Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من المواقع الاستقرائي بما في ذلك البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية واستنزاف الليمفاوية المساريقي العلوي، ومواقع المستجيب بما في ذلك بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء المناعي الأمعاء الصغيرة.

Abstract

الجهاز المناعي المعوي تلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي عن طريق توليد استجابات متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal بينما تصاعد فعالية الاستجابات المناعية ل enteropathogenic الميكروبات. وبالإضافة إلى ذلك، أنه أصبح من الواضح أن الحصانة المعوية المحلية تأثيراً عميقا على الحصانة البعيدة والجهازية. ولذلك، من المهم دراسة كيفية فعل استجابة مناعية معوية وما نتائج الاستجابة المناعية. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من مواقع الاستقرائي الأمعاء الدقيقة مثل البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية وتجفيف الغدد الليمفاوية المساريقي العلوي والمستجيب مثل بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء. ويضمن هذا الأسلوب عزل عدد كبير من الخلايا الليمفاوية من أنسجة الأمعاء الصغيرة مع النقاء الأمثل والبقاء والحد الأدنى من التلوث يغلب المتبادل ضمن قيود زمنية مقبولة. القدرة التقنية على عزل الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى من الأنسجة المعوية يمكن فهم الاستجابات المناعية لالتهابات الجهاز الهضمي، وأمراض السرطان، وأمراض التهابات.

Introduction

الهضمي (غي) بالعديد من الطيات ونتوءات تمثل واجهة أكبر فصل الهيئة الداخلية والبيئة الخارجية. الأمعاء الجهاز المناعي يلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي. استمرار تعرضه لمولدات المضادات الغذائية، commensal البكتيريا والجراثيم الممرضة. على هذا النحو، يجب أن تظل متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal مع الحفاظ على القدرة على سرعة توليد استجابة مناعية فعالة للميكروبات انتيروباثوجينيك1. ويمكن تقسيم المناعي المعوية تشريحيا إلى مواقع الاستقرائي، حيث يتم تنشيط لمفاوية الساذج من مستضد تقديم الخلايا تحمل مستضدات من مخاطية الأمعاء، ومواقع المستجيب، حيث يمارس تنشيط الخلايا الليمفاوية المحددة وظائف المستجيب2. وتشمل المواقع الاستقرائي هيكل اللمفاوية المنظم بقع في بييير (PP) أن الدراسات الاستقصائية التجويف المعوي مباشرة من خلال عمل الخلايا M المتخصصة والإقليمية استنزاف المساريقي العلوي الليمفاوية (مليون). تتألف مواقع المستجيب بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية)، وهو النسيج الضام تحت الغشاء الطابق السفلي، وظهاره الأمعاء، طبقة وحيد خلية الموجودة أعلى الغشاء الطابق السفلي يحتوي على الخلايا الليمفاوية للسيتولوجيا (IEL). الخلايا الليمفاوية هي الجهات الفاعلة الرئيسية من مناعة التكيفية التوسط من أجل الحماية ضد الالتهابات والأمراض السرطانية وقد يسهم أيضا في إيمونوباثولوجي في أمراض التهابات. من المهم وذات صلة وثيقة بدراسة الخلايا الليمفاوية في هذه متميزة المقصورات المخاطية تشريحية بشكل أفضل فهم وظائفها التعريفي والمستجيب.

ويلزم بروتوكول موحد وبسيط نسبيا لعزل الخلايا الليمفاوية من هذه المقصورات كما يتم التعجيل بعدد المحققين استكشاف محصنة ضد الأحداث التي تحدث في الأمعاء. مجموعات بحثية عديدة قد نشرت البروتوكولات التي تشترك في عدة عمليات مماثلة لعزل الخلايا المناعية من الماوس المقصورات الأمعاء الصغيرة3،4،،من56،7 . ومع ذلك، هناك العديد من الاختلافات التقنية فيما بينها تبعاً لتركيز البروتوكول الفردية. على سبيل المثال، مع التركيز على عزل الخلايا المناعية من ليرة لبنانية، وبروتوكول واحد يدرس أثر ديجيسشنز الانزيمية المختلفة على بقاء الخلية، الخلية السطحية علامة التعبير، وتكوين الخلايا المناعية معزولة5. بروتوكول آخر يسلط الضوء على طريقة سريعة واستنساخه لعزل الخلايا اللمفية دون كثافة استخدام الطرد المركزي6. وأخيراً، توجد بروتوكولات محددة أيضا غرض عزل البالعات وحيدات النوى من طبقات أنسجة مختلفة من الأمعاء الدقيقة7. ويرد هنا، استنساخه بشدة بروتوكول يسمح لعزل متسلسلة من السكان اللمفاويات من حجرة مليون PP، ليرة لبنانية و IEL من الأمعاء.

