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Immunology and Infection

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281

Summary

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Abstract

Le système immunitaire intestinal joue un rôle essentiel dans le maintien de la fonction barrière de l’appareil gastro-intestinal en générant des réponses tolérants aux antigènes alimentaires et de bactéries commensales tout en montage efficace des réponses immunitaires aux entéropathogènes microbes. En outre, il est devenu clair que l’immunité intestinale locale a un impact profond sur l’immunité systémique et lointaine. Par conséquent, il est important d’étudier comment un système immunitaire intestinal est induite et quelle est l’issue immunologique de la réaction. Un protocole détaillé est décrit ici, pour l’isolement des lymphocytes de l’intestin grêle des sites inductifs comme les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et le drainage des ganglions mésentériques et effectrices comme la lamina propria et de la épithélium intestinal. Cette technique assure l’isolement d’un grand nombre de lymphocytes de petits tissus intestinaux avec pureté optimale et de viabilité et de la contamination croisée compartimentale minime dans les contraintes de temps acceptable. La capacité technique d’isolation des lymphocytes et autres cellules immunitaires dans les tissus intestinaux permet la compréhension de la réponse immunitaire aux infections gastro-intestinales, les cancers et les maladies inflammatoires.

Introduction

Le système gastro-intestinal (GI) a beaucoup de plis et de protubérances qui représente l’interface plus importante qui sépare le corps interne et le milieu extérieur. Le système immunitaire intestinal joue un rôle essentiel dans le maintien de la fonction de barrière du tube digestif. Il est constamment exposé à des antigènes alimentaires, les bactéries commensales et microbes pathogènes. À ce titre, elle doit rester tolérant aux antigènes alimentaires et de bactéries commensales tout en préservant la capacité de générer rapidement une réponse immunitaire efficace de microbes entéropathogène1. Le système immunitaire intestinal peut être anatomiquement divisé en sites inductives, où les lymphocytes naïfs sont activés par l’antigène présentant des cellules porteuses d’antigènes de la muqueuse intestinale, et effectrices, où exercent spécifique des lymphocytes activés 2les fonctions effectrices. Les sites inductives comprennent la structure lymphoïde organisée des plaques de Peyer (PP) que les enquêtes de la lumière intestinale directement par le biais de l’action des cellules spécialisées de M et les régionales drainantes ganglions mésentériques (MLN). Les sites d’effecteur se composent de la lamina propria (LP), qui est le tissu conjonctif sous la membrane basale et l’épithélium intestinal, une couche monocellulaire située au-dessus de la membrane basale qui contient des lymphocytes intra-épithéliaux (IEL). Les lymphocytes sont des acteurs majeurs de l’immunité adaptative qui véhiculent une protection contre les infections et les cancers et peuvent aussi contribuer à l’immunopathologie des maladies inflammatoires. Il est important et hautement pertinent d’étudier des lymphocytes dans ces différents compartiments anatomiques de muqueuses afin de mieux comprennent leurs fonctions induction et effectrices.

Un protocole relativement simple et unifié pour l’isolement des lymphocytes de ces compartiments est nécessaire car le nombre d’enquêteurs explorant les événements immunitaires survenant dans l’intestin s’accélèrent. Plusieurs groupes de recherche ont publié les protocoles qui partagent plusieurs procédés similaires pour isoler les cellules immunitaires de la souris petits compartiments intestinale3,4,5,6,7 . Cependant, il y a plusieurs différences techniques entre eux selon la mise au point du protocole individuel. Par exemple, en mettant l’accent sur l’isolation de cellules immunitaires dans le LP, un seul protocole examine l’impact de diverses digestions enzymatiques sur la viabilité cellulaire, expression de marqueurs de surface de cellules et la composition des cellules immunitaires isolées5. Un autre protocole met en évidence une méthode rapide et reproductible pour l’isolement des lymphocytes sans densité centrifugation6. Enfin, les protocoles spécifiques existent également pour isoler des phagocytes mononuclées de couches de différents tissus de l' intestin grêle7. Ici, un protocole hautement reproductible qui permet d’isoler séquentielle de populations de lymphocytes du compartiment MLN, PP, LP et IEL de l’intestin grêle est présenté.

Nous nous concentrons sur l’isolement des populations hautement purifiées des compartiments LP et IEL, qui sont en grande partie exemptes de contaminants des autres compartiments intestinales. Cela couramment protocole produit un rendement élevé de lymphocytes au maximum pures et viables dans des temps acceptables contraintes4,8,9,10,11,12. Ce protocole garantit aussi l’isolement des lymphocytes du LP et IEL compartiment avec un minimum de contamination croisée compartimentale, permettant une véritable occasion d’étudier des lymphocytes dans ces compartiments distincts. Les lymphocytes isolés peuvent être soumis à des manipulations supplémentaires comme la cytométrie ou analyse fonctionnelle. Ce protocole a été appliqué avec succès à l’isolement des lymphocytes de la souris intestin grêle et du côlon au cours des infections bactériennes comme la Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumet Yersinia pseudotuberculosis les infections et les maladies inflammatoires comme la colite induite par agent pathogène et chimique. Ce protocole permet également d’isoler les cellules immunitaires innées telles que les cellules dendritiques, macrophages, polynucléaires neutrophiles et les monocytes de la souris intestin grêle et du côlon.

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Protocol

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux directives de l’Institut National de la santé et approuvés par le Comité de l’emploi et de Stony Brook University Institutional Animal Care.

Remarque : Assurez-vous que toutes les homologations sont accordées avant de procéder.

1. préparation de la solution

  1. HGPG (HEPES, L-glutamine, pénicilline/streptomycine et gentamicine), 100 ×
    1. Mélanger 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g L-glutamine (final de 200 mM), 1 × 106 U la pénicilline (2 000 U/mL final), streptomycine 1 g (2 mg/mL final) et gentamicine 2,5 mg (5 µg/mL final). Ajouter RPMI 1640 à 500 mL. Ajuster le pH à 7,5 à l’aide de NaOH (avant ajustement, le tampon est jaune/orange avec un pH autour de 6.0). Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Aliquote et entreposer à-20 ° C pendant 1 an à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  2. Un tampon HEPES-bicarbonate, x 10
    1. Mix 23,8 g HEPES (final de 100 mM), 21 g de NaHCO3 (250 mM final) et ajouter de l’eau à 1 000 mL. Ajuster le pH à 7,2 avec HCl. filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Conserver à température ambiante. Le pH change au fil du temps. Ré-ajuster le pH régulièrement.
  3. Récolter des médias (~ souris bouteille 1/2)
    1. À 500 mL RPMI 1640, ajouter 25 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal (finale de 5 %) et 5 mL 100 × HGPG. Stocker jusqu'à 6 mois à 4 ° C.
  4. Solution de dithioérythritol (DTE) (40 mL/petit intestin)
    1. Mélanger 50 mL 10 × solution saline équilibrée de Hanks, Ca2+ -et Mg2+-libre, 50 mL 10 × HEPES-bicarbonate de tampon et 50 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal (final de 10 %). Ajouter 350 mL H2O et 15,4 mg dithioérythritol/100 mL (finale de 1 mM). Préparer ce frais avant utilisation.
  5. Solution de (EDTA) d’acide éthylènediaminetétraacétique (50 mL/petit intestin)
    1. Mélanger 50 mL 10 × solution saline équilibrée de Hanks, Ca2+ -et Mg2+-libres avec 5 mL 100 × HGPG. Ajouter 445 mL H2O. Ajouter 260 µL EDTA de 0,5 M/100 mL (1,3 mM final). Préparer ce frais avant utilisation.
  6. Solution de collagènase (30 mL/LP)
    1. À 500 mL RPMI, ajouter 50 mL FBS (10 % FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (final de 1 mM) et 1 mL 0,5 M CaCl2 (final de 1 mM). Ajouter la collagénase, de Type I (100 U/mL final). Préparer ce frais avant utilisation.
  7. Solutions (DG) gradients de densité
    1. Préparer 1 solution × DG en mélangeant 90 mL DG de solution (voir la Table des matières) avec 10 mL de 10 × PBS. Garder stérile à 4 ° C.
    2. Préparer 44 % DG solution (8 mL/IEL, 8 mL/LP) en mélangeant 44 mL de solution mère de 1 × DG et 56 mL RPMI 1640. Préparer ce frais avant utilisation.
    3. Préparer solution DG de 67 % (5 mL/IEL, 5 mL/LP) en mélangeant 67 mL de solution mère de 1 × DG et 33 mL RPMI 1640. Préparer ce frais avant utilisation.

2. isolement des ganglions mésentériques, intestins et de Peyer Patches

  1. Euthanasier la souris à l’aide de dioxyde de carbone narcose et dislocation cervicale secondaire. Placez la souris sur le dos et vaporiser avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux pour faire une incision médiane et ouvrir la peau et la paroi abdominale pour exposer la cavité péritonéale.
  2. Rechercher caecum et utiliser des pinces pour abaisser doucement du caecum. Forceps permet de déplacer délicatement l’intestin grêle vers la droite, exposant ainsi toute la chaîne MLN, qui est alignée sur le côlon.
    Remarque : Une carte de : les ganglions lymphatiques mésentériques, drainage lymphatique et de la chaîne de l’intestin a été précédemment représenté13.
  3. Identifier le nœud du bas de la chaîne, proche du caecum. Utilisez un jeu de pinces pour saisir le mésentère/graisse autour d’elle et retirez doucement la chaîne MLN du bas vers le haut par épilation la graisse d’autour du ganglion lymphatique avec un autre ensemble de pinces.
  4. Poser la chaîne MLN sur un essuie-tout imbibé de media de moisson. Enlever mésentère/graisse en roulant la chaîne sur la tour de papier et arrachant la graisse avec deux jeux de pinces. Placez le MLN en milieu froid récolte pour les étapes ultérieures d’isolement.
    NOTE : (i) Direct manipulation des nœuds est déconseillée. Au lieu de cela, saisir le mésentère/graisse autour d’eux. (ii) il est essentiel de supprimer autant de mésentère/gras possible pour améliorer la viabilité des cellules.
  5. Couper l’intestin grêle sous le sphincter pylorique et au-dessus du caecum à l’aide de ciseaux. Retirer l’intestin lentement de l’iléon au duodénum à l’aide d’un jeu de pinces tout en retirant le mésentère/gras attaché à l’aide d’un autre ensemble de pinces.
  6. Placez l’intestin sur un essuie-tout imbibé de media de moisson et taquiner tout mésentère/gras restant au large avec deux jeux de pinces.
    NOTE : (i) Veillez à supprimer autant de mésentère/gras possible rendement cellulaire optimale et leur viabilité. (ii) maintenir l’intestin imbibé dans tout cela et les étapes suivantes en appliquant des médias récolte périodiquement.
  7. Recueillir de Peyer en les retirant de l’intestin avec des ciseaux courbes. Utiliser une dissection étendue ou une loupe si nécessaire (débutants) ; la plupart de Peyer devrait être visible à le œil averti. Collecter 5-11 (standard) de Peyer dans l’intestin grêle. Patchs de place Peyer dans médias récolte froid pour les étapes ultérieures d’isolement.
    NOTE : De Peyer patchs sont de petite taille, principalement autour de bosses dans la paroi intestinale extérieure face à la ligne d’attache du mésentère.
  8. Utiliser le côté plat de la pince et doucement glisser du duodénum vers l’iléon à expulser le mucus et contenu fécal. Répétez l’opération une fois pour enlever la plupart de la glaire.
    NOTE : Une expulsion incomplète du mucus peut diminuer la viabilité cellulaire et rendement. Néanmoins, n’oubliez pas de glisser l’intestin doucement afin d’éviter des villosités de décapage ou d’endommager la membrane basale.
  9. Utilisez des ciseaux avec une extrémité franche sur un point, insérez l’extrémité arrondie de l’intestin et couper l’intestin ouvert longitudinalement entre le duodénum et l’iléon. Latéralement, couper l’intestin ouvert en morceaux d’environ 2 cm. Placer les morceaux intestinales dans un tube conique de 50 mL avec 25 mL de milieu de récolte froid pour les étapes ultérieures d’isolement.
    NOTE : Garder les ciseaux imbibés de médias aidera les glisser sans effort à travers l’intestin.

3. isolement des Lymphocytes provenant des Sites Inductive

  1. Isoler les lymphocytes de MLN en dissociant délicatement à travers un tamis de cellule de 70 µm en utilisant le piston d’une seringue de 3 mL. Lavez tamis cellulaire avec 5 mL de médias récolte froid.
  2. Pellet MLN-cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.
    NOTE : tampon de lyse des globules rouges peut servir à supprimer des culots globulaires si le saignement est survenu au moment du retrait.
  3. Isoler les lymphocytes de plaques de Peyer en incubant les plaques de Peyer dans un tube conique 15 mL contenant la solution de collagènase 5 mL préchauffé à 37 ° C et 220 tr/mn pendant 30 min.
  4. Vortexer pendant 15 s à réglage maximal et filtre digéré le tissu et le surnageant dans un tube conique de 50 mL à travers un tamis de cellule de 70 µm. Doucement se dissocient les pièces restantes de tissus en utilisant le piston d’une seringue de 3 mL et lavez le tamis cellulaire avec 5 mL de médias récolte froid.
  5. Les cellules de patch de Peyer de granule par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.
    NOTE : Peyer de patchs isolement peuvent avoir certains contaminants lamina propria lymphocytes et lymphocytes intra-épithéliaux.

4. isolement des Lymphocytes intra-épithéliaux dans l’intestin grêle

  1. Lavez les morceaux d’intestin grêle trois fois avec 25 mL de médias récolte froid en renversant le tube 10 fois, laisser les pièces intestinales s’installer et décanter le liquide surnageant.
    NOTE : Morceaux de tissus devrait facilement déposer au fond du tube. S’ils ne le font pas, c’est une indication que trop mésentère/graisse reste attachée ou elles sont associées à une bulle d’air.
  2. Ajouter 20 mL de solution DTE préchauffée dans le tube conique de 50 mL contenant des morceaux intestin et transférer dans une fiole Erlenmeyer mastic de 50 mL contenant un émoi-bar. Remuer à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 20 min. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour tenir la barre d’émoi et le tissu et la solution de transfert vers le tube conique de 50 mL.
  3. Vortex le tube au maximum réglage pour 10 s. transfert le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL conique à travers un tamis de cellule de 70 µm en prenant soin de garder les morceaux de tissus dans le tube d’origine. Ne pas jeter le surnageant ; le surnageant contient des lymphocytes intra-épithéliaux. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de froid récolte et stockage sur glace.
  4. Ajouter 20 mL de solution DTE préchauffée dans le tube conique de 50 mL contenant des morceaux intestin et transférer vers le 50 mL mastic erlenmeyer contenant un émoi-bar. Remuer à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 20 min. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour tenir la barre d’émoi et le tissu et la solution de transfert vers le tube conique de 50 mL.
    NOTE : DTE est un agent réducteur qui enrichit les lymphocytes intra-épithéliaux.
  5. Vortex le tube au maximum réglage pour 10 s. transfert le surnageant à travers un tamis de cellule de 70 µm dans le tube précédent contenant des cellules du surnageant du premier traitement DTE (de l’étape 4.3).
    Remarque : Les pièces restantes intestinales sont utilisés pour isoler les lymphocytes de la lamina propria. Contrôle de la qualité : Un morceau de tissu pourra être enlevé et vérifié histologiquement pour s’assurer que les cellules épithéliales sont présents et la membrane basale est intacte.
  6. Cellules de pellet en centrifugeant le surnageant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 8 mL de solution DG de 44 % à la température ambiante (RT).
  7. Transvaser la suspension 8 mL de solution/cellules sur les DG 44 % dans un ø 17 mm x 100 mm style tube fond rond polypropylène de 14 mL. Sous-couche avec 5 mL de solution DG RT 67 %. Centrifuger à 1600 × g pendant 20 min à ta sans frein.
    NOTE : Les Tubes peuvent être prétraités avec sérum bovin pour empêcher les cellules de coller aux parois du tube.
  8. Notez que des cellules viables forment une bande (couche leuco-plaquettaire) à l’interface de 44 à 67 %, les cellules mortes et certaines cellules épithéliales sont dans un film mucoïde en haut de la pente et les globules rouges sont dans le culot. Enlever la couche supérieure de la pente à environ 2 cm de l’interface par aspiration sous vide. Utiliser une pipette Pasteur pour récolter la couche leuco-plaquettaire à l’interface et les transférer dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de milieu de récolte froid.
  9. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.

5. isolement des Lymphocytes de la Lamina Propria de l’intestin grêle

  1. Retirer les cellules épithéliales de morceaux de tissu intestinal en ajoutant 25 mL de solution d’EDTA préchauffée à la fiole contenant les pièces restantes intestinales. Fiole de remuer à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 30 min. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour tenir la barre de remuer et soigneusement éliminer le liquide surnageant tout en gardant des morceaux intestinale dans la fiole.
    NOTE : (i) l’EDTA est un chélateur du calcium qui cible les jonctions dépendant du calcium et favorise le détachement des cellules épithéliales intestinales. (ii) le surnageant doit être nuageux et peut être utilisé pour isoler la CEI si leur collection est souhaitée.
  2. Répétez l’étape 5.1.
    Remarque : Le liquide surnageant doit être moins nuageux après cette incubation. Contrôle de la qualité : Un morceau de tissu pourra être enlevé et vérifié histologiquement afin de s’assurer que les cellules épithéliales intestinales ont été supprimées et la membrane basale est intacte. Un échantillon du surnageant peut également être mesurée par cytométrie pour confirmer que les leucocytes (CD45+ cellules) sont absents.
  3. Ajouter 50 mL de médias récolte RT dans le ballon. Remuer brièvement avec un aimant. Laisser les morceaux intestinale reposer et soigneusement éliminer le surnageant.
    Remarque : Cette étape assure l’enlèvement de l’EDTA avant la digestion de collagénase comme l’EDTA inactive collagénase par chélation du calcium qui est critique pour la fonction de collagénase.
  4. Ajouter 30 mL de solution de collagènase préchauffée dans le ballon et remuer les morceaux intestinale à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 45 min.
  5. Transfert tissus digérés et surnageant dans un tube conique de 50 mL en filtrant à travers un tamis de cellule de 70 µm. Doucement se dissocient les morceaux de tissu restant en utilisant le piston d’une seringue de 3 mL pour écraser à travers le filtre. Laver le filtre avec 10 mL de médias récolte froid.
  6. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 8 mL de solution de DG de 44 % la température ambiante.
  7. Transvaser la suspension 8 mL de solution/cellules sur les DG 44 % dans un ø 17 mm x 100 mm style tube fond rond polypropylène de 14 mL. Sous-couche avec 5 mL de solution de DG de 67 % la température ambiante. Centrifuger les gradients à température ambiante et 1600 × g pendant 20 min avec pas de frein.
  8. Enlever la couche de graisse sur le dessus de l’aspiration intra-utérine. Utiliser une pipette Pasteur pour récolter la couche leuco-plaquettaire à l’interface et les transférer dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de milieu de récolte froid.
  9. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.

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Representative Results

Une représentation schématique du protocole est représentée (Figure 1). Lymphocytes dans la muqueuse intestinale inductive et sites effecteurs sont organisés distinctement. Peyer de correctifs (PP) et les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) contiennent des lymphocytes dans les zones de cellules T bien organisées et follicules de cellules B, tandis que l’épithélium intestinal contient des lymphocytes qui sont distribués de façon plus diffuse. La lamina propria (LP) contient des lymphocytes diffusément distribués et les lymphocytes figurant au sein de structures lymphoïdes organisées comme des follicules lymphoïdes isolés (ILF) et cryptopatches. Chaque compartiment immunitaire intestinal se caractérise également par une composition unique de sous-ensembles de lymphocytes (Figure 2). Le MLN est principalement composée de cellules de T αβ (~ 70 %), tandis que les lymphocytes PP sont pour la plupart des cellules B (~ 80 %). Composition de lymphocytes LP est largement dépendante de la souche mais principalement composée de cellules αβ T et cellules B. Distincte des autres compartiments intestinales, lymphocytes dans l’épithélium sont principalement les lymphocytes T γδ (~ 60 %) et lymphocytes T αβ avec essentiellement aucune cellule de B. Il existe aussi des proportions distinctes des sous-ensembles de lymphocytes T αβ dans des emplacements distincts anatomiques de l’intestin. Les cellules αβ T le LP sont principalement CD4+ T cells (~ 70 %), tandis que CD8α+ T cellules (environ 85 %) prédominent dans le compartiment de lymphocytes intra-épithéliaux (IEL). CD8α+ cellules αβ T dans les compartiments LP et IEL expriment l’homodimère de CD8αα ou l’hétérodimère CD8αβ tandis que site inductive CD8α+ principalement de cellules αβ T exprimer l’hétérodimère CD8αβ (Figure 3). La majorité des cellules de T de γδ dans le compartiment de IEL également exprime CD8α, tandis que les cellules de T de γδ trouvent en l’absence MLN CD8α (Figure 3). Indépendamment de Généralités, la composition des sous-ensembles de lymphocytes peut varier entre les souches de souris et peut devenir altérée avec l’âge ou la maladie. Par conséquent, une analyse minutieuse des populations de lymphocytes dans la muqueuse intestinale à l’équilibre doit être effectuée de la souche d’arrière-plan utilisée pour les manipulations expérimentales.

Rendement des cellules peut varier considérablement selon la souche et l’âge de la souris et les conditions expérimentales utilisées. Unique, vivre les cellules peuvent compter sur un hémocytomètre ou une machine de comptage cellulaire automatisée en utilisant le bleu trypan exclusion. Le nombre de lymphocytes est calculé comme : cellule comte × CD45+ (%) des cellules dans la grille 3 × Lymphocytes (%) dans la porte 4 (Figure 2). Environ 15 × 106 MLN lymphocytes, lymphocytes PP 5-10 × 106 , 2-5 × 106 lymphocytes de LP et 3 à 6 × 106 IEL peuvent provenir d’une souris C57Bl/6 ou Balb/c de 8 à 12-week-old naïf. Alternativement, perles de comptage axée sur le flux peuvent être utilisés pour quantifier les populations de cellules avec la mise en garde que la perte de cellules se produit pendant le processus de coloration. En fin de compte, cohérence dans la technique de comptage doit être maintenue au sein du laboratoire pour s’assurer que des comparaisons peuvent être faites à travers des expériences.

Dans ce protocole, traitement DTE sert à enrichir IEL, qui est suivie d’un traitement à l’EDTA pour enlever la CEI pour une isolation optimale des lymphocytes hautement enrichis. Deux traitements de DTE suffisent à isoler > 95 % de IEL. On trouvera également un très petit nombre de lymphocytes dans le traitement de l’EDTA. Ces lymphocytes ressemblent à un mélange des lymphocytes IEL et LP (Figure 4). Une comparaison du traitement de DTE et traitement combiné de DTE-EDTA pour isoler IEL a également été réalisée. Traitement combiné de DTE-EDTA augmente la contamination de la CEI dans la préparation de IEL (Figure 5) et diminue le rendement final de cellules immunitaires direct après centrifugation en gradient de densité. Centrifugation en gradient de densité est recommandée d’isoler les lymphocytes des compartiments intestinales. Il élimine les cellules mortes, beaucoup de cellules épithéliales et de mucus, favorisant l’isolement des lymphocytes hautement enrichis et diminuant considérablement l’écoulement cytometry acquisition fois (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 . Organigramme du protocole d’isolement de. DTE, dithioérythritol. EDTA, acide éthylènediaminetétraacétique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Un écoulement cytometry gating stratégie pour les populations de lymphocytes de tissus intestinaux. Des suspensions de cellules simples préparées à partir de la les ganglions mésentériques (MLN), lamina propria (LP), de Peyer patches (PP) et les lymphocytes intra-épithéliaux (IEL) compartiment ont été colorées avec de la teinture de viabilité fixable (par exemple Live/Dead) et ce qui suit anticorps fluorescent-étiquetées : cellules CD45 pour l’identification de cellules hématopoïétiques, CD19 des lymphocytes B, CD3ε t, T-cell receptor (TCR) β pour cellules αβ T, TCRδ pour les cellules de T de γδ, CD8α pour CD8α+ αβ T CD4 pour CD4 et cellules+ cellules αβ T. Porte 0 a montré avant dispersion (FSC) - A/side diffusion (SSC) - A propriétés. Porte 1 identifié des cellules individuelles. Porte 2 identifié des cellules vivantes. Porte 3 identifié les cellules hématopoïétiques. Lymphocytes porte 4 identifié d’après les propriétés FSC-A/SSC-A. Porte 5 identifié des cellules T et cellules B. Gate 6 cellules identifiées αβ T et cellules de T de γδ parmi les cellules T totales. Gate 7 identifié CD8α+ et CD4+ T cells dans la population de lymphocytes T αβ. Pourcentages (en rouge) dans les parcelles Pseudo-couleur correspondent à la fréquence des cellules à l’intérieur de la porte indiquée parmi la population parentale précédente. Portail 0 et 1 affichent le nombre total d’événements. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Le phénotype ofCD8α+ cellules αβ T et T de γδ cellules dans les tissus intestinaux. L’expression de CD8β de CD8α+ cellules αβ T et l’expression de CD8α par les cellules de T de γδ sont représentés. Pourcentages (en rouge) dans les histogrammes correspondent à la fréquence des cellules qui expriment le marqueur indiqué parmi la population parentale indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . La composition des lymphocytes de traitements DTE, EDTA et collagénase. La stratégie de blocage parentale est le même que dans la Figure 2. Porte 5 identifié des cellules T et cellules B. Gate 6 cellules identifiées αβ T et cellules de T de γδ parmi les cellules T totales. Gate 7 identifié CD8α+ et CD4+ T cells dans la population de lymphocytes T αβ. Pourcentages (en rouge) dans les parcelles Pseudo-couleur correspondent à la fréquence des cellules à l’intérieur de la porte indiquée parmi la population parentale précédente. Lymphocytes de l’isolement de l’EDTA ressemblent à un mélange de lymphocytes IEL et LP isolées de traitements DTE et collagénase, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Une comparaison du traitement de DTE et traitement combiné de DTE-EDTA pour l’isolement de IEL. DTE le traitement a été effectué selon le présent protocole. IEL ont été prélevés après des traitements de DTE et avant les traitements de l’EDTA. Traitement combiné de DTE-EDTA a été effectuée aux mêmes concentrations utilisées dans le présent protocole, mais en même temps. Les propriétés de FSC-A/SSC-A, la viabilité et le pourcentage de CD45+ cellules hématopoïétiques sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 . L’impact de la centrifugation en gradient de densité sur la pureté des préparations de lymphocytes IEL et LP. Des suspensions de cellules seul isolées selon ce protocole ont été soumises à centrifugation en gradient de densité ou analysées par cytométrie en flux directement. Les propriétés de FSC-A/SSC-A, la viabilité et le pourcentage de CD45+ cellules hématopoïétiques sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Un protocole détaillé est présenté pour l’isolement des lymphocytes de l’intestin muqueuses inductive (MLN et PP) et sites de l’effecteur (LP et IEL compartiment). Le protocole a été élaboré afin d’équilibrer les entrées (temps) et sorties (viabilité et le rendement) pour maximiser la productivité et des résultats. Le protocole garantit également la contamination croisée compartimentale minime entre compartiments LP et IEL.

Plusieurs protocoles d’isolement de cellules immunitaires dans l’intestin de souris ont été publiés3,4,5,6,7. La plupart de ces protocoles se consacrée sur l’isolation de cellules immunitaires dans le LP. L’épithélium intestinal est un compartiment distinct de la LP qui est directement exposée à l’environnement extérieur et se compose d’une composition unique des lymphocytes. Approches récentes ont cherché une analyse plus globale de la fonction immunitaire dans les intestins en examinant des compartiments distincts intestinales en même temps afin de comprendre les aspects uniques de la réponse immunitaire qui se produisent dans ces compartiments et les relations entre eux. Par conséquent, un protocole fiable pour l’isolement des cellules immunitaires dans tous ces compartiments est souhaité. Deux traitements de DTE suffisent à isoler > 95 % de IEL et certains IEC. EDTA cible les jonctions de calcium-dépendante et est efficace pour détacher la CEI. Par conséquent, le surnageant des traitements ultérieurs EDTA comprennent surtout de CEI. Un très petit nombre de lymphocytes peut être trouvé dans le surnageant après traitement à l’EDTA ; Cependant, environ 20 fois plus lymphocytes proviennent de la fraction DTE. En outre, lymphocytes proviennent du traitement EDTA ressemblent à des peuplements mixtes de lymphocytes IEL et LP (Figure 4), qui suggère la contamination LP de villosités et de cryptes dommage. Donc, dans ce protocole, IEL sont prélevés le traitement DTE avant traitement à l’EDTA, maximisant la pureté en réduisant au minimum la contamination croisée-compartiment. Autres protocoles utilisent le dithiothréitol séquentiels (TNT)-traitements de l’EDTA ou le traitement combiné de TNT-EDTA pour l’isolement de IEL5,6,7. DTT est un épimère du DTE et agissent comme agents réducteurs, toutes les deux. Dans ces protocoles, TNT est seulement enlever le mucus et EDTA est utilisé pour isoler IEL. Même si l’effet de la TNT et DTE n’était pas directement comparé, IEL après un traitement DTE ou combiné DTE-EDTA a été évaluée. Sans surprise, le traitement combiné de DTE-EDTA augmente la contamination de la CEI dans la préparation de IEL (Figure 5) et la présence d’un grand nombre de la CEI a diminué les rendements IEL après centrifugation en gradient de densité. Comme l’EDTA peut endommager des villosités et les cryptes, traitement combiné de DTE-EDTA peut aussi entraîner une contamination des lymphocytes de LP dans la préparation de IEL ou perte de cellules de LP de l’isolement de la LP. En outre, tant que > 95 % de IEL ont été isolés de la fraction DTE, traitements séparés de DTE et EDTA sont préférés. Certains protocoles isolent des lymphocytes sans utiliser la centrifugation en gradient de densité pour enrichir les cellules immunitaires6. Centrifugation en gradient de densité prend du temps et une perte de certaines cellules peut-être se produire. Cependant, il élimine les cellules mortes, de cellules épithéliales et de mucus, conduisant à des populations de lymphocytes fortement enrichi (Figure 6), qui contribue à améliorer la détection de petites populations de cellules diminue substantiellement des temps d’acquisition pour l’écoulement cytométrie en flux. Centrifugation en gradient de densité a rapporté causera ratio altérée des phagocytes mononuclées sous-ensembles7; Cependant, composition de sous-ensemble de lymphocytes semble normale. Il est particulièrement utile effectuer la centrifugation en gradient de densité pour l’isolation de IEL. Dans l’ensemble, un protocole complet est présenté afin d’isoler des lymphocytes hautement enrichis et parfaitement viables de tous les tissus intestinaux notamment le LP et IEL avec une contamination croisée-compartimentale minimale.

Soins et beaucoup de temps il faut aux étapes de l’isolement tissu pour limiter la contamination entre les préparations. L’élimination incomplète des PP peut fausser considérablement lymphocytes LP. ILF peut aussi contaminer les préparations de LP. Cependant, ILF sont invisibles à le œil nu et par conséquent ne peut être enlevée chirurgicalement avant la digestion. Souches de souris différents ont des nombres différents de ILF14, qui peut grandement contribuer à la composition variable des lymphocytes LP entre souches de souris. Lorsque vous retirez le mucus, n’oubliez pas de glisser doucement l’intestin pour ne pas endommager la membrane basale et le LP, ce qui pourrait entraîner une contamination de LP de IEL. La présence d’un grand nombre de lymphocytes B dans la préparation de IEL en est un signe de contamination. IEL contiennent peu de cellules B (~ 1 % ou moins), tandis que LPL peut avoir jusqu'à 60 % B cellules selon la souche de souris. CD19 mais pas B220 devrait servir pour identifier les cellules B dans le compartiment de LP et IEL, cellules intestinales de T peuvent également exprimer B22015. En outre, plusieurs cellules intestinales de T peuvent exprimer macrophage traditionnel et marqueurs de DC comme CD11b et CD11c, respectivement16. Par conséquent, bon vidage gating stratégies devrait être utilisé afin d’assurer une analyse appropriée.

Étapes peuvent être modifiés pour répondre aux besoins des chercheurs. Digestion mécanique peut être suffisante pour l’isolement de lymphocyte PP à l’état stable ou digestion de collagénase de ganglions lymphatiques peut faciliter l’isolement de certains sous-ensembles de leucocytes lors d’une inflammation. Le type de collagénase utilisé peut avoir des répercussions considérables sur l’expression de marqueurs de surface de cellules et la viabilité et la pureté du LP lymphocytes5,17. L’intestin peut être coupé en petits morceaux pour la digestion de collagénase, qui peut augmenter le rendement de la cellule. Cependant, elle réduit également la viabilité. Le temps d’incubation avec la collagénase peut être optimisé pour maximiser le rendement tout en minimisant la mort de la cellule, conduisant à une récupération maximale des cellules vivantes. Différents laboratoires utilisent des gradients de densité légèrement différentes pour isoler des lymphocytes. Un protocole de gradient de densité de 44 % / 67 % bien établie est présenté ici. Les chercheurs peuvent tester des gradients de densité différente pour mieux répondre à leurs besoins individuels. Si vous désirez un plus grand nombre de lymphocytes, deux petits intestins peuvent être combinés pour les traitements de DTE, traitements d’EDTA et digestion de collagénase. Si plus de deux intestins sont nécessaires à l’examen des événements extrêmement rares, il est recommandé que des suspensions de cellules simples sont mis en commun après l’isolement.

Lymphocytes isolés peuvent être utilisés pour une analyse ultérieure phénotypique et fonctionnelle génomique. Lorsque vous effectuez l’analyse en cytométrie en flux, il est fortement conseillé de toujours utiliser qu'une viabilité colorants et anticorps anti-CD45 d’exclure les cellules mortes et les cellules non hématopoïétiques, qui permettra d’améliorer grandement l’analyse. Si les populations de lymphocytes pur sont nécessaires, la cellule tri de CD45+ cellules ainsi que d’autres marqueurs de choix peuvent être effectués. Panoramique sur plaques anti-CD8α-coated peut également servir à isoler les cellules de T purs de préparation IEL, comme la majorité de ces T cells express CD8α. Panoramique ou le tri des cellules est généralement requise pour culture de IEL comme contaminant les cellules épithéliales peut inhiber la croissance de IEL. Des cellules nourricières tels que naïve splénocytes peuvent également être ajoutés à favorisent la survie IEL dans la culture. Si les conducteurs sont utilisés, il est important d’utiliser des cellules congenically correspondent pas pour distinguer les populations. La contamination bactérienne est rarement un problème dans ces études fonctionnelles de courte durée car les médias récolte contient la pénicilline, la streptomycine et gentamicine. De plus, les nombreuses étapes de lavage et centrifugation en gradient de densité supprimer la plupart des bactéries.

Le processus d’isolement prend du temps et exige un équilibre des soins, de précision et de vitesse pour des résultats optimaux. Suffisamment de temps doit être dépensée pour assurer une manipulation appropriée de chaque étape tout en minimisant le temps entre le sacrifice de souris et d’obtenir une suspension de cellules unique afin de maximiser le rendement et la viabilité cellulaire. Il s’agit d’un équilibre délicat qui est également un goulot d’étranglement pour les débutants, essayer d’obtenir la cohérence à isoler des lymphocytes avec le rendement et la viabilité de haute. Un processus d’isolement complet à partir de l’euthanasie de souris à l’obtention d’une suspension monocellulaire comptés prend un h chercheur expérimenté environ 8 pour 8 souris. Il est conseillé d’obtenir de l’aide pour plus de 8 souris produire de haute qualité et des résultats reproductibles. Il est important de faire attention en comparant les lymphocytes de ces tissus avec des lymphocytes de la rate, sang ou d’autres tissus lymphoïdes, comme les incubations vaste peut conduire à artificiels changements liés à l’isolement intérieur17. Comparaisons systématiques des populations LP et IEL de même traitée tissus lymphoïdes évaluera si le marqueur d’intérêt est modulé au cours de l’isolement de lymphocyte de tissus intestinaux. Des questions semblables sont également une préoccupation majeure lors de la comparaison des profils de RNA des intestins avec ceux des tissus lymphoïdes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

B.S.S. est pris en charge par NIH grant (R01 AI076457) et de fonds fournis par l’Université de Stony Brook. Z.Q. est pris en charge par les NIH accorder (K12 GM102778).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

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References

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Immunologie numéro 132 Lymphocytes intestin grêle les ganglions mésentériques plaques de Peyer lamina propria lymphocytes intraépithéliaux cytométrie en flux
Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit
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Qiu, Z., Sheridan, B. S. IsolatingMore

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

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