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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281
Automatic Translation
1, 1
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

Summary

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Abstract

El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal mediante la generación de respuestas tolerantes a antígenos dietéticos y bacterias comensales mientras que montar una respuesta inmune efectiva a enteropatógeno microbios. Además, ha quedado claro que la inmunidad local intestinal tiene un profundo impacto en la inmunidad sistémica y distante. Por lo tanto, es importante estudiar cómo se induce una respuesta inmune intestinal y lo que es los resultados inmunológicos de la respuesta. Aquí, se describe un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos del intestino inductivo como de Peyer tejido linfoide asociado a intestino y ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y efectoras como la lámina propia y la epitelio intestinal. Esta técnica asegura el aislamiento de un gran número de linfocitos de los tejidos intestinales pequeñas con óptima pureza, viabilidad y mínima contaminación compartimentación dentro de las limitaciones de tiempo aceptable. La capacidad técnica para aislar los linfocitos y otras células inmunes de los tejidos intestinales permite la comprensión de la respuesta inmune a infecciones gastrointestinales, cánceres y enfermedades inflamatorias.

Introduction

El tracto gastrointestinal (GI) tiene muchos pliegues y protuberancias que representa la interfaz más grande separando el cuerpo interno y el ambiente externo. El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal. Está constantemente expuesto a antígenos dietéticos, las bacterias comensales y microbios patógenos. Como tal, debe seguir siendo tolerante a antígenos alimentarios y bacterias comensales conservando la capacidad de generar rápidamente una respuesta inmune efectiva a microbios enteropatógeno1. El sistema inmune intestinal puede dividirse anatómicamente en inductivo, donde los linfocitos se activan por el antígeno que presenta las células con antígenos de la mucosa intestinal, y efectoras, donde ejercen determinados linfocitos activados de las funciones efectoras2. Los sitios inductivos constituyen la estructura linfoide organizada de placas de Peyer (PP) que examina la luz intestinal directamente a través de la acción de las células M especializadas y nodos de linfa mesentéricos drenantes regionales (MLN). Los sitios efectores consisten en la lámina propia (LP), que es el tejido conectivo debajo de la membrana basal y el epitelio intestinal, una capa de célula situado por encima de la membrana del sótano que contiene linfocitos intraepiteliales (IEL). Los linfocitos son los principales actores de la inmunidad adaptativa que median protección contra infecciones y cánceres y pueden también contribuir a la Inmunopatología de las enfermedades inflamatorias. Es importante y muy relevante para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos anatómicos mucosa para mejor entienden sus funciones inducción y efectoras.

Un protocolo relativamente simple y unificado para el aislamiento de los linfocitos de estos compartimentos se necesita que el número de investigadores explorar eventos inmunes que ocurren en el intestino está acelerando. Varios grupos de investigación han publicado protocolos que comparten varios procesos similares para aislar las células inmunes del ratón pequeños compartimentos intestinal3,4,5,6,7 . Sin embargo, hay varias diferencias técnicas entre ellos según el enfoque del protocolo individual. Por ejemplo, con el foco en el aislamiento de las células inmunes del LP, un protocolo analiza el impacto de varias digestiones enzimáticas en la viabilidad celular, expresión de marcadores de superficie celular y la composición de las células inmunes aislados5. Otro protocolo destaca un método rápido y reproducible para el aislamiento de linfocitos sin densidad centrifugación6. Por último, también existen protocolos específicos con el fin de aislar a los fagocitos mononucleares de capas diferentes de tejido del intestino delgado7. Aquí, se presenta un protocolo altamente reproducible que permite aislamiento secuencial de poblaciones linfocitarias del MLN, PP, LP y IEL compartimiento del intestino delgado.

Nos centramos en aislar poblaciones altamente purificadas de los compartimientos del LP y IEL, que son en gran parte libres de contaminantes de otros compartimentos intestinales. Esto ampliamente utilizado protocolo produce un alto rendimiento de linfocitos máximo puros y viables en tiempo aceptable restricciones4,8,9,10,11,12. Este protocolo también asegura el aislamiento de los linfocitos del compartimiento de LP y IEL con mínima contaminación compartimentación, lo que permite una oportunidad buena fe para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos. Los linfocitos aislados pueden ser sometidos a manipulaciones más como análisis cytometric del flujo o análisis funcional. Este protocolo se ha aplicado con éxito para el aislamiento de linfocitos de ratón intestino delgado y colon durante infecciones por bacterias como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis infecciones y afecciones inflamatorias como la colitis inducida por químicos y patógenos. Este protocolo también puede utilizarse para aislar las células inmunes innatas como las células dendríticas, macrófagos, neutrófilos y monocitos de ratón intestino delgado y colon.

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Protocol

Todos los experimentos en animales eran realizados de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de salud y aprobados por el pedregoso del arroyo Universidad institucional Animal cuidado y uso.

Nota: Asegúrese de que todas las aprobaciones se conceden antes de realizar procedimientos.

1. preparación de la solución

  1. HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y gentamicina), 100 ×
    1. Mezclar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g de L-glutamina 200 mM (final), 1 × 106 U penicilina (2.000 U/mL final), la estreptomicina 1 g (2 mg/mL final) y gentamicina 2.5 mg (5 μg/mL final). Añadir RPMI 1640 a 500 mL. Ajustar el pH a 7.5 con NaOH (antes del ajuste, el búfer es amarillo y naranja con un pH alrededor de 6.0). Filtro de esterilización usando un filtro de 0.45 μm. Alícuota y conservar a-20 ° C hasta por 1 año o a 4 ° C durante 1 mes.
  2. De tampón HEPES-bicarbonato, 10 x
    1. 23,8 g HEPES (100 mM final), de la mezcla 21 g NaHCO3 (250 mM final) y añadir agua a 1000 mL. Ajustar pH a 7.2 con HCl. filtro esterilice usando un filtro de 0.45 μm. Almacenar a temperatura ambiente. El pH cambia con el tiempo. Volver a ajustar periódicamente el pH.
  3. Cosecha media (~ ratones botella 1/2)
    1. A 500 mL de RPMI 1640, añadir 25 mL inactivadas por calor suero bovino fetal (5% final) y 5 mL 100 × HGPG. Almacenar hasta 6 meses a 4 ° C.
  4. Solución de Dithioerythritol (DTE) (40 mL/pequeña del intestino)
    1. Mezcle 50 mL 10 × solución salina equilibrada de Hanks, Ca2+- y Mg2+-gratis, 50 mL 10 × bicarbonato de HEPES buffer y 50 mL inactivadas por calor suero fetal bovino (10% final). Añadir 350 mL H2O y 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM final). Preparar esta fresca antes de su uso.
  5. Solución de ácido (EDTA) etilendiaminotetraacético (50 mL/pequeña del intestino)
    1. Mezcle 50 mL 10 × solución salina equilibrada de Hanks, Ca2+- y Mg2+-libre con 5 mL 100 × HGPG. Añadir 445 mL H2O. Añadir 260 μl EDTA de 0,5 M/100 mL (1,3 mM final). Preparar esta fresca antes de su uso.
  6. Solución de colagenasa (30 mL/LP)
    1. A 500 mL RPMI, añadir 50 mL de SFB (10% FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M de MgCl2 (final de 1 mM) y 1 mL 0.5 M CaCl2 (final de 1 mM). Añadir colagenasa, tipo I (100 U/mL final). Preparar esta fresca antes de su uso.
  7. Soluciones de (DG) gradiente de densidad
    1. Prepare 1 × DG solución mezclando solución 90 mL DG (consulte la Tabla de materiales) con 10 mL de PBS de 10 x. Mantener estéril a 4 º C.
    2. Preparar solución DG 44% (8 mL/IEL, 8 mL/LP) mediante la mezcla de 44 mL de solución madre 1 × DG y 56 mL de RPMI 1640. Preparar esta fresca antes de su uso.
    3. Preparar solución DG de 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP) mezclando 67 mL de solución stock de 1 × DG y 33 mL de RPMI 1640. Preparar esta fresca antes de su uso.

2. aislamiento de los ganglios linfáticos mesentéricos, los intestinos y placas de Peyer parches