علينا أن نركز على عزل السكان عالية منقاة من المقصورات ليرة لبنانية و IEL، التي إلى حد كبير خالية من الملوثات من المقصورات المعوية الأخرى. وهذا يستخدم على نطاق واسع تنتج البروتوكول عائد عالية من الخلايا اللمفية أقصى نقية وقابلة للبقاء ضمن قيود وقت مقبول4،9،8،10،11،12. ويضمن هذا البروتوكول أيضا عزل الخلايا الليمفاوية من حجرة ليرة لبنانية و IEL مع الحد الأدنى من التلوث يغلب عبر، مما يتيح فرصة حسنة نية لدراسة الخلايا الليمفاوية في هذه المقصورات متميزة. لمفاوية معزولة يمكن أن تخضع للتلاعب أخرى مثل تدفق سيتوميتريك التحليل أو التحليل الوظيفي. هذا البروتوكول طبقت بنجاح إلى عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس الأمعاء والقولون خلال العدوى البكتيرية مثل الليستريه المستوحدة، typhimurium السالمونيلاو واليرسينيا بسيودوتوبيركولوسيس الإصابات والظروف الملتهبة مثل التهاب القولون الناجمة عن المواد الكيميائية والممرض. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لعزل الخلايا المناعية الفطرية مثل الخلايا الجذعية والضامة العَدلات وحيدات من الماوس الأمعاء الدقيقة والقولون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات كانت تجري وفقا للمبادئ التوجيهية "المعهد الوطني للصحة" ووافق ستوني بروك جامعة المؤسسية الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة.

ملاحظة: تأكد من أن يتم منح جميع الموافقات قبل تنفيذ الإجراءات.

1-حل إعداد

  1. هجبج (حبيس، ل الجلوتامين والبنسلين/ستربتوميسين مع الجنتامايسين)، 100 ×
    1. مزيج ز 59.6 حبيس (النهائي 500 ملم)، 14.6 ز لام الجلوتامين (نهائي 200 ملم)، 1 × 106 يو البنسلين (2,000 U/mL النهائي) وز 1 ستربتوميسين (2 مغ/مل النهائي) 2.5 ملغ الجنتاميسين (5 ميكروغرام/مل النهائي). إضافة RPMI 1640 إلى 500 مل. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (قبل التعديل، المخزن المؤقت الأصفر/البرتقالي مع الرقم الهيدروجيني حوالي 6.0). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر. قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة، أو عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. بيكربونات هيبيس المخزن المؤقت, 10 x
    1. مزيج ز 23.8 حبيس (نهائي 100 ملم)، 21 ز ناكو3 (النهائي 250 ملم) وإضافة الماء لمل 1,000. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2 مع HCl. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر. تخزين في درجة حرارة الغرفة. الرقم الهيدروجيني التغييرات على مر الزمن. إعادة ضبط الأس الهيدروجيني بشكل دوري.
  3. حصاد الإعلام (~ الفئران زجاجة 1/2)
    1. إلى 500 مل RPMI 1640، إضافة 25 مل إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل (5% النهائي)، ومل 5 × 100 هجبج. تخزين تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية.
  4. حل ديثيوريثريتول (DTE) (40 مل/الصغيرة الأمعاء)
    1. ميكس 50 مل 10 × الحل الملح المتوازن هانكس و Ca2+-ملغ2+--الحرة, 50 مل 10 × بيكربونات حبيس المخزن المؤقت، و 50 مل إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل (10% النهائي). إضافة 350 مل ح2س و 15.4 ملغ ديثيوريثريتول 100 مل (النهائي 1 مم). إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
  5. حل حمض (يدتا) الإيثيلين (50 مل الصغيرة الأمعاء)
    1. ميكس 50 مل 10 × الحل الملح المتوازن هانكس و Ca2+-ملغ2+--الحرة مع 5 مل 100 × هجبج. إضافة يدتا 0.5 M ميليلتر سين إضافة 260 مل 445 ح2/100 مل (النهائي 1.3 مم). إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
  6. الحل كولاجيناز (30 مل/ليرة لبنانية)
    1. إضافة إلى 500 مل ربمي، 50 مل FBS (10% FBS النهائي)، 5 مل 100 × هبجب ومل 1 0.5 م MgCl2 (النهائي 1 مم) 1 مل م 0.5 كاكل2 (النهائي 1 مم). إضافة كولاجيناز، النوع الأول (100 U/mL النهائي). إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
  7. الكثافة المتدرجة (DG) الحلول
    1. إعداد 1 × DG الأسهم الحل عن طريق خلط حل الأسهم 90 مل المديرية العامة (راجع الجدول للمواد) مع 10 مل من 10 × برنامج تلفزيوني. تبقى عقيمة في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد حل المديرية العامة 44% (8 مل/IEL، و 8 مل/ليرة لبنانية) عن طريق خلط مل 44 × 1 المديرية العامة حل الأسهم و 56 مل RPMI 1640. إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
    3. إعداد حل المديرية العامة 67% (5 مل/IEL، و 5 مل/ليرة لبنانية) عن طريق خلط مل 67 × 1 المديرية العامة حل الأسهم ومل 33 RPMI 1640. إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.

2-عزل الليمفاوية المساريقي العلوي، الأمعاء، وبييير لبقع

  1. Euthanize الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون الخدر والتفكك عنق الرحم الثانوي. ضع الماوس على ظهرها ورذاذ مع الإيثانول 70%. استخدام مقص لجعل شق خط الوسط، وفتح الجلد وجدار البطن لكشف التجويف الصفاقى.
  2. موقع في الأعور واستخدام الملقط لأجذب الأعور. استخدام الملقط لتحريك الأمعاء بعناية إلى اليمين، فضح في سلسلة مليون أسرة، والذي يتسق مع القولون.
    ملاحظة: صورت خريطة الليمفاوية المساريقي العلوي كان التصريف اللمفاوي وسلسلة من الأمعاء قبل13.
  3. تحديد العقدة السفلي في السلسلة، الموقع الأقرب إلى الأعور. استخدام مجموعة واحدة من الملقط لفهم مساريق/الدهون حوله وإزالة بلطف سلسلة مليون من الأسفل إلى الأعلى كاياالاقل الدهون من حول العقدة الليمفاوية مع مجموعة أخرى من الملقط.
  4. تكمن في سلسلة مليون على منشفة ورقية مبلل مع وسائل الإعلام الحصاد. إزالة مساريق/الدهون المتداول في السلسلة على برج الورق وسحب الدهون قبالة مع مجموعتين من الملقط. مكان مليون في وسائل الإعلام الحصاد الباردة للخطوات اللاحقة في عزلة.
    ملاحظة: يتم تثبيط المناولة (ط) مباشرة من العقد. بدلاً من ذلك، فهم مساريق/الدهون حولها. (ثانيا) من المهم لإزالة الدهون/مساريق قدر ممكن لتحسين بقاء الخلية.
  5. قطع الأمعاء الدقيقة أدناه مصرة البواب وأعلاه الأعور استخدام مقص. سحب الأمعاء ببطء من الدقاق إلى العفج باستخدام مجموعة واحدة من الملقط أثناء إزالة المرفق مساريق/الدهون باستخدام مجموعة أخرى من الملقط.
  6. ضع الأمعاء على منشفة ورقية مبلل مع وسائل الإعلام الحصاد وندف أي مساريق/الدهون المتبقية قبالة مع مجموعتين من الملقط.
    ملاحظة: (ط) يجب التأكد من إزالة الدهون/مساريق قدر ممكن للعائد الأمثل الخلية وقدرتها على البقاء. (ثانيا) إبقاء الأمعاء مبلل طوال هذا والخطوات التالية عن طريق تطبيق وسائل الإعلام الحصاد بشكل دوري.
  7. جمع البقع في بير بإزالتها من الأمعاء مع مقص منحنى. استخدام نطاق تشريح أو المكبرة إذا لزم الأمر (للمبتدئين)؛ بقع معظم بير يجب أن تكون مرئية للعين المدربة. جمع البقع في 5-11 (بشكل نموذجي) بير من الأمعاء. البقع "بييير المكان" في وسائل الإعلام الحصاد الباردة للخطوات اللاحقة في عزلة.
    ملاحظة: في بييير بقع صغيرة، أساسا جولة تضخمات في جدار الأمعاء الخارجي مقابل خط مرفق مساريق.
  8. استخدم الجانب المسطح من الشريحة الملقط و لطف من العفج نحو الدقاق لطرد محتوى البراز والمخاط. كرر مرة واحدة لإزالة معظم المخاط.
    ملاحظة: يمكن إنقاص صلاحية خلية الإزالة كاملة من مخاط والعائد. ومع ذلك، يجب التأكد من الشريحة الأمعاء برفق لتجنب تجريد الزوائد أو إتلاف الغشاء الطابق السفلي.
  9. استخدام مقص جيد مع نهاية حادة على نقطة واحدة وإدراج نهاية حادة في الأمعاء، وقطع الأمعاء مفتوحة طوليا من العفج إلى اللفائفي. جانبياً قص الأمعاء فتحت أربا ~ 2-سم. مكان القطع المعوية في أنبوب 50 مل مخروطية مع 25 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام للخطوات اللاحقة في عزلة.
    ملاحظة: حفظ المقص مبلل مع وسائل الإعلام سوف تساعدهم الشريحة دون عناء عن طريق الأمعاء.

3-عزل الخلايا الليمفاوية من مواقع حثي

  1. عزل الخلايا الليمفاوية من مليون بالناي بلطف من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر استخدام المكبس لحقنه 3 مل. أغسل مصفاة الخلية مع 5 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  2. بيليه مليون-الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.
    ملاحظة: يمكن استخدام المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء لإزالة خلايا الدم الحمراء إذا كان النزيف حدث أثناء الإزالة.
  3. عزل الخلايا الليمفاوية من البقع في بير بحضانة البقع في بير في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 5 مل بريوارميد كولاجيناز الحل في 37 درجة مئوية و 220 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  4. دوامة 15 s بتحديد الحد الأقصى وتصفية يهضم الأنسجة والمادة طافية في أنبوب مخروطي 50 مل من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. بلطف ننأى بقطع الأنسجة المتبقية استخدام المكبس لحقنه 3 مل وغسل مصفاة الخلية مع 5 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  5. بيليه التصحيح الخلايا في بير التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.
    ملاحظة: بير في عزلة بقع قد تكون بعض تلويث الصفيحة بروبريا اللمفاويات والخلايا اللمفية للسيتولوجيا.

4-عزل الخلايا اللمفية للسيتولوجيا من الأمعاء

  1. أغسل قطعة الأمعاء ثلاث مرات مع 25 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام بعكس الأنبوب 10 مرات، وترك القطع المعوية تسوية، وصب قبالة المادة طافية.
    ملاحظة: ينبغي أن يسهل تسوية قطع الأنسجة إلى الجزء السفلي من الأنبوب. إذا لم يفعلوا ذلك، إشارة إلى أن الكثير من مساريق/الدهون يبقى المرفقة أو المرتبطة فقاعة هواء.
  2. إضافة 20 مل من بريوارميد DTE الحل إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على قطع الأمعاء ونقل إلى قارورة Erlenmeyer siliconized 50 مل تحتوي على إثارة-بار. إثارة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسي ل 20 دقيقة استخدام مغناطيس كبيرة خارج قارورة لعقد إثارة الشريط ونقل الأنسجة وحل العودة إلى الأنبوبة المخروطية 50 مل.
  3. دوامة الأنبوب في الإعداد لنقل س. 10 المادة طافية في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر مع الحرص على إبقاء قطع الأنسجة في الأنبوب الأصلي كحد أقصى. عدم تجاهل المادة طافية؛ وتتضمن المادة طافية لمفاوية للسيتولوجيا. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام وتخزين على الجليد.
  4. إضافة 20 مل من بريوارميد DTE الحل إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على قطع الأمعاء ونقل مرة أخرى إلى قارورة Erlenmeyer siliconized 50 مل تحتوي على إثارة-بار. إثارة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسي ل 20 دقيقة استخدام مغناطيس كبيرة خارج قارورة لعقد إثارة الشريط ونقل الأنسجة وحل العودة إلى الأنبوبة المخروطية 50 مل.
    ملاحظة: DTE هو عامل تخفيض تثري لمفاوية للسيتولوجيا.
  5. دوامة الأنبوب في الإعداد لنقل س. 10 المادة طافية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب السابقة التي تحتوي على خلايا من المادة طافية معاملة DTE الأولى (من الخطوة 4، 3) كحد أقصى.
    ملاحظة: تستخدم القطع المعوية المتبقية لعزل الخلايا الليمفاوية من بروبريا الصفيحة. مراقبة الجودة: يمكن إزالة قطعة من الأنسجة ودققت الأشيع التأكد من أن الخلايا الظهارية موجودة والغشاء غير سليمة.
  6. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج المادة طافية في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 8 مل محلول المديرية العامة 44% في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. نقل تعليق الحل/خلية المديرية العامة 44% 8 مل في 17 ملم ø x 100 نمط مم 14 مل البوليبروبيلين الجولة-أسفل الأنبوبة. الأساس الذي تقوم عليه مع 5 مل من الرايت 67% DG الحل. الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 20 دقيقة في RT دون استخدام الفرامل.
    ملاحظة: قد بريتريتيد أنابيب مع المصل البقري منع الخلايا من الالتصاق بجدران الأنبوبة.
  8. نلاحظ أن خلايا قابلة للحياة يشكل عصابة (بافي معطف) في واجهة 44% إلى 67% وخلايا ميتة وبعض الخلايا الظهارية في فيلم مخاطاني في الجزء العلوي من التدرج، وخلايا الدم الحمراء في بيليه. إزالة الطبقة العليا من التدرج إلى حدود ~ 2 سم الواجهة بالشفط بالتخلية. استخدام ماصة باستور لحصاد معطف بافي في الواجهة وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 40 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  9. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.

5-عزل لمفاوية بروبريا الصفيحة من الأمعاء

  1. إزالة الخلايا الظهارية من قطع الأنسجة المعوية بإضافة 25 مل من بريوارميد يدتا الحل إلى قارورة تحتوي على القطع المعوية المتبقية. استخدام قارورة ضجة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسي للحد الأدنى 30 نقطة جذب كبيرة في الخارج من قارورة لعقد إثارة الشريط وتجاهل المادة طافية بعناية مع الاحتفاظ بالقطع المعوية داخل قارورة.
    ملاحظة: (ط) يدتا هو تشيلاتور كالسيوم التي تستهدف تقاطعات تعتمد على الكالسيوم ويعزز مفرزة الخلايا الظهارية المعوية. (ثانيا) المادة طافية ينبغي غائم، ويمكن أن تستخدم لعزل اللجنة الانتخابية المستقلة إذا هو المطلوب جمعها.
  2. كرر الخطوة 5، 1.
    ملاحظة: يجب أن تكون المادة طافية غائم أقل بعد هذه الحضانة. مراقبة الجودة: يمكن إزالة قطعة من الأنسجة ودققت الأشيع التأكد من أنه تم إزالة الخلايا الظهارية المعوية والغشاء الطابق السفلي غير سليمة. ويمكن أيضا تقييم عينة من المادة طافية بالتدفق الخلوي لتأكيد أن الكريات البيضاء (CD45+ الخلايا) غائبة.
  3. إضافة 50 مل الإعلام الحصاد RT قارورة. ضجة بإيجاز مع مغناطيس. واسمحوا القطع المعوية تسوية وتجاهل المادة طافية بعناية.
    ملاحظة: هذه الخطوة تضمن إزالة يدتا قبل الهضم كولاجيناز كما يحللها يدتا كولاجيناز من خالب الكالسيوم ضروري للدالة كولاجيناز.
  4. إضافة 30 مل من محلول كولاجيناز بريوارميد قارورة ويحرك قطع الأمعاء على 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسية لمدة 45 دقيقة.
  5. نقل الأنسجة هضمها والمادة طافية إلى أنبوب مخروطي 50 مل بعملية التصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. بلطف ننأى بالقطع الأنسجة المتبقية باستخدام المكبس لحقنه 3 مل إلى الهريس من خلال عامل تصفية. يجب غسل الفلتر مع 10 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  6. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 8 مل محلول المديرية العامة 44% درجة الحرارة المحيطة.
  7. نقل تعليق الحل/خلية المديرية العامة 44% 8 مل في 17 ملم ø x 100 نمط مم 14 مل البوليبروبيلين الجولة-أسفل الأنبوبة. الأساس الذي تقوم عليه مع 5 مل محلول المديرية العامة 67% درجة الحرارة المحيطة. الطرد المركزي التدرجات في درجة حرارة الغرفة و 1600 × ز لمدة 20 دقيقة مع لا الفرامل.
  8. إزالة طبقة الدهون في الأعلى بالشفط بالتخلية. استخدام ماصة باستور حصاد معطف بافي في الواجهة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 40 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  9. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد تمثيل تخطيطي للبروتوكول (الشكل 1). واضح يتم تنظيم الخلايا الليمفاوية داخل الغشاء المخاطي المعوي الاستقرائي ومواقع المستجيب. بير بقع (PP) والغدد الليمفاوية المساريقي العلوي (مليون) تحتوي الخلايا الليمفاوية في مناطق تي خلية منظمة تنظيماً جيدا والمسام ب-الخلية، بينما يحتوي ظهارة الأمعاء على الخلايا الليمفاوية التي توزع أكثر تصطبغ. بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية) يحتوي على الخلايا الليمفاوية تصطبغ الموزعة والخلايا اللمفية الواردة ضمن هياكل اللمفاوية المنظم مثل المسام اللمفاوية المعزول (أي ال إف) وكريبتوباتشيس. كل حجرة محصنة المعوية هو اتسمت أيضا بتركيبة فريدة من نوعها من مجموعات فرعية اللمفاويات (الشكل 2). معرض يغلب تتألف من خلايا تي αβ (~ 70 ٪)، في حين لمفاوية PP معظمها خلايا ب (~ 80 ٪). تكوين اللمفاويات ليرة لبنانية سلالة تعتمد إلى حد كبير ولكن تتألف أساسا من الخلايا αβ تي وخلايا ب. متميزة من المقصورات المعوية الأخرى، لمفاوية يقطنون الظهارة هي أساسا الخلايا التائية γδ (~ 60 ٪) وخلايا تي αβ مع لا خلايا ب أساسا. كما توجد نسب متميزة لمجموعات فرعية خلية T αβ داخل المواقع التشريحية المتميزة من الأمعاء. الخلايا αβ تي في ليرة لبنانية، هي أساسا خلايا CD4 خلايا+ تي (~ 70 ٪)، بينما CD8α+ تي الخلايا (~ 85%) تسود في حجرة لمفاوية للسيتولوجيا (IEL). CD8α+ αβ تي الخلايا داخل المقصورات ليرة لبنانية و IEL التعبير عن هوموديمير CD8αα أو هيتيروديمير CD8αβ بينما الموقع الاستقرائي CD8α+ αβ تي الخلايا يغلب التعبير عن هيتيروديمير CD8αβ (الشكل 3). معظم الخلايا γδ تي في حجرة IEL نعرب أيضا عن CD8α، في حين العثور على خلايا γδ تي في الافتقار إلى مليون CD8α (الشكل 3). بغض النظر عن العموميات، يمكن أن تختلف بين سلالات الماوس تكوين مجموعات فرعية اللمفاويات وقد أصبحت تتغير مع السن أو المرض. على هذا النحو، ينبغي إجراء تحليل دقيق للسكان اللمفاويات داخل مخاطية الأمعاء في حالة مستقرة في سلالة الخلفية المستخدمة للتلاعب التجريبية.

خلية العائد يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للسلالة والعمر للفئران، والظروف التجريبية المستخدمة. يمكن الاعتماد خلايا مفردة، ويعيش في هيموسيتوميتير أو جهاز الفرز الآلي خلية استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق. تحسب عدد الخلايا الليمفاوية ك: × عد الخلايا CD45 الخلايا+ (٪) في البوابة 3 × لمفاوية (٪) في بوابة 4 (الشكل 2). يمكن الحصول على حوالي 15 × 106 مليون الخلايا الليمفاوية لمفاوية PP6 × 10 5-10، 2-5 × 106 ليرة لبنانية لمفاوية و 3-6 × 106 IEL ماوس C57Bl/6 أو بالب/ج 8-12 أسبوع من السذاجة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الخرز الفرز القائم على التدفق للتحديد الكمي للسكان خلية مع التحذير من أن يحدث فقدان الخلية أثناء عملية المصبوغة. وفي نهاية المطاف، يجب الحفاظ على الاتساق في عد تقنية داخل المختبر التأكد من أنه يمكن إجراء مقارنات مناسبة عبر التجارب.

في هذا البروتوكول، ويستخدم العلاج DTE لإثراء IEL، التي تبعتها العلاج أدتا إزالة اللجنة الانتخابية المستقلة للعزل الأمثل لمفاوية التخصيب. اثنين DTE العلاجات تكفي لعزل > 95% IEL. يمكن أيضا العثور على عدد قليل جداً من الخلايا الليمفاوية في علاج يدتا. تشبه هذه الخلايا الليمفاوية خليط من الخلايا اللمفية IEL وليرة لبنانية (الشكل 4). وقد أجريت أيضا مقارنة بين العلاج DTE والجمع بين العلاج يدتا DTE لعزل IEL. يزيد التلوث اللجنة الانتخابية المستقلة في إعداد IEL (الشكل 5) مجتمعة يدتا DTE العلاج ويقلل من غلة النهائي من الخلايا المناعية الحية بعد الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. الكثافة المتدرجة الطرد المركزي يوصي بعزل الخلايا الليمفاوية من المقصورات المعوية. فهو يزيل الخلايا الميتة، العديد من الخلايا الظهارية والمخاط، تعزيز عزل الخلايا الليمفاوية التخصيب وشدة انخفاض التدفق الخلوي اقتناء الأوقات (الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1 . الرسم البياني لبروتوكول العزلة. DTE، ديثيوريثريتول. يدتا، حمض الإيثيلين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . تدفق الخلوي النابضة الاستراتيجية للسكان اللمفاويات من الأنسجة المعوية. تعليق خلية مفردة وأعد من العقد الليمفاوية المساريقي العلوي (مليون) والصفيحة بروبريا (ليرة لبنانية) وبقع (PP) في بير وحجرة لمفاوية للسيتولوجيا (IEL) كانت ملطخة بصبغة الجدوى يمكن حلها (مثل لايف/قتيلا) ويلي الأجسام المضادة الفلوريسنت المسمى: الخلايا CD45 للتعرف على الخلايا المكونة للدم، CD19 لخلايا باء، CD3ε ل T، خلايا تي مستقبلات (تكر) بيتا للخلايا αβ T، TCRδ للخلايا γδ T، CD8α على CD8α+ αβ تي وخلايا CD4 لخلايا CD4+ الخلايا αβ تي. بوابة 0 إلى الأمام وأظهر مبعثر (FSC)-A/الجانب مبعثر (SSC)-بخصائص. بوابة 1 تحديد خلايا مفردة. بوابة 2 حدد الخلايا الحية. بوابة 3 حدد الخلايا المكونة للدم. بوابة 4 وحدد الخلايا الليمفاوية استناداً إلى خصائص منتدى التعاون الأمني-A/SSC-أ. حددت البوابة 5 خلايا T وخلايا ب. بوابة 6 αβ المحددة تي الخلايا والخلايا γδ تي بين مجموع خلايا تي. حددت البوابة 7 CD8α+ وخلايا CD4 خلايا+ تي في السكان خلية T αβ. النسب المئوية (بالخط الأحمر) داخل قطع بسيودوكولور تتوافق مع تواتر الخلايا داخل البوابة المشار إليه بين السكان الأبوية السابقة. 0 وبوابة 1 عرض الأحداث الإجمالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . OfCD8α النمط الظاهري+ γδ تي وخلايا αβ تي الخلايا في الأنسجة المعوية. التعبير عن CD8β من CD8α+ يصور الخلايا αβ T، والتعبير عن CD8α من الخلايا γδ تي. النسب المئوية (بالخط الأحمر) داخل المدرج الإحصائي تتوافق مع تواتر الخلايا التي تعبر عن العلامة المشار إليه بين السكان الوالدين المشار إليه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . تكوين الخلايا اللمفية من العلاجات DTE، يدتا وكولاجيناز. الاستراتيجية النابضة الأبوية هي نفسها كما في الشكل 2. حددت البوابة 5 خلايا T وخلايا ب. بوابة 6 αβ المحددة تي الخلايا والخلايا γδ تي بين مجموع خلايا تي. حددت البوابة 7 CD8α+ وخلايا CD4 خلايا+ تي في السكان خلية T αβ. النسب المئوية (بالخط الأحمر) داخل قطع بسيودوكولور تتوافق مع تواتر الخلايا داخل البوابة المشار إليه بين السكان الأبوية السابقة. الخلايا الليمفاوية من العزلة يدتا تحمل شبهاً بخليط من الخلايا اللمفية IEL وليرة لبنانية معزولة عن العلاجات DTE وكولاجيناز، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . مقارنة بين علاج DTE والجمع بين العلاج يدتا DTE لعزل IEL. وأجرى DTE المعاملة وفقا لهذا البروتوكول. وقد جمعت IEL بعد العلاجات DTE وقبل العلاجات يدتا. قد أنجز مجتمعة DTE-يدتا المعاملة في نفس التركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول ولكنها في نفس الوقت. خصائص منتدى التعاون الأمني-A/SSC-أ والجدوى والنسبة المئوية ل CD45+ تظهر الخلايا المكونة للدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . أثر استخدام الطرد المركزي الكثافة المتدرجة على النقاء الإعداد اللمفاويات IEL وليرة لبنانية- كانوا يتعرضون للطرد المركزي التدرج كثافة تعليق خلية مفردة معزولة ووفقا لهذا البروتوكول أو تحليلها بواسطة التدفق الخلوي مباشرة. خصائص منتدى التعاون الأمني-A/SSC-أ والجدوى والنسبة المئوية ل CD45+ تظهر الخلايا المكونة للدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويرد بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من الأمعاء المخاطية الاستقرائي (مليون و PP) ومواقع المستجيب (حجرة ليرة لبنانية و IEL). وقد وضعت البروتوكول لتحقيق التوازن بين المدخلات (الوقت) والمخرجات (الجدوى والعائد) تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية والنتائج. ويضمن البروتوكول أيضا تلوث مقسم عبر الحد الأدنى بين المقصورات ليرة لبنانية و IEL.

وكانت عدة بروتوكولات لعزل الخلايا المناعية من الأمعاء الماوس المنشورة3،،من45،،من67. وتركز معظم هذه البروتوكولات على عزل الخلايا المناعية من ليرة لبنانية. ظهارة الأمعاء هو حجرة متميزة من ليرة لبنانية أن يتعرض مباشرة للبيئة الخارجية، ويتكون من تركيبة فريدة من الخلايا الليمفاوية. النهج الأخيرة سعت تحليل عالمي أكثر من وظيفة المناعة في الأمعاء بفحص المقصورات المعوية متميزة في نفس الوقت لفهم الجوانب الفريدة للاستجابات المناعية التي تحدث في هذه المقصورات والعلاقات فيما بينها. لذلك، المطلوب هو بروتوكول موثوقة لعزل الخلايا المناعية من جميع هذه المقصورات. اثنين DTE العلاجات تكفي لعزل > 95% من IEL وبعض الإعلام والتعليم واﻻتصال. يدتا تستهدف تقاطعات تعتمد على الكالسيوم، وتتسم بالكفاءة لفصل اللجنة الانتخابية المستقلة. ولذلك، تشكل المادة طافية من العلاجات يدتا اللاحقة معظمها من اللجنة الانتخابية المستقلة. يمكن العثور على عدد قليل جداً من الخلايا الليمفاوية في المادة طافية بعد العلاج يدتا؛ ومع ذلك، يتم الحصول على اللمفاويات المزيد حول برنامج من الكسر DTE. وعلاوة على ذلك، تشبه الخلايا الليمفاوية من معاملة يدتا المختلطة السكان من اللمفاويات IEL وليرة لبنانية (الشكل 4)، مما يوحي بالتلوث النفطي المسيل من الزوائد وسرداب الضرر. ولذلك، في هذا البروتوكول، IEL جمعت من معاملة DTE قبل المعالجة يدتا، تعظيم النقاء بالتقليل من التلوث عبر المقصورة. تستخدم البروتوكولات الأخرى ديثيوثريتول متسلسلة (DTT)-علاجات يدتا أو الجمع بين العلاج يدتا DTT لعزل IEL5،،من67. القيمة صنو DTE وكلاهما بمثابة وكلاء الحد. في هذه البروتوكولات، DTT لإزالة المخاط فقط ويتم استخدام أدتا عزل IEL. على الرغم من أن لا تمت مقارنة تأثير DTT و DTE مباشرة، تم تقييم IEL بعد العلاج DTE أو مجتمعة يدتا DTE العلاج. وليس من المستغرب، مجتمعة يدتا DTE العلاج يزيد التلوث اللجنة الانتخابية المستقلة في إعداد IEL (الشكل 5) ووجود عدد كبير من اللجنة الانتخابية المستقلة انخفضت غلة IEL بعد الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. كما يمكن أن تتلف يدتا بعض الزوائد والاقبية، مجتمعة DTE-يدتا المعاملة قد تسفر أيضا تلوث لمفاوية ليرة لبنانية في إعداد IEL أو فقدان الخلايا ليرة لبنانية من عزلة ليرة لبنانية. وعلاوة على ذلك، > 95% IEL كانت معزولة من الكسر DTE، علاجات DTE ويدتا منفصلة المفضلة. عزل بعض البروتوكولات لمفاوية دون استخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لتخصيب الخلايا المناعية6. الكثافة المتدرجة الطرد المركزي يأخذ وقتاً إضافيا وقد يحدث فقدان لبعض الخلايا. ومع ذلك، فإنه يزيل الخلايا الميتة والخلايا الظهارية والمخاط، مما يؤدي إلى التخصيب اللمفاويات السكان (الشكل 6)، الذي يساعد على تعزيز الكشف عن السكان صغيرة من الخلايا، ويقلل إلى حد كبير وقت الامتلاك لتدفق الخلوي. الإبلاغ عن الكثافة المتدرجة الطرد المركزي قد يؤدي إلى تغيير نسبة وحيدات النوى بلعمية المجموعات الفرعية7؛ ومع ذلك، يظهر تكوين مجموعة فرعية اللمفاويات العادي. أنها مفيدة بشكل خاص لإجراء الطرد المركزي الكثافة المتدرجة لعزل IEL. عموما، يقدم بروتوكول كامل لعزل الخلايا الليمفاوية التخصيب وقابلة للتطبيق على النحو الأمثل من جميع الأنسجة المعوية بما في ذلك ليرة لبنانية و IEL مع الحد الأدنى من التلوث عبر مقسم.

يجب اتخاذ الكثير من الوقت والعناية أثناء خطوات عزل الأنسجة للحد من التلوث بين الأعمال التحضيرية. يمكن أن تحرف الإزالة كاملة من PP إلى حد كبير لمفاوية ليرة لبنانية. يمكن أن تلوث أي ال إف أيضا الاستعدادات ليرة لبنانية. ومع ذلك، أي ال إف لا يمكن رؤيتها بالعين المجردة ولذلك لا يمكن إزالتها جراحيا قبل الهضم. سلالات مختلفة من الماوس لها إعداد مختلفة من أي ال إف14، التي قد تسهم إسهاما كبيرا في تكوين متغير لمفاوية ليرة لبنانية بين سلالات الماوس. عند إزالة المخاط، تأكد من الشريحة بلطف الأمعاء لتجنب الأضرار بالغشاء وليرة لبنانية، مما قد يؤدي إلى تلوث IEL ليرة لبنانية. إشارة واحدة من التلوث هو وجود إعداد كبيرة من الخلايا ب في إعداد IEL. IEL تحتوي على عدد قليل من الخلايا باء (~ 1% أو أقل)، بينما LPL يمكن أن تصل إلى 60% ب الخلايا اعتماداً على سلالة الماوس. ينبغي استخدام CD19 لكن لا B220 لتحديد خلايا ب في حجرة ليرة لبنانية و IEL، كخلايا تي المعوية قد أعرب أيضا عن B22015. وعلاوة على ذلك، قد أعرب العديد من الخلايا T المعوية بلعم التقليدية وعلامات DC مثل CD11b و CD11c، على التوالي16. ولذلك، ينبغي أن تستخدم التفريغ السليم النابضة استراتيجيات لضمان التحليل المناسب.

قد يتم تعديل خطوات لتلبية احتياجات الباحثين. ميكانيكية الهضم قد تكون كافية لعزل الخلايا اللمفاوية PP في حالة ثابتة أو الهضم كولاجيناز الليمفاوية قد يسهل عزل بعض مجموعات فرعية من الكريات البيضاء خلال التهاب. نوع كولاجيناز المستخدمة قد أثر كبير على التعبير علامة سطح الخلية والجدوى ونقاء LP لمفاوية5،17. قد يكون قطع الأمعاء إلى قطع صغيرة الهضم كولاجيناز، مما قد يزيد الغلة الخلية. ومع ذلك، كما أنه يقلل من الجدوى. يمكن تحسين وقت الحضانة مع كولاجيناز لتعظيم العائد مع التقليل من موت الخلايا، مما يؤدي إلى استرداد الحد الأقصى للخلايا الحية. مختبرات مختلفة استخدام التدرجات كثافة مختلفة قليلاً لعزل الخلايا الليمفاوية. بروتوكول تدرج راسخة 44/67% كثافة يرد هنا. قد اختبر الباحثون التدرجات كثافة مختلفة لتناسب احتياجاتهم الفردية. إذا هي رغبت في عدد أكبر من الخلايا الليمفاوية، ويمكن الجمع بين اثنين من الأمعاء الصغيرة لعلاجات DTE والعلاجات يدتا والهضم كولاجيناز. إذا كانت هناك حاجة إلى الأمعاء اثنين أو أكثر لدراسة الأحداث نادرة للغاية، ثم ينصح أن تعليق خلية واحدة مجمعة بعد عزلة.

يمكن استخدام لمفاوية معزولة لمزيد من التحليل المظهرية والوظيفية، والجينوم. عند القيام بتحليل تدفق سيتوميتريك، من المستحسن جداً أن دائماً استخدام الأصباغ بقاء وجسم CD45 المضادة لاستبعاد الخلايا الميتة والخلايا غير-المكونة للدم، الذي سوف يعزز إلى حد كبير التحليل. إذا كانت هناك حاجة السكان اللمفاويات نقية، الخلية فرز CD45+ الخلايا جنبا إلى جنب مع سائر علامات الاختيار يمكن أن يؤديها. الغسل على مكافحة CD8α-المغلفة بألواح يمكن استخدامها أيضا لعزل خلايا تي نقية من إعداد IEL كما غالبية هذه تي الخلايا CD8α صريح. الغسل أو الخلية الفرز مطلوب عموما لثقافة IEL كما تلويث الخلايا الظهارية يمكن أن تعوق نمو IEL. يمكن أيضا إضافة الخلايا المغذية مثل سبلينوسيتيس ساذجة لتعزيز بقاء IEL في الثقافة. إذا كان يتم استخدام مغذيات، من المهم الاستفادة من الخلايا كونجينيكالي غير متطابقة للتمييز بين السكان. التلوث البكتيري نادراً ما يمثل مشكلة في هذه الدراسات الفنية قصيرة الأجل كما تحتوي وسائط الحصاد على البنسلين والستربتوميسين والجنتاميسين. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الخطوات الغسيل والكثافة المتدرجة الطرد المركزي إزالة معظم البكتيريا.

عملية عزل يستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب توازناً من العناية والدقة والسرعة لتحقيق أفضل النتائج. يجب أن تنفق ما يكفي من الوقت التأكد من التلاعب السليم لكل خطوة مع التقليل إلى أدنى حد من الوقت بين التضحية بالماوس والحصول على تعليق خلية مفردة إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلية والغلة. وهذا هو توازن دقيق الذي أيضا من عنق زجاجة للمبتدئين في محاولة للحصول على التناسق في عزل الخلايا الليمفاوية مع بقاء عالية والعائد. يأخذ عملية عزل كامل بدءاً من القتل الرحيم الماوس للحصول على تعليق خلية مفردة تم عدها الباحثين ذوي خبرة ما يقرب من 8 ح للفئران 8. ينصح بالحصول على مساعدات لأكثر من 8 من الفئران لتوليد عالية الجودة والنتائج استنساخه. من المهم استخدام الرعاية عند مقارنة لمفاوية من هذه الأنسجة بالخلايا الليمفاوية من الطحال، والدم أو الأنسجة اللمفاوية الأخرى إينكوبيشنز واسعة النطاق قد تؤدي إلى تغييرات الاصطناعية المرتبطة ب إجراءات عزل17. مقارنات الروتينية للسكان ليرة لبنانية و IEL للأنسجة اللمفاوية المعالجة وبالمثل أن تقييم ما إذا كان هو التضمين العلامة الفوائد خلال عزل الخلايا اللمفاوية من الأنسجة المعوية. قضايا مماثلة أيضا مصدر قلق كبير عند مقارنة ملامح الجيش الملكي النيبالي من الأمعاء مع أولئك من الأنسجة اللمفاوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ويدعم قرارها منحة المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI076457) والأموال المقدمة من جامعة ستوني بروك. Z.Q. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة منح (K12 GM102778).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Tags

علم المناعة، 132 قضية، لمفاوية، الأمعاء، الغدد الليمفاوية المساريقي العلوي، والبقع في بييير، بروبريا الصفيحة، لمفاوية للسيتولوجيا، التدفق الخلوي
عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qiu, Z., Sheridan, B. S. IsolatingMore

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter