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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281
Automatic Translation
1, 1
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

Summary

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Abstract

Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des Magen-Darm-Trakt durch die Generierung von toleranten Responses to diätetische Antigene und Kommensalen Bakterien bei der Montage effektiv Immunantworten auf enteropathogenic Mikroben. Darüber hinaus ist es deutlich geworden, dass lokale Darm Immunität eine profunde Auswirkung auf fernen und systemische Immunität hat. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie eine intestinale Immunantwort induziert wird und was das immunologische Ergebnis der Reaktion ist. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Dünndarm induktive Seiten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und die mesenterialen Lymphknoten und Effektor Websites wie die Lamina Propria beschrieben und die Darmepithel. Diese Technik sorgt für Isolierung von einer großen Anzahl von Lymphozyten aus kleinen intestinalen Gewebe mit optimaler Reinheit und Lebensfähigkeit und minimale wohnzimmertaugliche Kontamination innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen. Die technische Möglichkeiten zum Isolieren von Lymphozyten und anderen Immunzellen aus den intestinalen Geweben ermöglicht das Verständnis der immunen Antworten zu Magen-Darm-Infektionen, Krebs und entzündliche Erkrankungen.

Introduction

Gastrointestinaltrakt (GI) hat viele Falten und Vorsprünge, die die größte Oberfläche trennt das Innere des Körpers und der äußeren Umgebung darstellt. Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des GI-Trakt. Es ist ständig diätetische Antigene, Kommensalen Bakterien und pathogenen Mikroben ausgesetzt. Als solche muss tolerant gegen Nahrungsmittel-Antigene und Kommensalen Bakterien bleiben und gleichzeitig die Fähigkeit, schnell eine effektive Immunantwort gegen enteropathogenic Mikroben1erzeugen. Des intestinalen Immunsystems können anatomisch unterteilt werden induktive Sites, wo naive Lymphozyten durch antigenpräsentierende Zellen Antigene von der Darmschleimhaut tragen aktiviert werden, und Effektor Sites, wo aktivierte Lymphozyten bestimmte ausüben Effektor-Funktionen2. Die induktive Websites umfassen die organisierte lymphatischen Struktur von Peyer Patches (PP), die im Darmlumen direkt durch das Wirken des spezialisierten M-Zellen und die regionalen mesenterialen Lymphknoten (MLN) Umfragen. Die Effektor-Seiten bestehen aus der Lamina Propria (LP), die das Bindegewebe unterhalb der Basalmembran und das Darmepithel, eine einzelne Zelle Schicht oberhalb der Basalmembran, die intraepitheliale Lymphozyten (IEL) enthält. Lymphozyten sind wichtige Akteure der adaptiven Immunität, die Schutz gegen Infektionen und Krebs zu vermitteln und auch zu Immunpathologie bei entzündlichen Erkrankungen beitragen können. Es ist wichtig und hochaktuellen Lymphozyten in diesen unterschiedlichen studieren anatomische Schleimhaut Fächer besser verstehen ihre Induktion und Effektor-Funktionen.

Eine relativ einfache und einheitliche Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus diesen Fächern ist erforderlich, da die Anzahl der Ermittler erkunden immun Ereignisse im Darm beschleunigt werden. Mehrere Forschergruppen haben Protokolle veröffentlicht, die mehrere ähnliche Prozesse für die Isolierung von Immunzellen aus dem Maus kleine Darm Fächer3,4,5,6,7 Teilen . Allerdings gibt es mehrere technische Unterschiede zwischen ihnen je nach Schwerpunkt des einzelnen Protokolls. Zum Beispiel mit dem Fokus auf Immunzellen aus der LP zu isolieren, untersucht ein Protokoll die Auswirkungen der verschiedenen enzymatischen Verdauung im Zellviabilität, Zelle Oberfläche Marker Ausdruck und die Zusammensetzung der isolierten Immunzellen5. Ein anderes Protokoll zeigt eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Isolierung von Lymphozyten ohne Dichte Zentrifugation6. Schließlich gibt es spezifische Protokolle auch zur Isolierung von mononukleären Phagozyten aus verschiedenen Gewebeschichten des Dünndarms7. Hier ist ein hoch reproduzierbare Protokoll, sequentielle Isolation der Lymphozyten-Populationen aus dem MLN, PP, LP und IEL Fach des Dünndarms ermöglicht, präsentiert.

Wir konzentrieren uns auf hochgereinigte Populationen aus der LP und IEL Fächer, die weitgehend frei von Verunreinigungen aus anderen Darm Fächer sind zu isolieren. Dies verbreitete Protokoll erzeugt eine hohe Ausbeute an maximal rein und lebensfähige Lymphozyten innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen4,8,9,10,11,12. Dieses Protokoll sorgt dafür auch die Isolation der Lymphozyten aus dem LP und IEL Fach mit minimalen wohnzimmertaugliche Kreuzkontamination, eine bona fide Möglichkeit zum Lymphozyten in diese unterschiedliche Fächer studieren. Die isolierten Lymphozyten können weitere Manipulationen wie durchflusszytometrischen Analyse oder funktionelle Analyse unterzogen werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf die Isolation der Lymphozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm bei bakteriellen Infektionen wie Listeria Monocytogenes, Salmonella Typhimuriumund Yersinia Pseudotuberculosis angewendet Infektionen und entzündlichen Erkrankungen wie z. B. chemische und Pathogen-induzierten Kolitis. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um angeborene immune Zellen wie dendritische Zellen, Makrophagen, Neutrophilen und Monozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm zu isolieren.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien des National Institute of Health und durch die Stony Brook University institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Genehmigungen erteilt werden, vor der Durchführung der Verfahren.

1. Vorbereitung der Lösung

  1. HGPG (HEPES, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und Gentamycin), 100 ×
    1. Mischen Sie 59,6 g HEPES 500 mM (final), 14,6 g L-Glutamin 200 mM (final), 1 × 106 U Penicillin (2.000 U/mL final), 1 g Streptomycin (2 mg/mL final) und 2,5 mg Gentamicin (5 µg/mL final). Hinzufügen von RPMI 1640 bis 500 mL. Anpassen der pH-Wert auf 7,5 mit NaOH (vor der Anpassung, der Puffer ist gelb/Orange mit einem pH-Wert um 6,0). Filter mit einem 0,45 µm-Filter zu sterilisieren. Aliquoten und Store bei-20 ° C bis zu 1 Jahr oder bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
  2. HEPES-Bicarbonat-Puffer, 10-fach
    1. 23,8 g HEPES 100 mM (Finale), 21 g Nahco33 (250 mM final) mischen und 1.000 mL Wasser hinzufügen. PH-Wert auf 7,2 mit HCl. Filter einstellen mit einem 0,45-μm-Filter zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern. Der pH-Wert ändert sich im Laufe der Zeit. Neu zu justieren pH in regelmäßigen Abständen.
  3. Medien zu ernten (~ 1 Flasche/2-Mäuse)
    1. 500 mL RPMI 1640 fügen Sie hinzu, 25 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum (5 % final) und 5 mL 100 × HGPG. Speichern Sie bis zu 6 Monate bei 4 ° C.
  4. Dithioerythritol (DTE) Lösung (40 mL/kleine Darm)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks ausgeglichene Salzlösung, Ca2+- und Mg2+-kostenlos, 50 mL 10 × HEPES-Bikarbonat Puffer und 50 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum (10 % final). 350 mL H2O und 15,4 mg Dithioerythritol/100 mL (1 mM final) hinzufügen. Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.
  5. Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-Lösung (50 mL/kleine Darm)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks ausgeglichene Salzlösung, Ca2+- und Mg2+-gratis mit 5 mL 100 × HGPG. Fügen Sie 445 mL H2O. hinzufügen 260 µL 0,5 M EDTA/100 mL (1,3 mM final). Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.
  6. Kollagenase-Lösung (30 mL/LP)
    1. Hinzufügen 500 mL RPMI, 50 mL EB (10 % FBS Final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (Finale 1 mM) und 1 mL 0,5 M CaCl2 (Finale 1 mM). Fügen Sie Kollagenase, Typ I (100 U/mL Final). Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.
  7. Dichte-Gradienten (DG) Lösungen
    1. 1 × DG-Stammlösung durch das Mischen von 90 mL DG-Stammlösung vorbereiten (siehe die Tabelle der Materialien) mit 10 mL 10 × PBS. Bei 4 ° c steril halten
    2. Bereiten Sie 44 % DG Lösung (8 mL/IEL, 8 mL/LP), durch das Mischen von 44 mL der Stammlösung 1 × GD und 56 mL RPMI 1640. Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.
    3. Bereiten Sie 67 % DG Lösung (5 mL/IEL, 5 mL/LP), durch das Mischen von 67 mL der Stammlösung 1 × GD und 33 mL RPMI 1640. Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.

2. Isolierung der mesenterialen Lymphknoten, Darm, und Peyer Patches

  1. Einschläfern Sie die Maus mit CO2-Narkose und sekundäre zervikale Dislokation. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken und sprühen Sie mit 70 % Ethanol. Mit einer Schere einen Midline Schnitt machen, und öffnen Sie die Haut und Bauchdecke in die Bauchhöhle aussetzen.
  2. Suchen Sie den Blinddarm und verwenden Sie Zange, um den Blinddarm ziehen vorsichtig nach unten. Verwenden Sie Zange vorsichtig bewegen des Dünndarms nach rechts, Freilegung der gesamten MLN-Kette, die mit dem Doppelpunkt ausgerichtet ist.
    Hinweis: Eine Karte der mesenterialen Lymphknoten, die Kette und lymphatische Drainage des Darms zuvor war dargestellt13.
  3. Identifizieren Sie den unteren Knoten in der Kette, befindet sich am nächsten an der Blinddarm. Verwenden Sie eine Reihe der Zange zu fassen das Mesenterium/Fett um ihn herum und MLN Kette entfernen sanft von unten nach oben durch das Fett aus den Lymphknoten mit einem anderen Satz von Pinzetten tweezing.
  4. Legen Sie die Mio-Kette auf einem Papiertuch angefeuchtet mit Ernte Medien. Mesenterium/Fett durch Rollen der Kette auf dem Papier-Turm und das Fett abziehen, mit zwei Sätzen der Zange zu entfernen. Legen Sie die MLN in kalten Ernte Medien für die spätere Isolierung Schritte.
    Hinweis: (i) direkte Handhabung der Knoten wird abgeraten. Greifen Sie stattdessen das Mesenterium/Fett um sie herum. (Ii) Es ist wichtig, Mesenterium/Fett so viel wie möglich, um die Zellviabilität verbessern zu entfernen.
  5. Schneiden Sie der Dünndarm unterhalb der Pylorussphinkter und oberhalb der Blinddarm mit einer Schere. Herausziehen der Darm langsam vom Ileum Zwölffingerdarm mit einem Satz von Zange beim Entfernen der angehängten Mesenterium/Fettes mit einem anderen Satz von Zangen.
  6. Legen Sie den Darm auf ein Papiertuch mit Ernte Medien befeuchtet und necken Sie verbleibenden Mesenterium/Fett weg mit zwei Zangen.
    Hinweis: (i) achten Sie darauf, Mesenterium/Fett so viel wie möglich für optimale Zellausbeute und Lebensfähigkeit zu entfernen. (Ii) halten Sie den Darm in diese und die folgenden Schritte durch Anwendung Ernte Medien regelmäßig befeuchtet.
  7. Sammeln Sie Peyer Patches, indem Sie sie aus dem Darm mit einer gebogenen Schere entfernen. Verwenden Sie einen sezierenden Umfang oder Lupe ggf. (Anfänger); die meisten Peyer Patches sollten für das geschulte Auge sichtbar sein. Sammle 5-11 (typisch) Peyer Patches aus dem Dünndarm. Ort Peyer Flecken im kalten Ernte Medien für die spätere Isolierung Schritte.
    Hinweis: Peyer Patches sind kleine, in erster Linie Runde Ausbuchtungen im Darm Außenwand gegenüber der Linie des Mesenterium Anlage.
  8. Verwenden Sie die flache Seite der Zange und sanft gleiten vom Zwölffingerdarm in Richtung Ileum, um fäkal Inhalt und Schleim zu vertreiben. Einmal wiederholen Sie, um die meisten der Schleim zu entfernen.
    Hinweis: Unvollständiger Entfernung des Schleims kann verringern Zellviabilität und Ertrag. Doch achten Sie darauf, den Darm sanft zur Vermeidung stripping Zotten oder beschädigen der Basalmembran schieben.
  9. Verwenden Sie feine Schere mit einem stumpfen Ende in einem Punkt, stecken Sie das stumpfe Ende in den Darm und schneiden Sie des Darms längs von Zwölffingerdarm auf, Krummdarm. Seitlich schneiden Sie der geöffneten Darm in ~ 2 cm Stücke. Legen Sie die intestinale Stücke in einem 50 mL konische Röhrchen mit 25 mL kalte Ernte Medien für die spätere Isolierung Schritte.
    Hinweis: Halten Sie die Schere angefeuchtet mit Medien mühelos durch den Darm schieben helfen.

3. Isolation von Lymphozyten aus dem induktiven Websites

  1. Isolieren Sie Lymphozyten von MLN, indem Sie sanft durch eine 70 µm Zelle Sieb mit den Kolben einer 3-mL-Spritze aufzulösen. Waschen Sie Zelle Sieb mit 5 mL kalte Ernte Medien.
  2. Pellet MLN-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien aufzuwirbeln. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung.
    Hinweis: rote Blutzelle Lysis Puffer kann rote Blutkörperchen zu entfernen, wenn Blutungen während der Entfernung aufgetreten verwendet werden.
  3. Lymphozyten von Peyer Patches von Peyer Patches in einem 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL vorgewärmt Kollagenase-Lösung bei 37 ° C und 220 u/min für 30 min Inkubation zu isolieren.
  4. Wirbel für 15 s bei maximaler Einstellung und Filter verdaut Gewebe und überstand in ein 50 mL konische Rohr durch ein Sieb 70 µm Zelle. Sanft distanzieren Sie die Reststücke Gewebe mit den Kolben der Spritze 3 mL und waschen Sie die Zelle-Sieb mit 5 mL kalte Ernte Medien.
  5. Pellet-Peyer Patch Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung.
    Hinweis: Peyer des Patches Isolierung möglicherweise einige kontaminierenden Lamina Propria Lymphozyten und intraepitheliale Lymphozyten.

4. Isolierung der intraepithelialen Lymphozyten aus dem Dünndarm

  1. Waschen Sie die Teile des Dünndarms, dreimal mit 25 mL kalte Ernte Medien durch Umkehrung der Röhre 10 Mal, lassen den Darm Stücke zu begleichen und gießt den überstand.
    Hinweis: Gewebe Stücke sollte leicht auf den Boden des Rohres zu begleichen. Wenn sie dies nicht tun, ist es ein Hinweis darauf, dass zuviel Mesenterium/Fett befestigt bleibt oder sie verbunden mit einer Luftblase sind.
  2. Die 50 mL konische Röhrchen mit Darm Stücke 20 mL vorgewärmte DTE-Lösung hinzu und übertragen Sie auf eine 50 mL silikonisierte Erlenmeyerkolben mit rühren-Bar. Rühren Sie bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 20 min. verwenden einen grossen Magneten auf der Außenseite des Kolbens rühren-Bar zu halten und das Gewebe und die Lösung zurück auf die 50 mL konische Rohr übertragen.
  3. Wirbel der Röhre bei maximaler Einstellung für 10 S. Übertragung des Überstands in ein neues 50 mL konische Rohr durch ein 70 µm Zelle Sieb achtgeben, die Gewebe-Stücke in den original Schlauch zu halten. Bewahren Sie den Überstand; der Überstand enthält intraepitheliale Lymphozyten. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL kalte Ernte Medien und speichern auf Eis.
  4. Die 50 mL konische Röhrchen mit Darm Stücke 20 mL vorgewärmte DTE-Lösung hinzu und transfer zurück zu den 50 mL silikonisierte Erlenmeyerkolben mit rühren-Bar. Rühren Sie bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 20 min. verwenden einen grossen Magneten auf der Außenseite des Kolbens rühren-Bar zu halten und das Gewebe und die Lösung zurück auf die 50 mL konische Rohr übertragen.
    Hinweis: DTE ist ein Reduktionsmittel, die intraepitheliale Lymphozyten bereichert.
  5. Wirbel der Röhre bei maximaler Einstellung für 10 S. Transfer des Überstands durch ein 70-µm-Zelle-Sieb in der vorherigen Röhrchen mit Zellen aus der überstand die erste DTE-Behandlung (aus Schritt 4.3).
    Hinweis: Der Darm Reststücke werden zur Lymphozyten aus der Lamina Propria zu isolieren. Qualitätskontrolle: Ein Stück des Gewebes kann entfernt und histologisch überprüft, um sicherzustellen, dass die Epithelzellen vorhanden sind und der Basalmembran intakt ist.
  6. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren des Überstands bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 mL 44 % DG Lösung bei Raumtemperatur (RT).
  7. Transfer der 8 mL 44 % DG Lösung/Zellsuspension in einem 17 mm Ø X 100 mm Stil 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen. Unterlage mit 5 mL RT 67 % DG Lösung. Zentrifugieren Sie bei 1600 × g für 20 min bei RT ohne mit der Bremse.
    Hinweis: Rohre können mit Rinderserum zu verhindern, dass Zellen festhalten an die Rohrwände vorbehandelt werden.
  8. Beachten Sie, dass lebensfähige Zellen eine Band (buffy Coat) an der Schnittstelle von 44 % bis 67 bilden %, abgestorbene Zellen und einige Epithelzellen in einem schleimigen Film an der Spitze des Verlaufs sind und der roten Blutkörperchen im Pellet sind. Entfernen Sie die obere Schicht des Farbverlaufs auf innerhalb von ~ 2 cm von der Schnittstelle durch Vakuum Aspiration. Verwenden Sie eine Pasteurpipette buffy Mantel an der Schnittstelle zu ernten und übertragen Sie sie auf eine 50 mL konische Röhrchen mit 40 mL kalte Ernte Medien.
  9. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien aufzuwirbeln. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung.

(5) Isolierung der Lamina Propria Lymphozyten aus dem Dünndarm

  1. Entfernen Sie durch Zugabe von 25 mL vorgewärmte EDTA-Lösung in den Kolben mit dem Darm Reststücke Epithelzellen aus Darmgewebe Stücke. Rühren-Kolben bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 30 min. verwenden einen grossen Magneten an der Außenseite des Kolbens, rühren-Bar zu halten und sorgfältig entsorgen Überstand unter Beibehaltung Darm Stücke innerhalb der Flasche.
    Hinweis: (i) EDTA ist ein Kalzium-Chelator, die richtet sich an Kalzium-abhängige Kreuzungen und fördert die Ablösung der intestinalen Epithelzellen. (Ii) der Überstand soll bewölkt und kann verwendet werden, um die IEC zu isolieren, wenn ihre Sammlung gewünscht wird.
  2. Wiederholen Sie Schritt 5.1.
    Hinweis: Der Überstand sollte weniger bewölkt nach dieser Inkubationszeit. Qualitätskontrolle: Ein Stück des Gewebes kann entfernt und histologisch überprüft, um sicherzustellen, dass die intestinale Epithelzellen wurden entfernt und der Basalmembran intakt ist. Ein Beispiel aus der Überstand durch Durchflusszytometrie bestätigen auch beurteilt werden kann, dass Leukozyten (CD45+ Zellen) sind nicht vorhanden.
  3. Die Flasche 50 mL RT Ernte Medien hinzufügen. Rühren Sie kurz mit einem Magneten. Lassen Sie Darm Stücke zu begleichen und den Überstand vorsichtig zu verwerfen.
    Hinweis: Diese Schritt wird sichergestellt das Entfernen von EDTA vor Kollagenase Verdauung, wie EDTA Kollagenase inaktiviert von chelatisierenden das Kalzium, das für Kollagenase Funktion entscheidend.
  4. 30 mL vorgewärmte Kollagenase-Lösung in den Kolben und verrühren Sie Darm Stücke bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 45 Minuten.
  5. Übertragen Sie verdaute Gewebe und überstand auf eine 50 mL konische Rohr durch Filterung durch ein Sieb 70 µm Zelle. Distanzieren Sie sanft Reststücke Gewebe mit den Kolben der Spritze 3 mL Brei durch den Filter. Waschen Sie den Filter mit 10 mL kalte Ernte Medien.
  6. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 mL Umgebungstemperatur 44 % DG Lösung.
  7. Transfer der 8 mL 44 % DG Lösung/Zellsuspension in einem 17 mm Ø X 100 mm Stil 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen. Unterlage mit 5 mL der Umgebungstemperatur 67 % DG Lösung. Zentrifugieren Sie die Steigungen bei Raumtemperatur und 1600 × g für 20 min mit keine Bremse.
  8. Entfernen Sie die Fettschicht an der Spitze von Vakuum Aspiration. Verwenden Sie eine Pasteurpipette buffy Mantel an der Schnittstelle und Transfer in ein 50 mL konische Röhrchen mit 40 mL kalte Ernte Medien zu ernten.
  9. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien aufzuwirbeln. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung.

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Representative Results

Eine schematische Darstellung des Protokolls dargestellt (Abbildung 1). Lymphozyten in der Darmschleimhaut induktive und Effektor Websites sind deutlich organisiert. Peyer ist Patches (PP) und mesenterialen Lymphknoten (MLN) enthalten Lymphozyten in gut organisierten Bereichen der T-Zellen und B-Zell-Follikel, während das Darmepithel Lymphozyten enthält, die mehr diffus verteilt werden. Die Lamina Propria (LP) enthält sowohl diffus verteilte Lymphozyten und Lymphozyten enthaltenen organisierte lymphatischen Strukturen wie isolierte lymphoide Follikel (ILF) und Cryptopatches. Jeder Darm immun Fach wird auch durch eine einzigartige Zusammensetzung der Lymphozyten-Teilmengen (Abbildung 2) verkörpert. Der Mio ist überwiegend bestehend aus αβ T-Zellen (~ 70 %), während PP Lymphozyten sind meist B-Zellen (~ 80 %). LP-Lymphozyten Zusammensetzung ist weitgehend Belastung abhängig, sondern in erster Linie bestehend aus αβ T-Zellen und B-Zellen. Verschieden von den anderen Darm Abteilen, wohnhaft in das Epithel Lymphozyten sind vor allem γδ T-Zellen (~ 60 %) und αβ T-Zellen mit im Wesentlichen keine B-Zellen. Unterschiedliche Proportionen der αβ T Zelle Teilmengen gibt es auch unterschiedliche anatomische Standorten des Darms. Die αβ T-Zellen in der LP sind hauptsächlich CD4+ T Zellen (~ 70 %), während CD8α+ T Zellen (~ 85 %) dominieren die intraepitheliale Lymphozyten (IEL) Fach. CD8α+ αβ T-Zellen innerhalb der LP und IEL Fächer CD8αα Homodimer oder CD8αβ Heterodimer ausdrücken, während induktive Website CD8α+ αβ T Zellen überwiegend express CD8αβ Heterodimer (Abbildung 3). Die Mehrheit der γδ T-Zellen in das Fach IEL express auch CD8α, während γδ T-Zellen in der MLN fehlenden CD8α gefunden (Abbildung 3). Unabhängig von Allgemeinheiten die Zusammensetzung der Lymphozyten-Teilmengen kann variieren zwischen Mausstämme und kann mit dem Alter oder Krankheit verändert werden. So sollte eine sorgfältige Analyse der Lymphozyten-Populationen innerhalb der Darmschleimhaut im Steady-State in den Hintergrund-Stamm genutzt für die experimentelle Manipulationen durchgeführt werden.

Zellausbeute variieren stark je nach Sorte und Alter der Mäuse und experimentellen Bedingungen verwendet. Einzelne, live Zellen können auf eine Hemocytometer oder eine automatisierte Zelle Zählmaschine verwenden Trypan blau Ausgrenzung gezählt werden. Die Anzahl der Lymphozyten werden berechnet als: Cell Count × CD45+ Zellen (%) im Gate 3 × Lymphozyten (%) im Tor 4 (Abbildung 2). Ca. 15 × 106 MLN Lymphozyten, 5 bis 10 × 106 PP Lymphozyten, 2 bis 5 × 106 LP Lymphozyten und 3 bis 6 × 106 IEL können eine 8 bis 12 Wochen alten naiven C57Bl/6 oder Balb/c Maus entnommen werden. Alternativ können lastflussbasierten zählende Perlen zur Zell-Populationen mit dem Vorbehalt, dass Zellverlust während der Färbung Prozess Auftritt zu quantifizieren. Letztlich ist Konsistenz in zählen Technik einzuhalten, im Labor, um sicherzustellen, dass entsprechende Vergleiche über Experimente gemacht werden können.

In diesem Protokoll wird DTE Behandlung zur IEL, bereichern, gefolgt von EDTA Behandlung IEC für optimale Isolation von hochangereichertem Lymphozyten zu entfernen. Zwei DTE Behandlungen ausreichen, um zu isolieren > 95 % der IEL. Eine sehr kleine Anzahl von Lymphozyten finden Sie auch bei der EDTA-Behandlung. Diese Lymphozyten ähneln eine Mischung aus IEL und LP Lymphozyten (Abbildung 4). Ein Vergleich der DTE-Behandlung und kombinierte DTE-EDTA, IEL zu isolieren ist auch durchgeführt worden. DTE-EDTA Kombinationsbehandlung IEC Kontamination bei der IEL Vorbereitung (Abbildung 5) erhöht und reduziert final Erträge von live Immunzellen nach Dichte-Gradienten-Zentrifugierung. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung wird empfohlen, Lymphozyten aus dem Darm Fächer zu isolieren. Es entfernt abgestorbene Zellen, die vielen Epithelzellen und Schleim, fördert die Isolation von hochangereichertem Lymphozyten und drastisch sinkende Durchflusszytometrie Erwerb Zeiten (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1 . Flussdiagramm der Isolierung Protokoll. DTE, Dithioerythritol. EDTA, Ethylenediaminetetraacetic Säure. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Eine Strategie für die Lymphozyten-Populationen von intestinalen Gewebe Anspritzung Durchflusszytometrie. Einzelne Zellensuspensionen aus der mesenterialen Lymphknoten (MLN), Lamina Propria (LP), Peyer Patches (PP) und intraepitheliale Lymphozyten (IEL) Fach vorbereitet waren voller Flecken mit fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff (z.B. Live/Dead) und die folgenden Leuchtstoff-markierten Antikörpern: CD45 zur Identifizierung der hämatopoetischen Zellen, CD19 für B-Zellen, CD3ε für T-Zellen, T-Zell-Rezeptor (TCR) β für αβ T-Zellen, TCRδ für γδ T-Zellen, CD8α für CD8α+ αβ T Zellen und CD4 für CD4+ αβ T-Zellen. Tor 0 zeigte nach vorne Scatter (FSC) - A/Side Scatter (SSC) - A Eigenschaften. Tor 1 identifiziert einzelne Zellen. Tor 2 identifiziert lebenden Zellen. Tor 3 identifiziert blutbildende Zellen. Tor 4 identifiziert Lymphozyten basierend auf FSC-A/SSC-A Eigenschaften. Tor 5 identifiziert T-Zellen und B-Zellen. Tor 6 ermittelten αβ T-Zellen und γδ T-Zellen unter total T-Zellen. Gate 7 identifiziert CD8α+ und CD4+ T-Zellen in der αβ-T-Zell-Population. Prozentsätze (in roter Schrift) in Pseudofarben Grundstücke entsprechen die Frequenz der Zellen innerhalb des angegebenen Gates in der vorhergehenden elterliche Bevölkerung. 0-Tor und Tor 1 Anzeigen Gesamtereignisse Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Der Phänotyp ofCD8α+ αβ T-Zellen und γδ T-Zellen in den intestinalen Geweben. Der Ausdruck des CD8β von CD8α+ αβ T-Zellen und die Expression von CD8α durch γδ T Zellen dargestellt. Prozentsätze (in roter Schrift) innerhalb Histogramme entsprechen die Frequenz der Zellen, die die angegebene Markierung der angegebenen elterliche Bevölkerung zum Ausdruck bringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Die Zusammensetzung der Lymphozyten von DTE, EDTA und Kollagenase-Behandlungen. Die elterliche gating Strategie ist die gleiche wie in Abbildung 2. Tor 5 identifiziert T-Zellen und B-Zellen. Tor 6 ermittelten αβ T-Zellen und γδ T-Zellen unter total T-Zellen. Gate 7 identifiziert CD8α+ und CD4+ T-Zellen in der αβ-T-Zell-Population. Prozentsätze (in roter Schrift) in Pseudofarben Grundstücke entsprechen die Frequenz der Zellen innerhalb des angegebenen Gates in der vorhergehenden elterliche Bevölkerung. Lymphozyten aus EDTA Isolation haben Ähnlichkeit mit einer Mischung aus IEL und LP-Lymphozyten isoliert von DTE und Kollagenase Behandlungen bzw.. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Ein Vergleich der DTE und kombinierte DTE-EDTA-Behandlung für die Isolierung von IEL. DTE-Behandlung wurde nach diesem Protokoll durchgeführt. IEL wurden gesammelt, nach DTE Behandlungen und vor EDTA-Behandlungen. DTE-EDTA Kombinationsbehandlung wurde in den gleichen Konzentrationen, die in diesem Protokoll verwendeten, aber zur gleichen Zeit durchgeführt. Die FSC-A/SSC-A Eigenschaften, Wirtschaftlichkeit und der Prozentsatz der CD45+ hämatopoetische Zellen gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 . Die Auswirkungen der Dichte Gradienten Zentrifugation auf die Reinheit der IEL und LP Lymphozyten Vorbereitungen. Einzelne Zellsuspensionen isoliert nach diesem Protokoll wurden ausgesetzt Dichte-Gradienten-Zentrifugierung oder direkt durch Durchflusszytometrie analysiert. Die FSC-A/SSC-A Eigenschaften, Wirtschaftlichkeit und der Prozentsatz der CD45+ hämatopoetische Zellen gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Ein detailliertes Protokoll wird für die Isolierung von Lymphozyten aus der intestinalen Schleimhaut präsentiert, induktive (MLN und PP) und Effektor (LP und IEL Fach) Seiten. Das Protokoll wurde entwickelt, um (Uhrzeit) und Ausgang (Lebensfähigkeit und Ertrag) zur Maximierung der Produktivität und Ergebnisse zu balancieren. Das Protokoll gewährleistet auch minimal wohnzimmertaugliche Kreuzkontaminationen zwischen LP und IEL Fächer.

Mehrere Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus dem Dünndarm Maus wurden veröffentlicht3,4,5,6,7. Die meisten dieser Protokolle konzentrieren sich auf Immunzellen aus der LP zu isolieren. Das Darmepithel ist eine ausgeprägte Fach aus der LP, die direkt auf das äußere Umfeld ausgesetzt ist und besteht aus einer einzigartigen Zusammensetzung von Lymphozyten. Neuere Ansätze haben eine globale Analyse der Funktion des Immunsystems im Darm versucht, durch die Untersuchung deutliche Darm Fächer gleichzeitig, um die einzigartigen Aspekte der Immunantwort, die in diesen Fächern und die Beziehungen zu verstehen zwischen ihnen. Daher ist ein zuverlässiges Protokoll für die Isolierung von Immunzellen aus diesen Fächern erwünscht. Zwei DTE Behandlungen ausreichen, um zu isolieren > 95 % der IEL und einige IEC. EDTA zielt auf Kalzium-abhängige Kreuzungen und ist effizient, IEC zu lösen. Daher der Überstand von den nachfolgenden EDTA-Behandlungen umfassen meist IEC. Eine sehr kleine Anzahl von Lymphozyten finden Sie in der Überstand nach EDTA Behandlung; Allerdings sind etwa 20-fold mehr Lymphozyten aus der DTE-Fraktion gewonnen. Darüber hinaus Lymphozyten von EDTA Behandlung ähneln gemischte Populationen von IEL und LP Lymphozyten (Abbildung 4), die LP-Kontamination von Zotten und Krypta schlägt vor Schäden. Daher in diesem Protokoll IEL sind gesammelt von der DTE-Behandlung vor der EDTA Behandlung Reinheit durch Minimierung der Kreuz-Fach Kontamination zu maximieren. Andere Protokolle verwenden sequenzielle Dithiothreitol (DTT)-EDTA-Behandlungen oder kombinierte DVB-t-EDTA-Behandlung für die Isolierung von IEL5,6,7. DVB-t ist ein Epimer der DTE und beide wirken als Reduktionsmittel. In diesen Protokollen DTT wird berichtet, dass nur Schleim entfernen und EDTA wird verwendet, um IEL zu isolieren. Obwohl die Wirkung von DVB-t und DTE nicht direkt verglichen wurde, wurde IEL nach DTE oder eine kombinierte DTE-EDTA Behandlung bewertet. Nicht überraschend, DTE-EDTA Kombinationsbehandlung erhöht IEC Kontamination bei der IEL Vorbereitung (Abbildung 5) und das Vorhandensein einer großen Zahl von IEC IEL Erträge nach Dichte-Gradienten-Zentrifugierung abgenommen. Da EDTA einige Zotten und Krypten beschädigen kann, kombinierte DTE-EDTA Behandlung auch Verunreinigung des LP-Lymphozyten bei der IEL Vorbereitung oder Verlust von LP Zellen aus der LP-Isolation führen. Außerdem ist, wie > 95 % der IEL wurden isoliert von der DTE-Bruch, separate DTE und EDTA Behandlungen werden bevorzugt. Einige Protokolle isolieren Lymphozyten ohne Dichte-Gradienten-Zentrifugierung, um Immunzellen6zu bereichern. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung braucht zusätzliche Zeit und Verlust von einigen Zellen auftreten. Jedoch entfernt es abgestorbene Zellen, Epithelzellen und Schleim, führt zu hoch angereicherten Lymphozyten Populationen (Abbildung 6), die hilft, um die Erkennung kleiner Populationen von Zellen zu verbessern und wesentlich verringert Erfassungszeit für Durchfluss Zytometrie. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung wird berichtet, zu einer veränderten Verhältnis von mononukleären Phagozyten Teilmengen7führen. Lymphozyten Teilmenge Zusammensetzung scheint jedoch normal. Es ist besonders hilfreich für die Isolierung von IEL Dichte-Gradienten-Zentrifugierung durchzuführen. Insgesamt wird ein vollständiges Protokoll präsentiert, um hoch angereicherten und optimal lebensfähige Lymphozyten aus allen die intestinale Gewebe einschließlich der LP und IEL mit minimalen Kreuz-Substruktur Kontamination zu isolieren.

Erhebliche Zeit und Sorgfalt während Gewebe isoliert Schritte ergreifen, Kontamination zwischen Zubereitungen zu begrenzen. Unvollständiger Entfernung von PP kann LP Lymphozyten stark verzerren. ILF kann auch LP Vorbereitungen kontaminieren. Allerdings ILF nicht mit dem bloßen Auge gesehen werden und daher nicht operativ entfernt werden vor der Verdauung. Verschiedene Mausstämme haben eine unterschiedliche Anzahl von ILF14, die stark auf die Variable Zusammensetzung der LP Lymphozyten zwischen Mausstämme beitragen können. Beim Entfernen von Schleim, achten Sie darauf, schieben Sie den Darm zur Vermeidung von Schäden an der Basalmembran und LP, LP Kontamination der IEL führen. Ein Hinweis auf Verunreinigungen ist die Anwesenheit einer großen Anzahl von B-Zellen bei der IEL Vorbereitung. IEL enthalten einige B-Zellen (~ 1 % oder weniger), während LPL kann bis zu 60 % B-Zellen abhängig von der Sorte der Maus haben. CD19 aber nicht B220 sollte verwendet werden, B-Zellen bei der LP und IEL Fach zu identifizieren wie Darmzellen T B22015auch ausdrücken können. Darüber hinaus können viele T Darmzellen traditionelle Makrophagen und DC Marker wie CD11b und CD11c, bzw.16ausdrücken. Daher sollten geeignete Müllkippe gating Strategien genutzt werden, um entsprechende Analysen zu gewährleisten.

Schritte können Forscher Bedürfnisse angepasst werden. Mechanische Verdauung kann ausreichen, für PP-Lymphozyten isoliert im Steady-State oder Kollagenase Verdauung der Lymphknoten kann erleichtern, Isolierung von einige Untergruppen von Leukozyten während einer Entzündung. Die Art der Kollagenase verwendet möglicherweise erhebliche Auswirkungen auf die Zelle Oberfläche Marker Ausdruck und die Lebensfähigkeit und Reinheit der LP Lymphozyten5,17. Der Darm kann in kleine Stücke für die Kollagenase Verdauung geschnitten werden die Zellausbeute erhöhen können. Es reduziert jedoch auch die Lebensfähigkeit. Die Inkubationszeit mit Kollagenase kann optimiert werden, um den Ertrag bei gleichzeitiger Minimierung des Zelltods führt zu maximaler Erholung von lebenden Zellen zu maximieren. Verschiedene Labors verwenden geringfügig Dichtegradienten Lymphozyten zu isolieren. Ein gut etabliertes 44/67 % Dichte Gradienten Protokoll wird hier vorgestellt. Forscher können testen, verschiedene Dichtegradienten um ihren individuellen Bedürfnissen am besten entspricht. Wenn eine größere Anzahl von Lymphozyten gewünscht werden, können zwei Dünndarm DTE Behandlungen, EDTA-Behandlungen und Kollagenase Verdauung kombiniert werden. Wenn mehr als zwei Darm für die Prüfung extrem seltene Ereignisse erforderlich sind, empfiehlt es, dass einzelne Zellsuspensionen nach Isolierung gebündelt sind.

Isolierte Lymphozyten können zur weiteren phänotypischen, funktionalen und genomische Analyse verwendet werden. Wenn Sie durchflusszytometrischen Analyse durchführen, ist es sehr ratsam, immer verwenden Sie eine Lebensfähigkeit Farbstoffe und Anti-CD45 Antikörper auszuschließen, abgestorbene Zellen und nicht blutbildenden Zellen, die die Analyse erheblich steigern werden. Wenn reine Lymphozyten Bevölkerung benötigt werden, Zell-Sortierung von CD45+ Zellen zusammen mit anderen Markern Wahl durchgeführt werden können. Schwenken auf Anti-CD8α-beschichtete Platten kann auch verwendet werden, um reine T-Zellen von IEL Vorbereitung zu isolieren, da Großteil diese T express CD8α Zellen. Schwenken oder Zellsortierung ist in der Regel erforderlich, für die Kultur der IEL wie verunreinigen Epithelzellen IEL Wachstum hemmen kann. Feeder-Zellen wie naiv Splenocyten können auch hinzugefügt werden, IEL überleben in Kultur zu fördern. Wenn Anleger verwendet werden, ist es wichtig, Congenically nicht übereinstimmende Zellen um Populationen unterscheiden zu nutzen. Bakterielle Kontamination ist selten ein Problem in diesen kurzfristig funktionelle Studien wie Ernte Medien Penicillin, Streptomycin und Gentamicin enthält. Darüber hinaus entfernen zahlreiche Waschschritte und Dichte-Gradienten-Zentrifugierung die meisten Bakterien.

Die Isolierung Prozess ist zeitaufwändig und erfordert ein Gleichgewicht von Sorgfalt, Präzision und Geschwindigkeit für ein optimales Ergebnis. Dafür geeignete Manipulation der einzelnen Schritte bei gleichzeitiger Minimierung der Zeit zwischen Maus Opfer und Erhalt einer einzigen Zellsuspension um Zellviabilität und Ertrag zu maximieren, muss genügend Zeit ausgegeben werden. Dies ist ein empfindliches Gleichgewicht, das auch ein Engpass für Anfänger, die versuchen, die Konsistenz bei der Isolierung von Lymphozyten mit hoher Wirtschaftlichkeit und Rendite zu erhalten. Eine komplette Isolierung dauert ab Maus Sterbehilfe für die Erlangung einer gezählten Einzelzelle Suspension eine erfahrener Forscher ca. 8 h für 8 Mäuse. Es empfiehlt sich, Unterstützung für mehr als 8 Mäuse erzeugen qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Es ist wichtig, sorgfältig zu verwenden, beim Vergleich von Lymphozyten aus diesen Geweben mit Lymphozyten aus der Milz, Blut oder anderen lymphatischen Geweben wie die umfangreiche Inkubationen zu künstlichen Veränderungen im Zusammenhang mit der Isolierung Verfahren17führen kann. Routinemäßige Vergleiche von LP und IEL Populationen ähnlich behandelten lymphatischen Gewebe würde prüfen, ob die Markierung des Interesses während Lymphozyten isoliert von intestinalen Gewebe moduliert wird. Ähnliche Probleme sind auch ein wichtiges Anliegen, beim Vergleich von RNA-Profile aus dem Darm mit denen aus den lymphatischen Geweben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

B.S.S. wird von NIH Grant (R01 AI076457) und von der Stony Brook University zur Verfügung gestellten Mittel unterstützt. Z.Q stützt sich auf NIH (K12 GM102778) zu gewähren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

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References

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Immunologie Ausgabe 132 Lymphozyten Dünndarm mesenterialen Lymphknoten Peyer Patches Lamina Propria intraepitheliale Lymphozyten Durchflusszytometrie
Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems
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Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

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