  1. Eutanasia el ratón con narcosis por dióxido de carbono y la dislocación cervical secundaria. Coloque el ratón en su parte posterior y rociar con etanol al 70%. Utilice tijeras para hacer una incisión del midline y abrir la piel y pared abdominal para exponer la cavidad peritoneal.
  2. Ubicar el ciego y utilizar pinzas para bajar suavemente el intestino ciego. Utilice pinzas para mover cuidadosamente el intestino delgado hacia la derecha, exponiendo toda la cadena MLN, que está alineada con los dos puntos.
    Nota: Un mapa de los nodos de linfa mesentéricos cadena y linfático drenaje intestinal era anteriormente representó13.
  3. Identificar el nodo de la parte inferior de la cadena, situado más cercano al ciego. Utilizar un sistema de pinzas para sujetar el mesenterio o grasa alrededor y sacar suavemente la cadena MLN del fondo a la cima por la grasa de alrededor del nodo de linfa con otro juego de pinzas de tweezing.
  4. Coloque la cadena MLN sobre una toalla de papel humedecida con media cosecha. Quitar grasa mesenterio la cadena en la torre de papel y sacar la grasa con dos juegos de pinzas. Lugar el MLN en los medios de cosecha fría para pasos posteriores de aislamiento.
    Nota: se desaconseja la manipulación (i) directa de los nodos. Sujete el mesenterio o grasa alrededor de ellos. (ii) es fundamental para eliminar tanta grasa mesenterio como sea posible para mejorar la viabilidad de las células.
  5. Corte de intestino delgado por debajo de la esfinge pilórica y arriba el ciego con unas tijeras. Sacar el intestino poco a poco del íleon al duodeno mediante un sistema de pinzas mientras se retira el mesenterio o grasa adjuntado con otro conjunto de pinzas.
  6. Colocar el intestino en una toalla de papel humedecida con media cosecha y burlan cualquier restante mesentery o grasa apagado con dos juegos de pinzas.
    Nota: () Asegúrese de quitar tanta grasa mesenterio como sea posible para el rendimiento óptimo de la célula y viabilidad. (ii) mantener el intestino humedecido a lo largo de este y los siguientes pasos aplicando medios de cosecha periódicamente.
  7. Recoger de Peyer quitándolos del intestino con tijeras curvas. Use una disección alcance o lupa si es necesario (principiantes); mayoría de Peyer debe ser visibles para el ojo entrenado. Recoger 5-11 (típico) placas de Peyer del intestino. Parches lugar placas de Peyer en los medios de cosecha fría para pasos posteriores de aislamiento.
    Nota: Placas de Peyer están pequeñas, principalmente redondas protuberancias en la pared intestinal externa frente a la línea de fijación del mesenterio.
  8. Utilice el lado plano de la pinza y suavemente Deslice desde el duodeno hacia el íleon para expulsar moco y contenido fecal. Repetición una vez para eliminar la mayor parte del moco.
    Nota: Retiro incompleto del moco puede disminuir la viabilidad celular y rendimiento. Sin embargo, asegúrese de deslizar el intestino suavemente para evitar la extracción de vellosidades o dañar la membrana del sótano.
  9. Utilice tijeras finas con un extremo romo de un punto, introduzca el extremo embotado en el intestino y el intestino abierto longitudinalmente desde el duodeno al ileon. Corte lateralmente el intestino abierto en trozos de 2 cm. Colocar los intestinales en un tubo cónico de 50 mL con medios de cosecha fría de 25 mL para pasos posteriores de aislamiento.
    Nota: Mantener las tijeras humedecidas con los medios de comunicación les ayudará deslice sin esfuerzo a través del intestino.

3. aislamiento de linfocitos a los sitios inductivos

  1. Aislar los linfocitos del MLN saldándose suavemente a través de un tamiz de celular 70 μm utilizando el émbolo de una jeringa de 3 mL. Lave el filtro celular con 5 mL de medio de cosecha fría.
  2. Pelotilla MLN-células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.
    Nota: tampón de lisis de glóbulos rojos puede utilizarse para extraer células de sangre rojas si el sangrado se produjo durante la extracción.
  3. Aislar los linfocitos de las placas de Peyer por incubación de placas de Peyer en un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL precalentado colagenasa solución a 37 ° C y 220 rpm por 30 min.
  4. Vortex por 15 s en posición de máxima potencia y filtro digiere tejido y sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL a través de un tamiz celular de 70 μm. Suavemente se disocian las restantes piezas de tejido con el émbolo de una jeringa de 3 mL y lavar el filtro celular con 5 mL de medio de cosecha fría.
  5. Las células de parches de Peyer de pellets por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.
    Nota: Aislamiento de parches de Peyer pueden tener algunos contaminantes los linfocitos de la lámina propia y linfocitos intraepiteliales.

4. aislamiento de los linfocitos intraepiteliales del intestino

  1. Lave los trozos de intestino tres veces con 25 mL de medio de cosecha fría por inversión del tubo 10 veces, dejando las piezas intestinales resolver y verter fuera el sobrenadante.
    Nota: Piezas de tejido deben instalarse fácilmente a la parte inferior del tubo. Si no lo hace, es un indicio de que demasiada grasa mesenterio queda sujeta o se asocian con una burbuja de aire.
  2. Añadir 20 mL de solución DTE precalentada para el tubo cónico de 50 mL que contiene piezas del intestino y transferir a un matraz de Erlenmeyer siliconado 50 mL, que contiene una barra de agitación. Remover a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 20 min Use un imán grande en el exterior del frasco para mantener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución hacia el tubo cónico de 50 mL.
  3. Vórtice el tubo en el máximo ajuste de transferencia s. 10 el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL nuevo a través de un tamiz de celular 70 μm teniendo cuidado de mantener las piezas de tejido en el tubo original. Desechar el sobrenadante; el sobrenadante contiene linfocitos intraepiteliales. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 10 mL y almacenar en hielo.
  4. Añadir 20 mL de solución DTE precalentada para el tubo cónico de 50 mL que contiene piezas del intestino y la transferencia hacia el matraz de Erlenmeyer siliconado 50 mL, que contiene una barra de agitación. Remover a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 20 min Use un imán grande en el exterior del frasco para mantener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución hacia el tubo cónico de 50 mL.
    Nota: DTE es un agente reductor que enriquece los linfocitos intraepiteliales.
  5. Vórtice el tubo en el máximo ajuste de transferencia s. 10 el sobrenadante a través de un tamiz celular de 70 μm al tubo anterior que contiene células partir del sobrenadante del primer tratamiento del DTE (desde el paso 4.3).
    Nota: Las restantes piezas intestinales se utilizan para aislar los linfocitos de la lámina propia. Control de calidad: Un trozo de tejido se puede quitar y comprobado histológicamente para asegurar que las células epiteliales están presentes y la membrana basal está intacta.
  6. Pellet de células por centrifugación el sobrenadante a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 8 mL de solución DG 44% a temperatura ambiente (RT).
  7. Transferencia de la suspensión de la solución/célula de 8 mL de 44% DG en un 17 mm ø x 100 mm estilo tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Arpillera con 5 mL de solución de DG RT 67%. Centrifugar a 1600 × g por 20 min a temperatura ambiente sin utilizar el freno.
    Nota: Los tubos pueden ser pretratados con suero bovino para evitar que las células se adhieran a las paredes del tubo.
  8. Tenga en cuenta que células viables forman una banda (buffy coat) en la interfaz de 44% a 67%, las células muertas y algunas células epiteliales están en una película mucoide en la parte superior del gradiente, y son los glóbulos rojos en el sedimento. Quitar la capa superior del degradado dentro de ~ 2 cm de la interfaz por aspiración al vacío. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa buffy en la interfaz y transferirlos a un tubo cónico de 50 mL que contiene medios de cosecha fría 40 mL.
  9. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.

5. aislamiento de linfocitos de la lámina propia del intestino

  1. Quitar las células epiteliales de piezas de tejido intestinal añadiendo 25 mL de solución EDTA precalentado al matraz que contiene las restantes piezas intestinales. Frasco de agitación a 37 º C y 220 rpm en un agitador magnético durante 30 minutos utilizar un imán grande en el exterior del matraz de sostener la barra de agitación y descartar cuidadosamente el sobrenadante manteniendo piezas intestinales dentro de la cubeta.
    Nota: (i) el EDTA es un quelante del calcio que apunta a las ensambladuras dependiente de calcio y promueve el desprendimiento de células epiteliales intestinales. (ii) el sobrenadante debe ser nublado y puede utilizarse para aislar IEC desearlo su colección.
  2. Repita el paso 5.1.
    Nota: El sobrenadante debe ser menos nublado después de la incubación. Control de calidad: Un trozo de tejido se puede quitar y comprobado histológicamente para asegurar que se han eliminado las células epiteliales intestinales y la membrana basal está intacta. Una muestra del sobrenadante también puede evaluarse mediante citometría de flujo para confirmar que los leucocitos (CD45+ células) están ausentes.
  3. Añadir 50 mL de medio de cosecha RT en el matraz. Mezclar brevemente con un imán. Que piezas intestinales resolver y eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
    Nota: Este paso garantiza la eliminación de EDTA antes de la digestión de la colagenasa como EDTA desactiva colagenasa por quelantes del calcio que es esencial para la función de la colagenasa.
  4. Añadir 30 mL de solución de colagenasa precalentado al matraz y agite intestinales piezas a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 45 minutos.
  5. Transferencia de tejido digerido y el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL por filtración a través de un tamiz celular de 70 μm. Suavemente disociar restantes piezas de tejido mediante el émbolo de una jeringa de 3 mL el puré a través del filtro. Lavar el filtro con 10 mL de medio de cosecha fría.
  6. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 8 mL de solución DG de 44% de temperatura ambiente.
  7. Transferencia de la suspensión de la solución/célula de 8 mL de 44% DG en un 17 mm ø x 100 mm estilo tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Arpillera con 5 mL de solución de temperatura ambiente 67% DG. Centrifugue los gradientes en temperatura y 1600 × g por 20 min sin freno.
  8. Retire la capa de grasa en la parte superior por aspiración al vacío. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa buffy en el interfaz y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mL que contiene medios de cosecha fría 40 mL.
  9. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.

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Representative Results

Se muestra una representación esquemática del Protocolo (figura 1). Los linfocitos de la mucosa intestinal inductiva y sitios efectores se organizan claramente. Peyer de parches (PP) y nodos de linfa mesentéricos (MLN) contienen linfocitos en áreas bien organizadas de células T y folículos de células B, mientras que el epitelio intestinal contiene linfocitos que se distribuyen más difusamente. La lámina propia (LP) contiene linfocitos difusamente distribuidos y linfocitos dentro de estructuras linfoides organizadas como folículos linfoides aislados (ILF) y cryptopatches. Cada compartimiento inmune intestinal también se caracteriza por una composición única de los subconjuntos del linfocito (figura 2). El MLN es predominantemente compuesto por células de T del αβ (~ 70%), mientras que los linfocitos de la PP son sobre todo las células de B (~ 80%). Composición de linfocito de LP es en gran parte dependiente de la cepa pero principalmente compuesto de células B y células de T del αβ. Distinto de los otros compartimientos del intestinales, los linfocitos que residen en el epitelio son principalmente células de T del γδ (~ 60%) y las células de T del αβ esencialmente sin las células B. Distintas proporciones de subconjuntos de la célula de T αβ también existen en distintas localizaciones anatómicas de los intestinos. Las células de T del αβ en el LP son principalmente CD4+ T de las células (~ 70%), mientras que CD8α+ T las células (~ 85%) predominan en el compartimento de linfocitos intraepiteliales (IEL). CD8α+ las células de T del αβ dentro de los compartimientos del LP y IEL expresan el homodímero CD8αα o el heterodímero CD8αβ mientras que sitio inductivo CD8α+ predominantemente de células de T del αβ express el heterodímero CD8αβ (figura 3). La mayoría de las células de T del γδ en el compartimiento de IEL también expresa CD8α, mientras que las células de T del γδ en la falta MLN CD8α (figura 3). Independientemente de Generalidades, la composición de los subconjuntos del linfocito puede variar entre cepas de ratón y puede ser alterada con la edad o enfermedad. Como tal, debe realizarse un análisis cuidadoso de las poblaciones de linfocitos en la mucosa intestinal en estado estacionario en la cepa de fondo utilizada para las manipulaciones experimentales.

Rendimiento de la célula puede variar enormemente dependiendo de la cepa y edad de los ratones y condiciones experimentales utilizadas. Pueden contarse solo, energizadas las células en un hemocitómetro o una máquina de recuento celular automatizado mediante exclusión del azul tripán. El número de linfocitos se calcula como: célula cuenta × CD45 (%) de las células+ en puerta 3 × linfocitos (%) en la puerta 4 (figura 2). Aproximadamente 15 × 106 MLN los linfocitos, los linfocitos el 5-10 × 106 PP, 2-5 × 106 LP linfocitos y 3-6 × 106 IEL pueden obtenerse un ratón C57Bl/6 y Balb/c de 8 a 12 semanas de edad ingenuo. Como alternativa, basada en el flujo de granos cuentas pueden utilizarse para cuantificar poblaciones de células con la salvedad de que la pérdida de la célula ocurre durante el proceso de tinción. En última instancia, se debe mantener consistencia en la técnica de contar dentro del laboratorio para asegurar que se puedan hacer comparaciones adecuadas a través de experimentos.

En este protocolo, tratamiento DTE se usa para enriquecer IEL, que es seguida por el tratamiento de EDTA para eliminar IEC para el óptimo aislamiento de linfocitos muy enriquecidos. Dos tratamientos de DTE son suficientes para aislar > 95% de IEL. Una cantidad muy pequeña de linfocitos puede encontrarse también en el tratamiento de EDTA. Estos linfocitos se asemejan a una mezcla de linfocitos de la IEL y de LP (figura 4). También se ha realizado una comparación del tratamiento del DTE y tratamiento combinado de DTE-EDTA para aislar IEL. Tratamiento combinado de DTE-EDTA aumenta la contaminación IEC en la preparación de IEL (figura 5) y reduce el rendimiento final de células inmunes vivo después de la centrifugación de gradiente de densidad. Centrifugación de gradiente de densidad se recomienda aislar los linfocitos de los compartimentos intestinales. Elimina las células muertas, muchas células epiteliales y moco, promoviendo el aislamiento de linfocitos muy enriquecidos y disminuir drásticamente el flujo cytometry adquisición veces (figura 6).

Figure 1
Figura 1 . Diagrama de flujo del Protocolo de aislamiento de. DTE, dithioerythritol. EDTA, ácido etilendiaminotetracético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Estrategia para las poblaciones de linfocitos de los tejidos intestinales que bloquean una citometría de flujo. Suspensiones de célula de los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), lámina propia (LP), de Peyer parches (PP) y compartimento de linfocitos intraepiteliales (IEL) fueron teñidas con tinte de viabilidad pueden corregir (por ejemplo, vivos o muertos) y las siguientes anticuerpos marcados con fluorescente: células CD45 para identificación de células hematopoyéticas, CD19 para las células de B, CD3ε para T, T-cell receptor (TCR) β por las células de T del αβ, TCRδ para las células de T del γδ, CD8α para CD8α+ T del αβ células y CD4 para CD4+ las células de T del αβ. Puerta 0 mostró adelante scatter (FSC) - lado a/scatter (SSC) - A propiedades. Puerta 1 identificó las células. Puerta 2 había identificado células vivas. Puerta 3 identifica células hematopoyéticas. 4 linfocitos identificados basados en las propiedades de la FSC-A/SSC-A la puerta. Gate 5 identificó las células T y células B. Puerta 6 células αβ identificados T y las células de T del γδ entre células T totales. Puerta 7 identificado CD8α+ y CD4+ T las células en la población de la célula de T αβ. Porcentajes (en fuente de color rojo) en parcelas de pseudocolor corresponden a la frecuencia de células dentro de la puerta indicada en la anterior población parental. 0 y 1 pantalla total de eventos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . El fenotipo ofCD8α+ las células de T del αβ y γδ T de las células en los tejidos intestinales. La expresión de CD8β por CD8α+ las células de T del αβ y la expresión de CD8α por las células de T del γδ son representados. Porcentajes (en fuente de color rojo) en histogramas corresponden a la frecuencia de las células que expresan el marcador indicado entre la población parental indicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . La composición de los linfocitos de los tratamientos del DTE, EDTA y colagenasa. La estrategia parental bloquea es el mismo que figura 2. Gate 5 identificó las células T y células B. Puerta 6 células αβ identificados T y las células de T del γδ entre células T totales. Puerta 7 identificado CD8α+ y CD4+ T las células en la población de la célula de T αβ. Porcentajes (en fuente de color rojo) en parcelas de pseudocolor corresponden a la frecuencia de células dentro de la puerta indicada en la anterior población parental. Los linfocitos del aislamiento de EDTA tienen semejanza a una mezcla de IEL y LP los linfocitos aislados de tratamientos del DTE y colagenasa, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Una comparación del tratamiento del DTE y tratamiento combinado de DTE-EDTA para el aislamiento de IEL. DTE el tratamiento fue realizado según este protocolo. IEL se recogieron después de tratamientos de DTE y antes de tratamientos de EDTA. Tratamiento combinado de DTE-EDTA se realizó en las mismas concentraciones que se utilizan en el presente Protocolo, pero al mismo tiempo. Las propiedades de los FSC-SSC-A/A, viabilidad y porcentaje de CD45+ se muestran las células hematopoyéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 . El impacto de la centrifugación gradiente densidad en la pureza de las preparaciones de linfocito IEL y LP. Suspensiones de unicelular aislados según este protocolo fueron sometidas a centrifugación gradiente de densidad o analizadas por citometría de flujo directamente. Las propiedades de los FSC-SSC-A/A, viabilidad y porcentaje de CD45+ se muestran las células hematopoyéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se presenta un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos desde el intestinal mucosa inductivo (MLN y PP) y efectores (compartimiento de LP y IEL). El protocolo ha sido desarrollado para equilibrar la entrada (tiempo) y salida (viabilidad y rendimiento) para maximizar la productividad y resultados. El protocolo también asegura la mínima contaminación compartimentación entre LP y IEL compartimientos.

Varios protocolos para el aislamiento de las células inmunes del intestino de ratón han sido publicados3,4,5,6,7. La mayoría de estos protocolos se centran en aislar las células inmunes del LP. El epitelio intestinal es de un compartimento distinto del LP que está expuesto directamente al medio externo y consiste en una composición única de los linfocitos. Recientes enfoques han buscado un análisis más global de la función inmune en los intestinos mediante el examen de distintos compartimentos intestinales al mismo tiempo para entender los aspectos únicos de las respuestas inmunitarias que ocurren en estos compartimentos y las relaciones entre ellos. Por lo tanto, se desea un protocolo confiable para el aislamiento de las células inmunes de estos compartimentos. Dos tratamientos de DTE son suficientes para aislar > 95% de la IEL y algunas IEC. EDTA dirige a ensambladuras dependiente de calcio y es eficiente para separar el IEC. Por lo tanto, el sobrenadante de los tratamientos posteriores de EDTA comprenden sobre todo IEC. Una cantidad muy pequeña de linfocitos puede encontrarse en el sobrenadante después del tratamiento de EDTA; sin embargo, los linfocitos más cerca 20-fold se obtienen de la fracción DTE. Por otra parte, los linfocitos del tratamiento con EDTA se asemejan a poblaciones mixtas de linfocitos IEL y de LP (figura 4), que sugiere contaminación de LP de las vellosidades y la cripta daños. Por lo tanto, en este protocolo, IEL se recogen del tratamiento antes del tratamiento de EDTA, DTE maximizando pureza reduciendo al mínimo la contaminación cruzada-compartimiento. Otros protocolos de usan secuencial dithiothreitol (DTT)-tratamientos de EDTA o tratamiento combinado de TDT-EDTA para el aislamiento de IEL5,6,7. TDT es una epimer de DTE y actúan como agentes reductores. En estos protocolos, TDT se divulga solamente eliminar moco y EDTA se utiliza para aislar IEL. Aunque directamente no se comparó el efecto de la TDT y del DTE, se evaluó la IEL después DTE tratamiento o tratamiento combinado de DTE-EDTA. No en vano, tratamiento combinado de DTE-EDTA aumenta la contaminación de la IEC en la preparación de IEL (figura 5) y la presencia de grandes cantidades de IEC disminuyó IEL rendimientos después de la centrifugación de gradiente de densidad. EDTA puede dañar algunas vellosidades y criptas, DTE-EDTA el tratamiento combinado también puede resultar en contaminación de linfocitos de LP en la preparación de IEL o pérdida de células del LP del aislamiento LP. Por otra parte, como > 95% de IEL fueron aislado de la fracción DTE, se prefieren los tratamientos separados de DTE y EDTA. Algunos protocolos de aislar los linfocitos sin utilizar centrifugación gradiente de densidad para enriquecer las células inmunes6. Centrifugación de gradiente de densidad requiere tiempo adicional y puede ocurrir pérdida de algunas células. Sin embargo, que elimina las células muertas, células epiteliales y moco, llevando a las poblaciones de linfocitos muy enriquecido (figura 6), que ayuda a mejorar la detección de pequeñas poblaciones de células y substancialmente disminuye el tiempo de adquisición para el flujo Citometría. Centrifugación de gradiente de densidad ha reportado como resultado en proporción alterada de fagocitos mononucleares subconjuntos7; sin embargo, composición del subgrupo de linfocitos de aspecto normal. Es especialmente útil para llevar a cabo la centrifugación gradiente de densidad para aislamiento de IEL. En general, se presenta un protocolo completo para aislar los linfocitos muy enriquecidos y perfectamente viables de todos los tejidos intestinales incluyendo el LP y IEL con mínima contaminación cruzada-compartimentación.

Deben tomarse cuidados y substancial del tiempo durante los pasos de aislamiento de tejido para limitar la contaminación entre las preparaciones. Retiro incompleto del PP puede sesgar enormemente los linfocitos LP. ILF también puede contaminar las preparaciones LP. Sin embargo, ILF no puede verse a simple vista y por lo tanto no se puede extirpar quirúrgicamente antes de la digestión. Cepas de ratón diferentes tienen diferentes números de ILF14, que puede contribuir considerablemente a la composición variable de linfocitos LP entre cepas de ratón. Al retirar el moco, asegúrese de deslizar suavemente el intestino para evitar daños a la membrana del sótano y LP, que podría resultar en contaminación de LP de IEL. Una indicación de contaminación es la presencia de grandes cantidades de células B en la preparación de IEL. IEL contienen pocas células de B (~ 1% o menos), mientras que la LPL puede tener hasta un 60% B células dependiendo de la cepa de ratón. CD19 pero no B220 puede usarse para identificar las células de B en el compartimiento de LP y IEL, como las células T intestinales también pueden expresar B22015. Además, muchas células T intestinales pueden expresar marcadores DC como CD11b y CD11c, respectivamente16y macrófago tradicional. Por lo tanto, debe utilizarse adecuada descarga compuerta estrategias para garantizar el adecuado análisis.

Pasos pueden ser modificados para adaptarse a las necesidades de los investigadores. Digestión mecánica puede ser suficiente para el aislamiento de linfocitos PP en estado estacionario o digestión de colagenasa de los ganglios linfáticos puede facilitar el aislamiento de algunos subconjuntos de los leucocitos durante la inflamación. El tipo de colagenasa utilizado puede tener un impacto sustancial en la expresión de marcadores de superficie celular y la viabilidad y pureza del LP linfocitos5,17. El intestino se puede cortar en pedazos pequeños para la digestión de la colagenasa, que puede aumentar el rendimiento de la célula. Sin embargo, también reduce la viabilidad. El tiempo de incubación con colagenasa puede ser optimizado para maximizar el rendimiento y reducir al mínimo la muerte de la célula, hacia la máxima recuperación de células vivas. Diferentes laboratorios usan gradientes de densidad ligeramente diferente para aislar los linfocitos. Aquí se presenta un protocolo de gradiente de densidad bien establecido de 44-67%. Los investigadores pueden probar gradientes de diferentes densidades para adaptarse mejor a sus necesidades individuales. Si se desea un mayor número de linfocitos, dos pequeños intestinos pueden combinarse para DTE tratamientos, tratamientos de EDTA y digestión de la colagenasa. Si los intestinos más de dos son necesarios para examinar los eventos extremadamente raros, se recomienda que suspensiones celulares individuales son agrupados después de aislamiento.

Linfocitos aislados pueden utilizarse para su posterior análisis fenotípico, funcional y genómico. Al realizar el análisis cytometric del flujo, es recomendable siempre usar que tintes de una viabilidad y anticuerpo anti-CD45 para excluir las células muertas y células no hematopoyéticas, que realzará grandemente el análisis. Si se necesitan poblaciones linfocitarias puro, célula clasificación de CD45+ células junto con otros marcadores de elección se pueden realizar. Panorámica sobre las placas revestidas con anti-CD8α puede utilizarse también para aislar puras células T desde la preparación de IEL, como la mayoría de estas células CD8α expresa. Panorámica o célula clasificación generalmente se requiere para cultivo de IEL como contaminar las células epiteliales puede inhibir el crecimiento de IEL. Células de alimentador como ingenuo esplenocitos pueden añadirse también a promover la supervivencia de IEL en cultura. Si se utilizan alimentadores, es importante utilizar células congenically Lencería desconjunta para distinguir las poblaciones. Contaminación bacteriana es raramente un problema en estos estudios funcionales a corto plazo como medios de cosecha contiene penicilina, estreptomicina y gentamicina. Además, numerosos pasos de lavado y centrifugación de gradiente de densidad quitar la mayoría de las bacterias.

El proceso de aislamiento es desperdiciador de tiempo y exige un equilibrio de atención, precisión y velocidad para obtener resultados óptimos. Tiempo suficiente debe estar pasado para asegurar la correcta manipulación de cada paso mientras se minimiza el tiempo entre sacrificio de ratón y la obtención de una suspensión individual para maximizar el rendimiento y la viabilidad celular. Se trata de un delicado equilibrio que también es un cuello de botella para principiantes tratando de obtener consistencia en el aislamiento de linfocitos con producción y alta viabilidad. Un proceso de aislamiento completo a partir de eutanasia de ratón para la obtención de una suspensión solo contado toma un investigador experimentado aproximadamente 8 h de 8 ratones. Se aconseja para obtener asistencia para más de 8 ratones producir alta calidad y resultados reproducibles. Es importante tener cuidado al comparar los linfocitos de estos tejidos con los linfocitos del bazo, sangre u otros tejidos linfoides como las incubaciones extenso puede llevar a cambios artificiales asociados con el procedimiento de aislamiento17. Comparaciones rutina de LP y IEL a tejidos linfoides semejantemente tratados evaluaría si el indicador de interés es modulado durante el aislamiento de linfocitos de los tejidos intestinales. Problemas similares son también una preocupación importante cuando se comparan perfiles de RNA de los intestinos con los de tejidos linfoides.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

B.S.S. es apoyado por subvenciones de NIH (R01 AI076457) y fondos aportados por la Universidad de Stony Brook. Z.Q. es apoyado por los NIH grant (K12 GM102778).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

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References

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Inmunología número 132 linfocitos intestino nodos de linfa mesentéricos placas de Peyer lámina propia linfocitos intraepiteliales citometría de flujo
Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón
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Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

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