדירות של תאים המבטאים דה מרקר המצוין בין האוכלוסייה הורים המצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . ההרכב של לימפוציטים מן הטיפולים DTE EDTA, collagenase. אסטרטגיה המגביל ההורים היא כמו באיור 2. שער 5 לזיהוי תאי T ותאי B. שער 6 מזוהה αβ T תאים ותאים γδ T בין תאי T הכולל. שער 7 מזוהה CD8α+ ו CD4+ T תאים באוכלוסיה αβ T cell. אחוזים (בגופן אדום) בתוך חלקות מדומה תואמות התדירות של תאים בתוך השער המצוין בקרב האוכלוסייה הורים הקודמת. לימפוציטים מבידוד EDTA לשאת דמיון תערובת של לימפוציטים אישור IEL ו- LP מבודד DTE וטיפולי collagenase, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . השוואה של DTE טיפול, טיפול משולב DTE-EDTA בידודו של אישור IEL. טיפול DTE בוצעה לפי פרוטוקול זה. אישור IEL נאספו לאחר טיפולים DTE ולפני הטיפולים EDTA. טיפול DTE-EDTA בשילוב בוצעה בריכוזים אותו בשימוש פרוטוקול זה, אבל באותו זמן. את מאפייני FSC-A/האס-A, הכדאיות ואת האחוז של CD45+ hematopoietic והתאים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . השפעת צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע על הטוהר של ההכנות לימפוציט אישור IEL ו- LP- המתלים ותא מבודד לפי פרוטוקול זה נתון צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע או נותחו על ידי cytometry זרימה ישירות. את מאפייני FSC-A/האס-A, הכדאיות ואת האחוז של CD45+ hematopoietic והתאים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול מפורט מוצג עבור הבידוד של לימפוציטים מן המעי הרירית אינדוקטיביים (MLN ו- PP) ואתרים אפקטור (LP ו אישור IEL תא). הפרוטוקול פותח כדי לאזן הקלט (זמן) והפלט (הכדאיות ואת התשואה) להגדיל את הפרודוקטיביות ואת תוצאות. הפרוטוקול מבטיח גם זיהום compartmental לחצות מינימלי בין תאים LP ו אישור IEL.
מספר פרוטוקולים עבור הבידוד של תאים חיסוניים מן המעי הדק העכבר היה שפורסמו3,4,5,6,7. רוב פרוטוקולים אלה מתמקדים לבודד את התאים החיסוניים מ אריך הנגן. האפיתל במעי הוא תא ברורים של אריך הנגן הוא נחשף ישירות לסביבה החיצונית, מורכב הרכב ייחודי של לימפוציטים. גישות האחרונים ביקשו ניתוח הכללית יותר של תפקוד מערכת החיסון במעי על ידי בחינת תאי המעי ברורים בעת ובעונה אחת כדי להבין את ההיבטים הייחודיים של תגובות חיסוניות המתרחשים תאים אלה וקשרי הגומלין ביניהם. לכן, רצוי פרוטוקול אמין עבור הבידוד של תאים חיסוניים מכל התאים האלה. שני טיפולי DTE מספיקים לבודד > 95% של אישור IEL, כמה חברת החשמל. EDTA מטרות תלויי סידן-צמתים, והוא יעיל כדי לנתק את החשמל. לכן, תגובת שיקוע של הטיפולים EDTA הבאים מהווים בעיקר חברת החשמל. ניתן למצוא מספר קטן מאוד של לימפוציטים תגובת שיקוע לאחר הטיפול EDTA; עם זאת, כ 20-fold לימפוציטים יותר מתקבלים מן השבר DTE. יתר על כן, לימפוציטים מהטיפול EDTA דומים אוכלוסיות מעורבות של אישור IEL ו- LP לימפוציטים (איור 4), אשר מרמז על LP שחורי־צוואר מזיהום villi וה קריפטה נזק. לכן, ב פרוטוקול זה, אישור IEL נאספים מהטיפול DTE לפני טיפול EDTA, למקסם את טוהר על ידי צמצום זיהום קרוס-תא. פרוטוקולים אחרים להשתמש dithiothreitol סדרתית (DTT)-EDTA טיפולים או טיפול משולב DTT-EDTA הבידוד של אישור IEL5,6,7. DTT אפימר של DTE, שניהם פועלים כסוכני צמצום. בפרוטוקולים אלה, DTT הוא דיווח להסיר רק ריר והוא EDTA משמש כדי לבודד אישור IEL. למרות ההשפעה של DTT, DTE לא הושווה ישירות, אישור IEL לאחר טיפול DTE או טיפול DTE-EDTA בשילוב הוערך. באופן לא מפתיע, בשילוב טיפול DTE-EDTA מגביר IEC זיהום בהכנת אישור IEL (איור 5) וירידה הנוכחות של מספר גדול של חברת החשמל אישור IEL התשואות לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. כמו EDTA יכול לגרום נזק כמה villi, כוכים, טיפול DTE-EDTA בשילוב עלול גם לגרום זיהום של לימפוציטים LP בהכנת אישור IEL או אובדן של LP תאים מן הבידוד LP. יתר על כן, ככל > 95% של אישור IEL הם בודדו אותנו מהמתרחש השבר DTE, DTE נפרד וטיפולי EDTA עדיפים. פרוטוקולים מסוימים לבודד לימפוציטים ללא שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה כדי להעשיר את התאים החיסוניים6. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לוקח זמן נוסף, אובדן של כמה תאים עלולה להתרחש. עם זאת, הוא מסיר תאים מתים, תאי אפיתל, ריר, המוביל אל אוכלוסיות לימפוציט מועשר (איור 6), אשר מסייע לשפר את הגילוי של אוכלוסיות קטנות של תאים ומפחית באופן משמעותי את רכישת זמן זרימה cytometry. צפיפות צנטריפוגה הדרגתי דיווחה את התוצאה יחס שונה של תאי פגוציט קבוצות משנה7; עם זאת, הרכב משנה לימפוציטים נורמלית זה עוזר במיוחד לבצע צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות עבור בידודו של אישור IEL בסך הכל, פרוטוקול מלא מוצג כדי לבודד לימפוציטים מועשר בר -קיימא בצורה אופטימלית של כל הרקמות מעיים כולל דיקור, אישור IEL עם זיהום קרוס-compartmental מינימלי.
זמן ניכר וטיפול חייב להילקח במהלך רקמות בידוד צעדים להגבלת זיהום בין ההכנות. הסרת לא שלם PP יכול להטות באופן משמעותי LP לימפוציטים. איי יכול לזהם גם ההכנות LP. עם זאת, ILF ניתן לראות בעין בלתי מזוינת, ולכן לא ניתן בניתוח להסיר לפני תהליך העיכול. העכבר שונים זנים יש מספר שונה של ILF14, אשר עשוי לתרום במידה רבה הרכבו משתנה של LP לימפוציטים בין זנים העכבר. בעת הסרת ליחה, הקפד המעי כדי למנוע נזק קרום המרתף ו- LP, אשר יכול לגרום זיהום LP של אישור IEL החלק בעדינות. אינדיקציה זיהום היא הנוכחות של מספר גדול של תאים B בהכנת אישור IEL. אישור IEL להכיל כמה תאים B (~ 1% או פחות), ואילו LPL יכול לקבל עד 60% B תאים בהתאם המתח העכבר. CD19 אבל לא B220 צריך לשמש כדי לזהות תאים B בתא LP ו אישור IEL, תאי T מעיים עשוי לבטא גם B22015. יתר על כן, רבים ותאי T מעיים עשוי לבטא מקרופאג מסורתי וסמנים DC כגון CD11b ו- CD11c, בהתאמה16. לכן, ראוי dump gating אסטרטגיות צריך להיות מנוצל כדי להבטיח ניתוח המתאים.
ניתן לשנות צעדים כדי להכיל את הצרכים של החוקרים. עיכול מכני עשוי להיות מספיק לבידוד לימפוציט PP-מצב יציב או collagenase עיכול של בלוטות הלימפה עשוי להקל על בידוד של כמה קבוצות משנה של לויקוציטים בעת דלקת. הסוג של collagenase בשימוש עשויה להיות השפעה משמעותית על הביטוי סמן משטח התא ואת הכדאיות טוהר LP-לימפוציטים-5,-17. המעי יכול לחתוך לחתיכות קטנות לעיכול collagenase, אשר עשוי להגדיל את תפוקת תא. עם זאת, זה גם מקטין את הכדאיות. זמן הדגירה עם collagenase עשוי להיות מותאם כדי למקסם את התשואה תוך מזעור של מות תאים, שמוביל מקסימלית התאוששות של תאים חיים. מעבדות שונות השתמש צפיפות שונה במקצת מעברי צבע כדי לבודד לימפוציטים. צפיפות 44% / 67% ומבוססת פרוטוקול מעבר הצבע מוצג כאן. חוקרים לבחון צפיפות שונה מעברי צבע שיתאים בצורה הטובה ביותר את הצרכים האישיים שלהם. אם מספר גדול יותר של לימפוציטים הם הרצויה, שני המעי הדק יכול להיות משולב DTE טיפולים, טיפולים EDTA, collagenase עיכול. אם המעיים יותר משני נדרשים לבחינת אירועים נדירים ביותר, ואז מומלץ כי המתלים תא בודד הם איחדו לאחר בידוד.
לימפוציטים מבודד יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף פנוטיפי פונקציונלי, גנומית. בעת ביצוע ניתוח תזרים cytometric, זה מאוד מומלץ תמיד השימוש הכדאיות צבענים, נוגדן anti-CD45 כדי לא לכלול תאים מתים ותאים שאינם hematopoietic, אשר יהיה מאוד לשפר את הניתוח. אם אוכלוסיית לימפוציטים טהור נדרשים, בתא מיון CD45+ תאים יחד עם סמנים אחרים של הבחירה יכולה להתבצע. ניתן להשתמש גם פאנינג על אנטי-CD8α-מצופה לוחות בידוד תאי T טהור אישור IEL מההכנה ועד כמו רוב אלה T תאים CD8α אקספרס. צילום פנורמי או מיון תא נדרש בדרך כלל תרבות של אישור IEL כפי מזהמות בתאי אפיתל יכול לעכב את אישור IEL הצמיחה. ניתן להוסיף תאים מזין כמו splenocytes תמים גם כדי לקדם את אישור IEL הישרדות בתרבות. אם מזינים משמשים, חשוב לנצל את התאים congenically לא תואמים כדי להבחין בין אוכלוסיות. זיהום חיידקי הוא לעיתים רחוקות בעיה בלימודים האקדמיים תפקודית לטווח קצר כמו קציר מדיה מכיל פניצילין, סטרפטומיצין, גנטמיצין. בנוסף, כביסה הפעולות הרבות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות להסיר את רוב החיידקים.
תהליך הבידוד הוא זמן רב ודורש איזון של טיפול, דיוק ומהירות לקבלת תוצאות אופטימליות. חייבים לבלות מספיק זמן כדי להבטיח מניפולציה נאותה של כל שלב תוך מזעור זמן בין הקרבה העכבר וקבלת השעיה תא בודד להגדיל את הכדאיות תא, התשואה. זה איזון עדין זה גם צוואר בקבוק למתחילים מנסה להשיג עקביות לבודד לימפוציטים עם הכדאיות גבוהה ועם תשואה. תהליך בידוד כולו החל מהמתת חסד העכבר להשגת השעיה שנספרו תא בודד לוקח שעה חוקר מנוסה כ 8 עבור עכברים 8. מומלץ לקבלת סיוע עכברים יותר 8 לייצר באיכות גבוהה ותוצאות לשחזור. חשוב להשתמש טיפול בעת השוואת לימפוציטים של רקמות אלה עם לימפוציטים הטחול, דם או רקמות הלימפה אחרות כמו incubations מקיף עלולה להוביל שינויים מלאכותיים המשויך הליך בידוד17. השוואות שגרתית של LP לאוכלוסייה אישור IEL באופן דומה שטופלו רקמות הלימפה להעריך אם דה מרקר עניין הוא מווסת במהלך לימפוציט בידוד רקמות מעיים. בעיות דומות הם גם הדאגה העיקרית בעת השוואת הפרופילים RNA מן המעיים עם אלה של רקמות הלימפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
B.S.S. נתמך על ידי מענק-NIH (R01 AI076457) וקרנות הניתנים על ידי האוניברסיטה בסטוני ברוק. Z.Q. נתמך על-ידי NIH הענק (K12 GM102778).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
