Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281
Automatic Translation
1, 1
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

Summary

Her beskriver vi en detaljert protokoll for isolering av lymfocytter fra de induktive nettstedene inkludert gut-assosiert lymfoid vev Peyers oppdateringer og drenering hvem lymfeknuter og effektor områdene inkludert lamina propria og intestinal epitel i små intestinal immunsystemet.

Abstract

Intestinal immunsystemet spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen barriere i fordøyelsessystemet ved å generere tolerant Svar å kosttilskudd antigener og gram-negative bakterier mens montering effektiv immunreaksjoner til enteropathogenic mikrober. I tillegg har det blitt klart at lokale intestinal immunitet har en betydelig innflytelse på fjernt og systemisk immunitet. Derfor er det viktig å studere hvordan en intestinal immunrespons er indusert og hva immunologic utfallet av svaret. Her en detaljert protokoll er beskrevet for isolering av lymfocytter fra tynntarm induktiv nettsteder som gut-assosiert lymfoid vev Peyers oppdateringer og drenering hvem lymfeknuter og effektor nettsteder som lamina propria og intestinal epitel. Denne teknikken sikrer isolering av et stort antall lymfocytter fra små intestinal vev med optimal renhet og levedyktighet og minimal avdelingsflytting krysskontaminering innen akseptabel tidsbegrensninger. Teknisk mulighet til å isolere lymfocytter og andre immunceller fra intestinal vev gjør forståelsen av immunreaksjoner gastrointestinale infeksjon, kreft og inflammatoriske sykdommer.

Introduction

Fordøyelsessystemet (GI) har mange folder og utstikkende deler som representerer det største grensesnittet skille selve interne og eksterne miljøet. Intestinal immunsystemet spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen barriere i mage-tarmkanalen. Det er stadig utsatt kosttilskudd antigener og gram-negative bakterier patogene mikrober. Som sådan, må det være tolerant mat antigener og gram-negative bakterier samtidig bevare evnen til å raskt generere en effektiv immun respons til enteropathogenic mikrober1. Intestinal immunsystemet kan anatomisk deles inn i induktiv, hvor naiv er aktivert av antigen presentere celler bærer antigener fra tarmen, og effektor områder, der aktivert lymfocytter utøve bestemte effektor fungerer2. De induktive nettstedene utgjør organisert lymfoide strukturen Peyers lapper (PP) som undersøkelser av intestinal lumen direkte gjennom handlingen av spesialiserte M celler og regionale drenering hvem lymfeknuter (MLN). Webområdene effektor består av lamina propria (LP), som er bindevevet under kjelleren membranen og intestinal epitel, en enkeltcelle lag over kjelleren membranen som inneholder intraepithelial lymfocytter (IEL). Lymfocytter er viktige spillere av adaptiv immunitet som megle beskyttelse mot infeksjoner og kreft, og kan også bidra til immunopathology i inflammatoriske sykdommer. Det er viktig og svært relevant å studere lymfocytter i disse forskjellige anatomiske mucosal avdelinger å bedre forstå sine induksjon og effektor funksjoner.

En relativt enkel og enhetlig protokoll for isolering av lymfocytter fra seksjonene er nødvendig som antall etterforskere utforske immun hendelser som forekommer i tarmen akselererer. Flere forskningsgrupper har publisert protokoller som deler flere lignende prosesser for å isolere immunceller fra musen liten intestinal rom3,4,5,6,7 . Det er imidlertid flere tekniske forskjeller mellom dem avhengig av fokus for individuelle protokollen. For eksempel, med fokus på isolere immunceller fra LP, undersøker en protokoll virkningen av ulike enzymatisk digestions celle levedyktighet, celle overflaten markør uttrykk og sammensetningen av isolerte immunceller5. En annen protokoll fremhever en rask og reproduserbar metode for isolering av lymfocytter uten tetthet sentrifugering6. Til slutt finnes bestemte protokoller også for å isolere mononukleære phagocytes fra ulike vev lag av tynntarmen7. Her, presenteres en svært reproduserbar protokoll som tillater sekvensiell isolasjon av lymfocytt befolkningen fra MLN, PP, LP og IEL rommet i tynntarmen.

Vi fokuserer på isolere høyrenset bestander fra LP og IEL rom, som er hovedsakelig forurensninger fra andre intestinal avdelinger. Dette brukte protokollen gir en høy avkastning av maksimalt ren og levedyktig lymfocytter innen akseptabel tid begrensninger4,8,9,10,11,12. Denne protokollen sikrer også isolering av lymfocytter fra LP og IEL rommet med minimal avdelingsflytting krysskontaminering, slik at en bona fide mulighet til å studere lymfocytter i forskjellige seksjonene. Isolert lymfocytter kan utsettes for ytterligere manipulasjoner som flyt cytometric analyse eller funksjonell analyse. Denne protokollen utlignet ble til isolering av lymfocytter fra musen tynntarm og tykktarm under bakterielle infeksjoner som Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumog Yersinia pseudotuberculosis infeksjoner og inflammatoriske tilstander som kjemisk - og patogen-indusert kolitt. Denne protokollen kan også brukes til å isolere medfødte immunsystemet celler som dendrittiske celler, makrofager, nøytrofile og monocytter fra musen tynntarm og tykktarm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble gjennomført i henhold til National Institute of Health retningslinjer og godkjent av Stony Brook University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

Merk: Kontroller at alle godkjenninger er gitt før prosedyrer.

1. løsning forberedelse

  1. HGPG (HEPES, L-glutamine, penicillin/streptomycin og gentamycin), 100 ×
    1. Bland 59.6 g HEPES (500 mM endelige), 14,6 g L-glutamin (200 mM endelige), 1 × 106 U penicillin (2000 U/mL siste), 1 g streptomycin (2 mg/mL endelige) og 2,5 mg gentamicin (5 µg/mL siste). Legge til RPMI 1640 til 500 mL. Justere pH til 7.5 bruker NaOH (før justering, bufferen er gule/oransje med en pH rundt 6.0). Filteret sterilisere bruke filtere 0,45 µm. Aliquot og lager ved 20 ° C i opptil 1 år eller 4 ° C i opptil 1 måned.
  2. HEPES-bikarbonat buffer, 10 x
    1. Bland 23.8 g HEPES (100 mM endelige), 21 g NaHCO3 (250 mM endelige) og tilsett vann til 1000 mL. Justere pH til 7.2 HCl. filter sterilisere bruke filtere 0,45 μm. Lagre ved romtemperatur. PH endringer over tid. Re-justere pH regelmessig.
  3. Høste media (~ 1 flaske/2-mus)
    1. Legge til 25 mL inaktivert fosterets bovin serum (5% endelige) og 5 mL 100 × HGPG 500 mL RPMI 1640. Lagre opptil 6 måneder til 4 ° C.
  4. Dithioerythritol (DTE) løsning (40 mL/små tarmen)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks balansert salt løsning, Ca2+- og Mg2+-gratis, 50 mL 10 × HEPES-bikarbonat buffer og 50 mL inaktivert fosterets bovin serum (10% siste). Legge til 350 mL H2O og 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM endelige). Klargjør denne friske før bruk.
  5. Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning (50 mL/små tarmen)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks balansert salt løsning, Ca2+- og Mg2+-gratis med 5 mL 100 × HGPG. Legge til 445 mL H2O. legge 260 µL 0,5 M EDTA/100 mL (1,3 mM endelige). Klargjør denne friske før bruk.
  6. Collagenase løsning (30 mL/LP)
    1. 500 mL RPMI, legge til 50 mL FBS (10% FBS endelig), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (1 mM endelige) og 1 mL 0,5 M CaCl2 (1 mM endelige). Legg collagenase, Type I (100 U/mL endelig). Klargjør denne friske før bruk.
  7. Tetthet gradert (DG) løsninger
    1. Forberede 1 × DG lager løsning ved å blande 90 mL DG lagerløsning (se Tabell for materiale) med 10 mL 10 × PBS. Holde sterile på 4 ° C.
    2. Forberede 44% DG løsning (8 mL/IEL, 8 mL/LP) ved å blande 44 mL 1 × DG lagerløsning og 56 mL RPMI 1640. Klargjør denne friske før bruk.
    3. Forberede 67% DG løsning (5 mL/IEL, 5 mL/LP) ved å blande 67 mL 1 × DG lagerløsning og 33 mL RPMI 1640. Klargjør denne friske før bruk.

2. isolering av hvem lymfeknutene, innvoller og Peyer oppdateringer

  1. Euthanize musen bruker karbondioksid narkose og sekundære cervical forvridning. Plasser musen på ryggen og spray med 70% etanol. Bruk saks for å gjøre en midtlinjen snitt, og åpne huden og bukveggen å avsløre bukhulen.
  2. Finn caecum og bruk tang til å trekke forsiktig i caecum. Bruk tang til å nøye flytte tynntarmen til høyre, utsette hele MLN kjeden, som er justert med kolon.
    Merk: Et kart over hvem lymfeknutene kjede og lymfatiske drenering av tarmen var tidligere avbildet13.
  3. Identifisere noden nederst i kjeden, ligger nærmest til cecum. Bruke ett sett med tang til å forstå mesentery/fett rundt og forsiktig fjerne MLN kjeden fra bunnen til toppen av tweezing fettet fra rundt lymph node med et annet sett med tang.
  4. Lå MLN kjeden på et papirhåndkle fuktet med harvest media. Fjern mesentery/fett ved å rulle kjeden på papir tårnet og trekke fettet av to sett med tang. Sett av millioner i kalde harvest medier for senere isolasjon trinn.
    Merk: (i) direkte håndtering av nodene er motløs. I stedet tak mesentery/fett rundt seg. (ii) det er viktig å fjerne så mye mesentery/fett som mulig å forbedre celle levedyktighet.
  5. Kuttet tynntarmen under den inn sphincter og over cecum med saks. Trekk tarmen sakte fra ileum tolvfingertarmen bruke ett sett med tang mens du fjerner det vedlagte mesentery/fettet med et annet sett med tang.
  6. Plasser tarmen på et papirhåndkle fuktet med harvest media og erte eventuelle gjenværende mesentery/fett av to sett med tang.
    Merk: (i) må du fjerne så mye mesentery/fett som mulig for optimal celle avkastning og levedyktighet. (ii) holde tarmen fuktet gjennom dette og følgende ved å bruke harvest media regelmessig.
  7. Samle Peyers oppdateringer ved å fjerne dem fra tarmen med buet saks. Bruke en dissecting omfang eller forstørrelsesglasset hvis nødvendig (nybegynner); de fleste Peyers oppdateringer skal vises til trenet øye. Samle 5-11 (typisk) Peyers oppdateringer fra tynntarm. Sted Peyer flekker i kalde harvest medier for senere isolasjon trinn.
    Merk: Peyer patcher er små, hovedsakelig rundt buler i ytre tarmveggen overfor linjen av mesentery vedlegg.
  8. Bruk flate siden av tang og forsiktig lysbilde fra tolvfingertarmen mot ileum for å utvise fecal innhold og slim. Gjentas én gang for å fjerne det meste av slim.
    Merk: Ufullstendig fjerning av Slim kan redusere celle levedyktighet og gi. Likevel, pass på å skyve tarmen forsiktig for å unngå stripping villi eller skade kjelleren membranen.
  9. Bruke fine saks med en butt enden på ett punkt, sett den butte enden inn i tarmen og klippes tarmen langs fra tolvfingertarmen til ileum. Sidelengs kuttet åpnet tarmen i ~ 2 cm biter. Plass intestinal bitene i en 50-mL konisk rør med 25 mL kaldt harvest medier for senere isolasjon trinn.
    Merk: Holde saksen fuktet med media vil hjelpe dem lysbilde uanstrengt gjennom tarmen.

3. isolering av lymfocytter fra induktiv nettsteder

  1. Isolere lymfocytter fra millioner av forsiktig dissociating gjennom en 70-µm celle sil bruker stempelet til en 3-mL sprøyte. Vask celle sil med 5 mL kaldt harvest media.
  2. Pellet MLN-celler av sentrifugering 400 × g i 5 min på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 1 mL kaldt harvest medier. Antall levedyktige cellers bruker trypan blå eksklusjon.
    Merk: røde blodlegemer lyseringsbuffer kan brukes til å fjerne røde blodlegemer hvis blødning oppstod under fjerning.
  3. Isolere lymfocytter fra Peyers oppdateringer ved rugende Peyers oppdateringer i et 15-mL konisk rør som inneholder 5 mL prewarmed collagenase løsning på 37 ° C og 220 rpm for 30 min.
  4. Vortex 15 s på maksimum og filter fordøyd vev og nedbryting i en 50-mL konisk rør gjennom en 70-µm celle sil. Forsiktig distansere gjenværende vev bitene bruke stempelet til en 3-mL sprøyte og vask celle silen med 5 mL kaldt harvest media.
  5. Pellets Peyers oppdateringen celler av sentrifugering 400 × g i 5 min på 4 ° C og resuspend celle pellet i 1 mL kaldt harvest medier. Antall levedyktige cellers bruker trypan blå eksklusjon.
    Merk: Peyer's patcher isolasjon kan ha noen skadelige lamina propria lymfocytter og intraepithelial lymfocytter.

4. isolering av Intraepithelial lymfocytter fra tynntarm

  1. Vask biter av tynntarmen tre ganger med 25 mL kaldt harvest media invertere røret 10 ganger, la intestinal bitene bosette og helle av nedbryting.
    Merk: Vev stykker bør lett bosette til bunnen av røret. Hvis ikke, er det en indikasjon at mye mesentery/fett fortsatt festet eller de er knyttet til en luftboble.
  2. Legg til 20 mL prewarmed DTE løsning til 50 mL konisk røret som inneholder tarmen stykker og overføre til en 50-mL silikoniserte Erlenmeyer kolbe som inneholder en rør-bar. Rør på 37 ° C og 220 rpm på en magnetisk rørestang i 20 min. bruke en stor magnet på utsiden av flasken å holde rør-baren og overføre vev og løsningen tilbake til 50-mL konisk røret.
  3. Vortex tube på maksimum innfatning for 10 s. overføring nedbryting inn i et nytt 50 mL konisk rør gjennom en 70-µm celle sil forsiktige for å holde vev brikkene i opprinnelige røret. Ikke kast nedbryting; nedbryting inneholder intraepithelial lymfocytter. Pellet celler av sentrifugering 400 × g i 5 min på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 10 mL kaldt harvest media og lagre på isen.
  4. Legg til 20 mL prewarmed DTE løsning til 50 mL konisk røret som inneholder tarmen stykker og overføre tilbake til 50-mL silikoniserte Erlenmeyer kolbe som inneholder en rør-bar. Rør på 37 ° C og 220 rpm på en magnetisk rørestang i 20 min. bruke en stor magnet på utsiden av flasken å holde rør-baren og overføre vev og løsningen tilbake til 50-mL konisk røret.
    Merk: DTE er et reduksjonsmiddel som beriker intraepithelial lymfocytter.
  5. Vortex tube på maksimum innfatning for 10 s. overføring nedbryting gjennom en 70-µm celle sil i forrige røret som inneholder celler fra nedbryting av første DTE behandling (fra trinn 4.3).
    Merk: De resterende intestinal stykkene brukes til å isolere lymfocytter fra lamina propria. Kvalitetskontroll: Et stykke vev kan fjernet og kontrollert histologisk slik at epitelceller finnes og kjelleren membranen er intakt.
  6. Pellet celler av sentrifugering nedbryting 400 × g i 5 min på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 8 mL av 44% DG løsning ved romtemperatur (RT).
  7. Overføring 8 mL 44% DG løsning/mobiltelefon suspensjon til en 17 mm ø x 100 mm stil 14-mL polypropylen runde bunn rør. Underlag med 5 mL RT 67% DG. Sentrifuge 1600 × g for 20 min på RT uten å bruke bremsen.
    Merk: Rør kan være forbehandlet med bovin serum å hindre celler fra stikker til røret veggene.
  8. Merk at levedyktige cellers danne et band (buffy pels) på 44 til 67% grensesnittet, døde celler og noen epitelceller er i en mucoid film øverst i forløpningen, og de røde blodlegemene er i pellet. Fjerne det øverste laget av gradient til enn ~ 2 cm til grensesnittet av vakuum aspirasjon. Bruk en Pasteur pipette å høste buffy pelsen på grensesnittet og overføre dem til en 50-mL konisk rør som inneholder 40 mL kaldt harvest media.
  9. Pellet celler av sentrifugering 400 × g i 5 min på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 1 mL kaldt harvest medier. Antall levedyktige cellers bruker trypan blå eksklusjon.

5. isolering av Lamina Propria lymfocytter fra tynntarm

  1. Fjern epitelceller fra tarmen tissue stykker ved å legge til 25 mL prewarmed EDTA løsning kolbe inneholder gjenværende intestinal bitene. Rør kolbe på 37 ° C og 220 rpm på en magnetisk rørestang for 30 min. Bruk en stor magnet på utsiden av flasken å holde rør-baren og nøye forkaste nedbryting samtidig intestinal stykker i flasken.
    Merk: (i) EDTA er en kalsium chelator som mål kalsium-avhengige veikryss og fremmer brøkdel av intestinal epitelceller. (ii) nedbryting skal skyet og kan brukes til å isolere IEC hvis deres samling ønskes.
  2. Gjenta trinn 5.1.
    Merk: Nedbryting bør være mindre skyet etter denne inkubasjon. Kvalitetskontroll: Et stykke vev kan fjernet og kontrollert histologisk slik at intestinal epitelceller er fjernet og kjelleren membranen er intakt. Et eksempel fra nedbryting kan også vurderes av flowcytometri å bekrefte at leukocytter (CD45+ celler) er fraværende.
  3. Legge til 50 mL av RT harvest media kolbe. Rør kort med en magnet. La intestinal stykker bosette og nøye forkaste nedbryting.
    Merk: Dette trinnet sikrer fjerning av EDTA før collagenase fordøyelsen som EDTA deaktiverer collagenase av chelaterande kalsium som er kritisk for collagenase funksjon.
  4. Legge til 30 mL av prewarmed collagenase løsning kolbe og rør intestinal brikker på 37 ° C og 220 rpm på en magnetisk rørestang i 45 minutter.
  5. Overføre fordøyd vev og nedbryting til en 50-mL konisk rør ved å filtrere gjennom en 70-µm celle sil. Forsiktig distansere gjenværende vev stykker ved hjelp av stempelet til en 3-mL sprøyte til MOS gjennom filteret. Filteren vaskes med 10 mL kaldt harvest medier.
  6. Pellet celler av sentrifugering 400 × g i 5 min på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 8 mL omgivelsestemperatur 44% DG løsning.
  7. Overføring 8 mL 44% DG løsning/mobiltelefon suspensjon til en 17 mm ø x 100 mm stil 14-mL polypropylen runde bunn rør. Underlag med 5 mL omgivelsestemperatur 67% DG. Sentrifuge graderingene ved romtemperatur og 1600 × g for 20 min med ingen brems.
  8. Fjerne fett lag på toppen av vakuum aspirasjon. Bruke en Pasteur pipette for å høste buffy pelsen på grensesnittet og overføring til en 50-mL konisk rør som inneholder 40 mL kaldt harvest media.
  9. Pellet celler av sentrifugering 400 × g i 5 min på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 1 mL kaldt harvest medier. Antall levedyktige cellers bruker trypan blå eksklusjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk fremstilling av protokollen er avbildet (figur 1). Lymfocytter intestinal mucosa induktive og effektor områder er tydelig organisert. Peyer's patcher (PP) og hvem lymfeknuter (MLN) inneholde lymfocytter i velorganisert T-celle områder og B-celle follicles, mens intestinal epitel inneholder lymfocytter som distribueres mer diffusely. Lamina propria (LP) inneholder både diffusely distribuert lymfocytter og lymfocytter i organisert lymfoide strukturer som isolert lymfoide follikler (ILF) og cryptopatches. Hver intestinal immun kupé er også preget av en unik sammensetning av lymfocytt delsett (figur 2). MLN er hovedsakelig består av αβ T-celler (~ 70%), mens PP lymfocytter er det meste B-celler (~ 80%). LP lymfocytt sammensetning er hovedsakelig belastning-avhengige men primært består av αβ T celler og B-cellene. Forskjellig fra de andre intestinal avdelinger, er lymfocytter i epitel hovedsakelig γδ T-celler (~ 60%) og αβ T-celler med egentlig ingen B-celler. Forskjellige andelen αβ T-celle delsett finnes også tydelig anatomiske steder av tarmen. Αβ T-celler i LP er hovedsakelig CD4+ T celler (~ 70%), mens CD8α+ T celler (~ 85%) dominerer i rommet intraepithelial lymfocytter (IEL). CD8α+ αβ T celler i LP og IEL seksjonene uttrykke CD8αα homodimer eller CD8αβ heterodimer mens induktiv nettstedet CD8α+ αβ T celler hovedsakelig express CD8αβ heterodimer (Figur 3). Fleste γδ T-cellene i IEL rommet uttrykker også CD8α, mens γδ T-celler finnes i MLN mangel CD8α (Figur 3). Uansett generelle, sammensetningen av lymfocytt delsett kan variere mellom musen stammer og kan bli endret med alder eller sykdom. Som sådan, skal en grundig analyse av lymfocytt befolkningen i av intestinal slimhinnene i stabil utføres i bakgrunnen belastningen benyttes for eksperimentell manipulasjoner.

Cellen avkastning kan variere avhengig av belastningen og alder av mus og eksperimentelle forhold brukes. Enkelt, levende celler kan telles på en hemocytometer eller en automatisert celle telling maskin bruker trypan blå eksklusjon. Antallet lymfocytter beregnes som: cellen antall × CD45+ celler (%) i Gate 3 × lymfocytter (%) i Gate 4 (figur 2). Ca 15 × 106 millioner lymfocytter, 5-10 × 106 PP lymfocytter, 2-5 × 106 LP lymfocytter og 3-6 × 106 IEL kan fås fra en 8-12 uke-gamle naive C57Bl/6 eller Balb/c mus. Flyt-baserte telling perler kan eventuelt brukes å kvantifisere celle populasjoner med forbeholdet at cellen brutt under farging prosessen. Til slutt, konsekvent teller teknikken må opprettholdes i laboratoriet for å sikre at riktige sammenligninger kan gjøres over eksperimenter.

I denne protokollen brukes DTE behandling å berike IEL, som er etterfulgt av EDTA behandlingen å fjerne IEC for optimal isolering av høyanriket lymfocytter. To DTE behandlinger er tilstrekkelig til å isolere > 95% av IEL. Et lite antall lymfocytter kan også finnes i EDTA behandling. Disse lymfocytter ligner en blanding av IEL og LP lymfocytter (Figur 4). En sammenligning av DTE behandling og kombinert DTE-EDTA behandling å isolere IEL blitt også utført. Kombinert DTE-EDTA behandling øker IEC forurensning i IEL forberedelsene (figur 5) og reduserer siste avkastning av live immunceller etter tetthet gradert sentrifugering. Tetthet gradert sentrifugering anbefales å isolere lymfocytter fra intestinal seksjonene. Det fjerner døde celler, mange epitelceller og slim, fremme isolering av høyanriket lymfocytter og drastisk redusere flowcytometri oppkjøpet tid (figur 6).

Figure 1
Figur 1 . Flytdiagram for isolasjon protokollen. DTE, dithioerythritol. EDTA, ethylenediaminetetraacetic syre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . En flowcytometri gating strategi for lymfocytt befolkningen fra intestinal vev. Enkeltcelle suspensjoner på hvem lymfeknuter (MLN), lamina propria (LP), Peyers oppdateringer (PP) og intraepithelial lymfocytter (IEL) rommet var farget med fixable levedyktighet fargestoff (f.eks Live/Dead) og følgende fluorescerende-merket antistoffer: CD45 for identifikasjon av blodkreft cellene, CD19 for B celler, CD3ε t celler, T-celle reseptor (TCR) β for αβ T celler, TCRδ for γδ T celler, CD8α for CD8α+ αβ T celler og CD4 for CD4+ αβ T celler. Gate 0 viste frem xy (FSC) - A/siden scatter (SSC) - A egenskaper. Gate 1 identifisert enkeltceller. Gate 2 identifisert lever celler. Gate 3 identifisert blodkreft cellene. Gate 4 identifisert lymfocytter basert på FSC-/ SSC AA egenskaper. Gate 5 identifisert T celler og B-cellene. Gate 6 identifisert αβ T celler og γδ T celler blant totalt T-celler. Gate 7 identifisert CD8α+ og CD4+ T celler i αβ T celle befolkningen. Prosenter (i rødt) innen pseudofarger, det vil tomter tilsvarer antallet celler innenfor den angitte porten blant de foregående foreldre. Gate 0 og gate 1 vise totale hendelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Fenotypen ofCD8α+ αβ T celler og γδ T celler i intestinal vev. Uttrykk for CD8β av CD8α+ αβ T celler og uttrykk for CD8α av γδ T-cellene er avbildet. Prosenter (i rødt) i histogrammer tilsvarer antallet celler som uttrykker angitt markøren blant angitte foreldrenes befolkningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Sammensetningen av lymfocytter fra DTE, EDTA og collagenase behandlinger. Foreldre gating strategien er det samme som i figur 2. Gate 5 identifisert T celler og B-cellene. Gate 6 identifisert αβ T celler og γδ T celler blant totalt T-celler. Gate 7 identifisert CD8α+ og CD4+ T celler i αβ T celle befolkningen. Prosenter (i rødt) innen pseudofarger, det vil tomter tilsvarer antallet celler innenfor den angitte porten blant de foregående foreldre. Lymfocytter av EDTA minner om en blanding av IEL og LP lymfocytter isolert fra DTE og collagenase behandlinger, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . En sammenligning av DTE behandling og kombinert DTE-EDTA behandling for isolering av IEL. DTE behandling ble utført i henhold til denne protokollen. IEL ble samlet etter DTE behandlinger og før EDTA behandlinger. Kombinert DTE-EDTA behandling ble utført på samme konsentrasjonen i denne protokollen, men samtidig. Egenskapene FSC-/ SSC AA, levedyktighet og andelen CD45+ blodkreft cellene vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Virkningen av tetthet gradert sentrifugering på renheten av IEL og LP lymfocytt forberedelsene. Enkelt celle suspensjoner isolert i henhold til denne protokollen var utsatt for tetthet gradert sentrifugering eller analysert av flowcytometri direkte. Egenskapene FSC-/ SSC AA, levedyktighet og andelen CD45+ blodkreft cellene vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En detaljert protokoll presenteres for isolering av lymfocytter fra den intestinal slimhinnene induktiv (MLN og PP) og effektor (LP og IEL rom). Protokollen er utviklet for å balansere (tid)-inngang og utgang (levedyktighet og avkastning) for å maksimere produktiviteten og resultater. Protokollen sikrer også minimal avdelingsflytting krysskontaminering mellom LP og IEL rom.

Flere protokoller for isolering av immunceller fra tynntarm musen har vært publisert3,4,5,6,7. De fleste av disse protokollene fokus på isolere immunceller fra LP. Intestinal epitel er en distinkt kupé fra LP som er direkte utsatt for eksterne miljøet og består av en unik sammensetning av lymfocytter. Siste tilnærminger har søkt en mer global analyse av immunforsvar i tarmen ved å undersøke forskjellige intestinal rom samtidig for å forstå de unike aspektene av immunreaksjoner forekommer i seksjonene og forholdene mellom dem. Derfor er en protokoll som er pålitelig for isolering av immunceller fra alle seksjonene ønsket. To DTE behandlinger er tilstrekkelig til å isolere > 95% av IEL og noen IEC. EDTA mål kalsium-avhengige veikryss og effektiv koble IEC. Derfor nedbryting fra senere EDTA behandlinger består hovedsakelig IEC. Et lite antall lymfocytter finnes i nedbryting etter EDTA behandling; men er om 20-fold mer lymfocytter Hentet fra DTE brøkdel. Videre lymfocytter fra EDTA behandling ligner blandet bestander av IEL og LP lymfocytter (Figur 4), som foreslår LP forurensning fra villi og krypten skade. Derfor i denne protokollen, IEL er samlet fra DTE behandling før EDTA behandling, maksimere renhet ved å minimere kryss-compartment forurensning. Andre protokoller Bruk sekvensiell dithiothreitol (DTT)-EDTA behandlinger eller kombinert DTT-EDTA behandling for isolering av IEL5,6,7. DTT er en EPIM av DTE fungerer begge som reduserer agenter. I disse protokollene DTT rapporteres bare fjerne slim og EDTA brukes til å isolere IEL. Selv om effekten av DTT og DTE ikke var direkte sammenlignet, ble IEL etter DTE behandling eller kombinert DTE-EDTA behandling evaluert. Ikke overraskende, kombinert DTE-EDTA behandling øker IEC forurensning i IEL forberedelsene (figur 5) og tilstedeværelsen av et stort antall IEC redusert IEL gir etter tetthet gradert sentrifugering. Siden EDTA kan skade noen villi og Krypter, kombinert DTE-EDTA behandling kan også resultere i forurensning av LP lymfocytter i IEL utarbeidelse eller tap av LP celler fra LP isolasjon. Videre som > 95% av IEL ble isolert fra DTE brøkdel, separat DTE og EDTA behandlinger foretrekkes. Noen protokoller isolere lymfocytter uten å bruke tetthet gradert sentrifugering for å berike immunceller6. Tetthet gradert sentrifugering tar ekstra tid og tap av noen celler kan oppstå. Men fjerner det døde celler, epitelceller og slim, fører til høyt anriket lymfocytt befolkningen (figur 6), som bidrar til å forbedre gjenkjenning av små bestander av celler og betydelig reduserer anskaffet for flyt cytometri. Tetthet gradert sentrifugering har rapportert for å føre til endrede forhold av mononukleære phagocyte delsett7; lymfocytt delsett komposisjon vises imidlertid normalt. Det er spesielt nyttig å utføre tetthet gradert sentrifugering for isolering av IEL. Overall, en komplett protokoll er presentert for å isolere høyanriket og optimalt levedyktig lymfocytter fra alle intestinal vev inkludert LP og IEL med minimal kryss-avdelingsflytting forurensning.

Betydelig tid og omsorg må tas i vev isolasjon trinnene å begrense forurensning mellom forberedelser. Ufullstendig fjerning av PP kan sterkt skew LP lymfocytter. ILF kan også forurense LP forberedelser. Men ILF kan ikke ses med det blotte øye og derfor ikke kan fjernes kirurgisk før fordøyelsen. Annen mus stammer har forskjellig antall ILF14, som sterkt bidra til variabel sammensetningen av LP lymfocytter mellom musen stammer. Når du fjerner slim, må du Skyv tarmen for å unngå skade på kjeller membran og LP, som kan føre til LP forurensning av IEL. En indikasjon på forurensning er tilstedeværelsen av store antall B celler i IEL utarbeidelse. IEL inneholder noen B-celler (~ 1% eller mindre), mens LPL kan ha opptil 60% B celler avhengig av musen belastningen. CD19 men ikke B220 bør brukes til å identifisere B celler i LP og IEL rommet, som intestinal T celler kan også uttrykke B22015. Videre kan mange intestinal T-celler uttrykke tradisjonelle macrophage og DC markører som CD11b og CD11c, henholdsvis16. Derfor skal riktig dump gating strategier benyttes for å sikre riktig analyse.

Trinnene kan endres for å imøtekomme forskernes behov. Mekanisk fordøyelsen kan være tilstrekkelig for PP lymfocytt isolasjon på steady state eller collagenase fordøyelsen av lymph noder kan lette isolering av noen delsett av leukocytter ved betennelser. Typen collagenase brukes kan ha betydelig innvirkning på celle overflaten markør uttrykk og levedyktighet og renhet av LP lymfocytter5,17. Tarmen kan bli kuttet i små biter for collagenase fordøyelsen, som kan øke celle avkastning. Men reduserer det også levedyktighet. Inkubasjon tiden med collagenase kan optimaliseres for å maksimere avkastningen samtidig minimere celledød, fører til maks gjenoppretting av lever celler. Forskjellige labs bruke litt forskjellig tetthet forløpninger isolere lymfocytter. En veletablert 44% / 67% tetthet gradert protokollen er presentert her. Forskere kan teste ulike tetthet forløpninger passer deres individuelle behov. Hvis et større antall lymfocytter er ønskelig, kan to små tarmer kombineres for DTE behandlinger, EDTA behandlinger og collagenase fordøyelsen. Hvis flere enn to tarmen er nødvendig for å undersøke svært sjeldne hendelser, så anbefales det at enkeltcelle suspensjoner er gruppert etter isolasjon.

Isolert lymfocytter kan brukes for videre fenotypiske, funksjonelle og genomisk analyse. Når du utfører flyt cytometric analyse, er det svært anbefales å alltid bruk en levedyktighet fargestoffer og anti-CD45 antistoff ekskludere døde celler og ikke-blodkreft cellene, som vil kraftig forbedre analysen. Hvis ren lymfocytt befolkningen er nødvendig, celle sortering av CD45+ celler sammen med andre markører av valget kan utføres. Panorering på anti-CD8α-belagt plater kan også brukes til å isolere ren T celler fra IEL forberedelse som flertallet av disse T celler uttrykke CD8α. Panorering eller cellen sortering er vanligvis nødvendig for kultur IEL som forurensende epitelceller kan hemme IEL vekst. Mater celler som naive splenocytes kan også legges til fremme IEL overlevelse i kultur. Hvis matere brukes, er det viktig å benytte congenically feil celler for å skille populasjoner. Bakteriell forurensning er sjelden et problem i disse kortsiktige funksjonelle studier som harvest mediet inneholder penicillin, streptomycin og gentamicin. I tillegg fjerner mange vask trinnene og tetthet gradert sentrifugering de fleste bakterier.

Isolasjon prosessen er tidkrevende og krever en balanse av omsorg, presisjon og hastighet for optimale resultater. Nok tid brukes for å sikre riktig behandling av hvert trinn samtidig minimere tiden mellom musen offer og få en enkeltcelle suspensjon å maksimere celle levedyktighet og avkastning. Dette er en hårfin balanse som også er en flaskehals for nybegynnere prøve å få konsekvens i isolere lymfocytter med høy levedyktighet og avkastning. En hel isolasjon prosess fra musen euthanasia til å få en telt enkeltcelle suspensjon tar en erfaren forsker ca 8 h for 8 mus. Det anbefales hjelp for mer enn 8 mus å generere høy kvalitet og reproduserbar resultater. Det er viktig å bruke omsorg når sammenligne lymfocytter fra disse vev med lymfocytter milten, blod eller andre lymfoide vev som de omfattende incubations kan føre til kunstig filendringer tilknyttet isolasjon prosedyren17. Rutinemessig sammenligninger av LP og IEL bestander tilsvarende behandlet lymfoid vev ville vurdere om markøren rundt modulert under lymfocytt isolasjon fra intestinal vev. Lignende problemer er også svært viktig når du sammenligner RNA profiler fra tarmen med de fra lymfoid vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

B.S.S. støttes av NIH grant (R01 AI076457) og midler fra Stony Brook University. Z.Q. støttes av NIH gi (K12 GM102778).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Tags

Immunologi problemet 132 lymfocytter tynntarm hvem lymfeknuter Peyers patcher lamina propria intraepithelial lymfocytter flowcytometri
Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating… More

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter