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Immunology and Infection

अलग माउस से लिम्फोसाइटों छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281

Summary

यहां हम आंत से जुड़े लसीकावत् ऊतक है Peyer पैच और draining mesenteric लिम्फ नोड्स सहित आगमनात्मक साइटों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, और लेमिना propria और सहित प्रभाव साइटों छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली के आंत्र उपकला ।

Abstract

आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली enteropathogenic के लिए प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं बढ़ते जबकि आहार एंटीजन और खाना खानेवाला बैक्टीरिया को सहिष्णु प्रतिक्रियाओं पैदा करके जठरांत्र संबंधी मार्ग के बैरियर समारोह को बनाए रखने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है रोगाणुओं. इसके अलावा, यह स्पष्ट हो गया है कि स्थानीय आंत्र प्रतिरक्षा दूर और प्रणालीगत प्रतिरक्षा पर एक गहरा प्रभाव है । इसलिए, यह अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कैसे एक आंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित है और क्या प्रतिक्रिया के immunologic परिणाम है । यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल आंत की तरह छोटी आंत आगमनात्मक साइटों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए वर्णित है लसीकावत् ऊतक Peyer है पैच और draining mesenteric लिम्फ नोड्स और लेमिना propria की तरह प्रभाव साइटों और आंतों उपकला । इस तकनीक को स्वीकार्य समय की कमी के भीतर इष्टतम शुद्धता और व्यवहार्यता और ंयूनतम पार कंपार्टमेंट संदूषण के साथ छोटे आंत्र ऊतकों से लिम्फोसाइटों की एक बड़ी संख्या का अलगाव सुनिश्चित करता है । लिम्फोसाइटों और आंतों के ऊतकों से अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए तकनीकी क्षमता जठरांत्र संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की समझ में सक्षम बनाता है, कैंसर, और भड़काऊ रोगों.

Introduction

जठरांत्र (सैनिक) पथ के आंतरिक शरीर और बाहरी वातावरण को अलग करने का सबसे बड़ा इंटरफेस का प्रतिनिधित्व करता है कि कई परतों और दखलंदाजी है । आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली सैनिक पथ के बैरियर समारोह को बनाए रखने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । यह लगातार आहार एंटीजन, खाना खानेवाला बैक्टीरिया, और रोगजनक रोगाणुओं के संपर्क में है । जैसे, यह खाद्य एंटीजन और खाना खानेवाला बैक्टीरिया के प्रति सहिष्णु रहना चाहिए, जबकि क्षमता के संरक्षण के लिए तेजी से enteropathogenic रोगाणुओं के लिए एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पंन 1 । आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली anatomically आगमनात्मक साइटों में विभाजित किया जा सकता है, जहां भोले लिम्फोसाइटों प्रतिजन आंतों म्यूकोसा से ले जाने वाले कोशिकाओं को पेश करके सक्रिय कर रहे हैं, और प्रभाव साइटों, जहां सक्रिय लिम्फोसाइटों लागू विशिष्ट प्रभाव2कार्य करता है । आगमनात्मक साइटों Peyer के पैच (पीपी) है कि विशेष एम कोशिकाओं और क्षेत्रीय draining mesenteric लिम्फ नोड्स (मिलियन) की कार्रवाई के माध्यम से सीधे आंत्र लुमेन सर्वेक्षण का आयोजन लसीकावत् संरचना शामिल । प्रभाव साइटों लेमिना propria (एल. पी.), जो तहखाने झिल्ली के नीचे संयोजी ऊतक है से मिलकर बनता है, और आंतों उपकला, एक एकल कोशिका परत तहखाने झिल्ली कि intraepithelial लिम्फोसाइटों (IEL) शामिल है के ऊपर स्थित है । लिम्फोसाइटों संक्रमण और कैंसर के खिलाफ संरक्षण मध्यस्थता और भी भड़काऊ रोगों में immunopathology के लिए योगदान कर सकते हैं कि अनुकूली उन्मुक्ति के प्रमुख खिलाड़ी हैं । यह महत्वपूर्ण है और उच्च इन विशिष्ट संरचनात्मक श्लैष्मिक डिब्बों में लिम्फोसाइटों अध्ययन करने के लिए बेहतर उनके प्रेरण और प्रभाव कार्यों को समझने के लिए प्रासंगिक है ।

इन डिब्बों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और एकीकृत प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा आंतों में होने वाली घटनाओं की खोज जांचकर्ताओं की संख्या में तेजी लाने के रूप में की जरूरत है । कई अनुसंधान समूहों प्रोटोकॉल है कि माउस से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए कई समान प्रक्रियाओं साझा प्रकाशित किया है छोटे आंत्र डिब्बों3,4,5,6,7 . हालांकि, व्यक्तिगत प्रोटोकॉल के फ़ोकस के आधार पर उनमें कई तकनीकी अंतर होते हैं । उदाहरण के लिए, एल. पी. से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने पर ध्यान देने के साथ, एक प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता, कोशिका सतह मार्कर अभिव्यक्ति, और अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संरचना पर विभिन्न एंजाइमी के प्रभाव का परीक्षण5. एक अंय प्रोटोकॉल घनत्व केंद्रापसारक6के बिना लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक तेजी से और reproducible विधि पर प्रकाश डाला गया । अंत में, विशिष्ट प्रोटोकॉल भी छोटी आंत के विभिंन ऊतक परतों से mononuclear फ़ैगोसाइट अलग करने के प्रयोजन के लिए मौजूद7। यहां, एक उच्च reproducible प्रोटोकॉल है कि मिलियन से लिम्फोसाइट आबादी की अनुक्रमिक अलगाव की अनुमति देता है, पीपी, एल. पी., और छोटी आंत के IEL डिब्बे प्रस्तुत किया है ।

हम एल. पी. और IEL डिब्बों से अत्यधिक शुद्ध आबादी को अलग करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो अन्य आंतों के डिब्बों से संदूषणों से काफी हद तक मुक्त हैं. यह व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल स्वीकार्य समय की कमी4,8,9,10,11,12के भीतर अधिक से अधिक शुद्ध और व्यवहार्य लिम्फोसाइटों की एक उच्च उपज पैदा करता है । यह प्रोटोकॉल भी एल ई सी और IEL डिब्बे से लिम्फोसाइटों के अलगाव को ंयूनतम पार कंपार्टमेंट संदूषण के साथ सुनिश्चित करता है, एक बोना के लिए इन विशिष्ट डिब्बों में लिम्फोसाइटों अध्ययन के अवसर की अनुमति । अलग लिम्फोसाइटों प्रवाह cytometric विश्लेषण या कार्यात्मक विश्लेषण की तरह आगे जोड़तोड़ के अधीन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक माउस से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए लागू किया गया है छोटी आंत और इस तरह के रूप में बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान बृहदांत्र लिस्टिरिया monocytogenes, साल्मोनेला typhimurium, और Yersinia pseudotuberculosis रासायनिक और रोगज़नक़ प्रेरित कोलाइटिस के रूप में संक्रमण और भड़काऊ स्थितियों । इस प्रोटोकॉल भी वृक्ष कोशिकाओं, मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, और माउस छोटी आंत और बृहदांत्र से monocytes जैसे जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया और पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित ।

नोट: सुनिश्चित करें कि सभी अनुमोदन प्रक्रियाएं निष्पादित करने से पहले दी गई हैं ।

1. समाधान तैयारी

  1. HGPG (HEPES, L-glutamine, पेनिसिलिन/streptomycin, व गेन्तमयसीं), १०० ×
    1. मिक्स ५९.६ जी HEPES (५०० एमएम फाइनल), १४.६ जी एल-glutamine (२०० मिमी अंतिम), 1 × 106 यू पेनिसिलिन (२,००० u/एमएल अंतिम), 1 ग्राम streptomycin (2 मिलीग्राम/एमएल अंतिम), और २.५ मिलीग्राम gentamicin (5 µ g/ जोड़ RPMI १६४० से ५०० मिलीलीटर । समायोजित ७.५ NaOH का उपयोग करने के लिए पीएच (समायोजन से पहले, बफर पीले/ एक ०.४५ µm फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर. 1 वर्ष तक या 4 ° c से 1 माह तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर Aliquot और स्टोर करें ।
  2. HEPES-बिकारबोनिट बफर, 10x
    1. मिक्स २३.८ जी HEPES (१०० mm final), 21 ग्राम NaHCO 3 (२५० mm final) और इसमें पानी डालकर १,००० मिली । ७.२ को एचसीएल के साथ पीएच समायोजित करें । फ़िल्टर एक ०.४५ माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण । कमरे के तापमान पर स्टोर । समय के साथ पीएच बदलता है । पीएच को आवधिक रूप से समायोजित करें ।
  3. हार्वेस्ट मीडिया (~ 1 बोतल/
    1. ५०० मिलीलीटर RPMI १६४० करने के लिए, जोड़ें 25 मिलीलीटर हीट-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (5% अंतिम), और 5 मिलीलीटर १०० × HGPG । 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर ।
  4. Dithioerythritol (DTE) समाधान (४० mL/छोटी आंत)
    1. मिश्रण ५० मिलीलीटर 10 × हैंक्स संतुलित नमक समाधान, Ca2+-और मिलीग्राम2+मुक्त, ५० मिलीलीटर 10 × HEPES-बिकारबोनिट बफर, और ५० मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (10% अंतिम) । जोड़ें ३५० एमएल एच2O और १५.४ मिलीग्राम dithioerythritol/100 एमएल (1 मिमी अंतिम) । उपयोग करने से पहले इस ताजा तैयार ।
  5. Ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA) समाधान (५० mL/छोटी आंत)
    1. मिश्रण ५० मिलीलीटर 10 × हैंक्स संतुलित नमक समाधान, Ca2+-और मिलीग्राम2+5 मिलीलीटर १०० × HGPG के साथ नि: शुल्क । जोड़ें ४४५ एमएल एच2ओ जोड़ें २६० µ एल ०.५ एम EDTA/100 एमएल (१.३ मिमी अंतिम) । उपयोग करने से पहले इस ताजा तैयार ।
  6. Collagenase समाधान (30 एमएल/
    1. ५०० मिलीलीटर RPMI के लिए, जोड़ें ५० मिलीलीटर FBS (10% FBS अंतिम), 5 मिलीलीटर १०० × HPGP, 1 मिलीलीटर ०.५ मीटर MgCl2 (1 मिमी अंतिम), और 1 एमएल ०.५ एम CaCl2 (1 मिमी अंतिम) । collagenase जोड़ें, मैं (१०० U/एमएल अंतिम) लिखें । उपयोग करने से पहले इस ताजा तैयार ।
  7. घनत्व ढाल (डीजी) समाधान
    1. ९० एमएल डीजी स्टॉक सॉल्यूशन को मिलाकर 1 × dg शेयर सॉल्यूशन तैयार करें (10 × पंजाबियों की 10 मिलीलीटर के साथ) सामग्री की तालिकादेखें । 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ रखें ।
    2. 1 × dg स्टॉक सॉल्यूशन और ५६ ml RPMI १६४० के ४४ मिलीलीटर को मिलाकर ४४% डीजी सॉल्यूशन (8 एमएल/IEL, 8 एमएल/LP) तैयार करें । उपयोग करने से पहले इस ताजा तैयार ।
    3. 1 × dg स्टॉक सॉल्यूशन और ३३ ml RPMI १६४० के ६७ मिलीलीटर को मिलाकर ६७% डीजी सॉल्यूशन (5 एमएल/IEL, 5 एमएल/एल. पी.) तैयार करें । उपयोग करने से पहले इस ताजा तैयार ।

2. Mesenteric लिम्फ नोड्स, आंतों, और Peyer के पैच का अलगाव

  1. Euthanize कार्बन डाइऑक्साइड narcosis और माध्यमिक ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग कर माउस । अपनी पीठ पर माउस प्लेस और ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे । एक midline चीरा बनाने के लिए कैंची का प्रयोग करें, और पेरिटोनियल गुहा को बेनकाब करने के लिए त्वचा और पेट की दीवार को खोलने ।
  2. caecum की स्थिति जानें और संदंश का उपयोग धीरे caecum नीचे खींचने के लिए । का प्रयोग करें संदंश ध्यान से सही करने के लिए छोटी आंत को स्थानांतरित करने के लिए, पूरे मिलियन श्रृंखला है, जो बृहदांत्र के साथ गठबंधन है उजागर ।
    नोट: mesenteric लिम्फ नोड्स श्रृंखला और आंतों के लसीका जल निकासी का एक नक्शा पहले13दर्शाया गया था ।
  3. श्रृंखला में नीचे नोड, अंधान्त्र के निकटतम स्थित की पहचान करें । संदंश के एक सेट का उपयोग करने के लिए यह चारों ओर अन्त्रपेशी/वसा समझ और धीरे संदंश के एक और सेट के साथ लिम्फ नोड के चारों ओर से वसा tweezing द्वारा शीर्ष करने के लिए नीचे से मिलियन श्रृंखला को हटा दें ।
  4. एक कागज तौलिया फसल मीडिया के साथ गीला पर मिलियन श्रृंखला करना । कागज टॉवर पर चेन रोलिंग और संदंश के दो सेट के साथ वसा दूर खींच द्वारा अन्त्रपेशी/ बाद में अलगाव चरणों के लिए कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया में मिलियन रखें ।
    नोट: (i) नोड्स के प्रत्यक्ष हैंडलिंग हतोत्साहित है । इसके बजाय, उनके आसपास अन्त्रपेशी/ (ii) कोशिका व्यवहार्यता को बेहतर बनाने के लिए यथासंभव अन्त्रपेशी/
  5. छोटी आंत को जठरनिर्गम लुगदी के नीचे और कैंची का प्रयोग करके अंधान्त्र के ऊपर काट लें । आंत बाहर खींचो धीरे लघ्वान्त्र से ग्रहणी को संदंश का एक सेट का उपयोग करते हुए संलग्न अन्त्रपेशी हटाने/
  6. एक कागज तौलिया फसल मीडिया के साथ गीला पर आंत प्लेस और संदंश के दो सेट के साथ किसी भी शेष अन्त्रपेशी/
    नोट: (i) इष्टतम कोशिका प्राप्ति और व्यवहार्यता के लिए जितना संभव हो उतना अन्त्रपेशी/ (ii) आंत को इस भर में भिगोकर रखें और कटाई मीडिया को समय पर लागू करके निंनलिखित कदम उठाएं ।
  7. घुमावदार कैंची के साथ आंत से उन्हें हटाने के द्वारा Peyer के पैच ले लीजिए । यदि आवश्यक हो तो एक विदारक गुंजाइश या आवर्धक कांच का प्रयोग करें (शुरुआती); अधिकांश Peyer के पैच प्रशिक्षित नेत्र को दिखाई जानी चाहिए । छोटी आंत से 5-11 (ठेठ) Peyer के धब्बे ले लीजिए । बाद में अलगाव चरणों के लिए कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया में Peyer के पैच प्लेस ।
    नोट: Peyer के पैच छोटे हैं, अन्त्रपेशी लगाव की रेखा के विपरीत बाहरी आंत्र दीवार में मुख्य रूप से गोल उभार ।
  8. संदंश के सपाट पक्ष का उपयोग करें और लघ्वान्त्र की ओर से ग्रहणी से धीरे स्लाइड के लिए मल सामग्री और बलगम निष्कासित । बलगम की सबसे दूर करने के लिए एक बार दोहराएँ.
    नोट: बलगम की अपूर्ण हटाने कोशिका व्यवहार्यता और उपज में कमी कर सकते हैं । फिर भी, आंत को धीरे से स्लाइड करने के लिए विल्ली अलग करना या तहखाने झिल्ली हानिकारक से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
  9. एक बिंदु पर एक कुंद अंत के साथ ठीक कैंची का प्रयोग करें, आंत में कुंद अंत डालें, और लघ्वान्त्र के लिए ग्रहणी से आंत खुला longitudinally में कटौती । बाद में खोला आंत में कटौती ~ 2-cm टुकड़े । आंतों के टुकड़ों को एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में 25 मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया के साथ बाद में अलगाव चरणों के लिए रखें ।
    नोट: मीडिया के साथ गीला कैंची रखते हुए उन्हें आंत के माध्यम से सहजता से स्लाइड में मदद मिलेगी.

3. आगमनात्मक स्थलों से लिम्फोसाइटों का अलगाव

  1. मिलियन से लिम्फोसाइटों को अलग करके धीरे से dissociating एक ७०-µm सेल छलनी के माध्यम से एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर का उपयोग कर । कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ धो सेल छलनी ।
  2. गोली मिलियन-कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी पर केंद्रापसारक द्वारा । 1 मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया में सेल गोली reसस्पेंड । गणना व्यवहार्य trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर कोशिकाओं ।
    नोट: लाल रक्त कोशिका lysis बफर को हटाने के दौरान खून बह रहा है, तो लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस और २२० rpm पर 30 मिनट के लिए 5 मिलीलीटर गरम collagenase समाधान युक्त एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में Peyer के पैच की मशीन द्वारा Peyer के पैच से लिम्फोसाइटों को अलग करें ।
  4. 15 एस के लिए भंवर अधिकतम सेटिंग में और एक ७०-µm सेल छलनी के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पचा ऊतक और supernatant फिल्टर । धीरे शेष ऊतक एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर का उपयोग कर टुकड़े अलग कर देना और ठंडा फसल मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी धो लो ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी में केंद्रापसारक द्वारा गोली है Peyer पैच कोशिकाओं और 1 मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया में सेल गोली reसस्पेंड । गणना व्यवहार्य trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर कोशिकाओं ।
    नोट: Peyer के पैच अलगाव कुछ दूषित लेमिना propria लिम्फोसाइटों और intraepithelial लिम्फोसाइटों हो सकता है ।

4. छोटी आंत से Intraepithelial लिम्फोसाइटों का अलगाव

  1. छोटी आंत के टुकड़े तीन बार ट्यूब औंधा द्वारा ठंडी फसल मीडिया के 25 मिलीलीटर के साथ धो 10 बार, आंतों टुकड़े बसने दे, और बंद supernatant डालना ।
    नोट: ऊतक टुकड़े आसानी से ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करना चाहिए । यदि वे ऐसा नहीं करते हैं, तो यह एक संकेत है कि बहुत अधिक अन्त्रपेशी/वसा जुड़ा रहता है या वे एक हवाई बुलबुले के साथ जुड़े रहे हैं ।
  2. ५०-एमएल शंकु ट्यूब के लिए गर्म DTE समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें आंत टुकड़े और एक ५० मिलीलीटर सिलिकॉन Erlenmeyer एक हलचल बार युक्त कुप्पी के लिए स्थानांतरण युक्त । 20 मिनट के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी पर ३७ डिग्री सेल्सियस और २२० rpm पर हिलाओ । कुप्पी के बाहर पर एक बड़े चुंबक का प्रयोग करें हलचल पट्टी पकड़ और ऊतक और समाधान वापस ५० एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  3. 10 एस के लिए अधिकतम सेटिंग में ट्यूब भंवर एक ७०-µm सेल छलनी के माध्यम से एक नया ५०-एमएल शंकु ट्यूब में supernatant हस्तांतरण मूल ट्यूब में ऊतक टुकड़े रखने के लिए सावधान किया जा रहा है । supernatant को न छोड़ें; supernatant में intraepithelial लिम्फोसाइटों हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । 10 मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया और बर्फ पर स्टोर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  4. ५०-मिलीलीटर शंकु ट्यूब आंत टुकड़े युक्त करने के लिए गर्म DTE समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें और ५०-मिलीलीटर सिलिकॉन Erlenmeyer एक हलचल पट्टी युक्त कुप्पी को वापस हस्तांतरण । 20 मिनट के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी पर ३७ डिग्री सेल्सियस और २२० rpm पर हिलाओ । कुप्पी के बाहर पर एक बड़े चुंबक का प्रयोग करें हलचल पट्टी पकड़ और ऊतक और समाधान वापस ५० एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: DTE एक कम करने एजेंट है कि intraepithelial लिम्फोसाइटों को समृद्ध करता है ।
  5. भंवर 10 एस के लिए अधिकतम सेटिंग में ट्यूब एक ७०-µm सेल छलनी के माध्यम से supernatant पहले DTE उपचार (४.३ कदम से) के supernatant से कोशिकाओं युक्त पिछले ट्यूब में स्थानांतरण ।
    नोट: शेष आंत्र टुकड़ों लेमिना propria से लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । गुणवत्ता नियंत्रण: ऊतक के एक टुकड़े को हटाया जा सकता है और जांच histologically कि उपकला कोशिकाओं मौजूद हैं और तहखाने झिल्ली बरकरार है यह सुनिश्चित करने के लिए ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी में supernatant केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । कक्ष तापमान (आरटी) में ४४% डीजी समाधान के 8 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  7. 8 मिलीलीटर ४४% डीजी समाधान/सेल निलंबन में 17 मिमी ø x १०० mm शैली 14-एमएल के लिए गोल-नीचे ट्यूब स्थानांतरण । आरटी ६७% कुषल समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ बुनियाद । १६०० पर 20 मिनट के लिए आर टी ब्रेक का उपयोग किए बिना पर केंद्रापसारक ।
    नोट: ट्यूबों ट्यूब दीवारों से चिपके से कोशिकाओं को रोकने के लिए गोजातीय सीरम के साथ इलाज किया जा सकता है ।
  8. ध्यान दें कि व्यवहार्य कोशिकाओं के फार्म का एक बैंड (buffy कोट) पर ४४% से ६७% इंटरफेस, मृत कोशिकाओं और कुछ उपकला कोशिकाओं ढाल के शीर्ष पर एक mucoid फिल्म में हैं, और लाल रक्त कोशिकाओं गोली में हैं. निर्वात आकांक्षा द्वारा अंतरफलक के भीतर ~ 2 सेमी के लिए ढाल के शीर्ष परत निकालें । अंतरफलक पर buffy कोट फसल के लिए एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें और उंहें एक ५० एमएल शंकु ट्यूब ४० मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया युक्त करने के लिए स्थानांतरण ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । 1 मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया में सेल गोली reसस्पेंड । गणना व्यवहार्य trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर कोशिकाओं ।

5. छोटी आंत से लेमिना Propria लिम्फोसाइटों का अलगाव

  1. शेष आंत्र टुकड़े युक्त कुप्पी के लिए गर्म EDTA समाधान के 25 मिलीलीटर जोड़कर आंतों के ऊतकों के टुकड़ों से उपकला कोशिकाओं को हटा दें । 30 मिनट के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी पर ३७ ° c और २२० rpm पर कुप्पी हिलाओ । कुप्पी के भीतर के बाहर पर एक बड़े चुंबक का उपयोग करने के लिए हलचल पट्टी पकड़ और ध्यान से supernatant छोड़ जबकि कुप्पी के अंदर आंतों के टुकड़े रखते हुए ।
    नोट: (i) EDTA एक कैल्शियम chelator कि कैल्शियम पर निर्भर जंक्शनों लक्ष्य है और आंतों उपकला कोशिकाओं की टुकड़ी को बढ़ावा देता है. (ii) supernatant बादल होना चाहिए और अगर उनके संग्रह वांछित है आईईसी अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. चरण ५.१ दोहराएँ ।
    नोट: supernatant इस मशीन के बाद कम बादल होना चाहिए । गुणवत्ता नियंत्रण: ऊतक के एक टुकड़े को हटाया जा सकता है और जांच histologically कि आंत्र उपकला कोशिकाओं को हटा दिया गया है और तहखाने झिल्ली बरकरार है सुनिश्चित करने के लिए । supernatant से एक नमूना भी है कि ल्यूकोसाइट्स (CD45+ कोशिकाओं) अनुपस्थित रहे हैं की पुष्टि करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है ।
  3. आरटी हार्वेस्ट मीडिया की कुप्पी के लिए ५० मिलीलीटर जोड़ें । एक चुंबक के साथ संक्षेप में हिलाओ । आंत्र टुकड़े बसने और ध्यान से supernatant त्याग दो ।
    नोट: यह चरण EDTA निष्क्रिय करता है collagenase कैल्शियम chelating फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण है collagenase द्वारा के रूप में पाचन collagenase करने से पहले EDTA को निकालने सुनिश्चित करता है ।
  4. कुप्पी के लिए गरम collagenase समाधान के 30 मिलीलीटर जोड़ें और ४५ मिनट के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी पर ३७ डिग्री सेल्सियस और २२० rpm पर आंत्र टुकड़े हलचल ।
  5. एक ७०-µm सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टरिंग द्वारा एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब के लिए डाइजेस्ट ऊतक और supernatant स्थानांतरण । फ़िल्टर के माध्यम से मैश करने के लिए 3-एमएल सिरिंज के गोताख़ोर का उपयोग करके बचे हुए टिशू पीस को धीरे से अलग कर देना । कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ फिल्टर धो लो ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । परिवेश के तापमान के 8 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ४४% डीजी समाधान ।
  7. 8 मिलीलीटर ४४% डीजी समाधान/सेल निलंबन में 17 मिमी ø x १०० mm शैली 14-एमएल के लिए गोल-नीचे ट्यूब स्थानांतरण । परिवेश तापमान ६७% कुषल समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ बुनियाद । कमरे के तापमान और कोई ब्रेक के साथ 20 मिनट के लिए १६०० × जी पर ढाल केंद्रापसारक ।
  8. वैक्यूम आकांक्षा द्वारा शीर्ष पर वसा परत निकालें । एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें अंतरफलक पर buffy कोट फसल और एक ५० एमएल शंकु ट्यूब ४० मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया युक्त करने के लिए स्थानांतरण ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । 1 मिलीलीटर कोल्ड हार्वेस्ट मीडिया में सेल गोली reसस्पेंड । गणना व्यवहार्य trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर कोशिकाओं ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है (चित्र 1) । लिम्फोसाइटों आंत्र म्यूकोसा आगमनात्मक और प्रभाव साइटों के भीतर स्पष्ट रूप से आयोजित कर रहे हैं । Peyer के पैच (पीपी) और mesenteric लिम्फ नोड्स (मिलियन) में लिम्फोसाइटों में अच्छी तरह से संगठित टी-सेल क्षेत्रों और बी-सेल के रोम होते हैं, जबकि आंतों के उपकला में लिम्फोसाइटों होते हैं जो अधिक diffusely वितरित होते हैं । लेमिना propria (एल. पी.) दोनों diffusely वितरित लिम्फोसाइटों और लिम्फोसाइटों अलग लसीकावत् रोम (लसीकावत्) और ILF की तरह संगठित cryptopatches संरचनाओं के भीतर निहित शामिल हैं । प्रत्येक आंत्र प्रतिरक्षा डिब्बे भी लिम्फोसाइट उपसमुच्चय (चित्रा 2) की एक अनूठी संरचना द्वारा typified है । मिलियन predominately αβ टी कोशिकाओं से बना है (~ ७०%), जबकि पीपी लिम्फोसाइटों ज्यादातर बी कोशिकाओं रहे है (~ ८०%) । एल. पी. लिम्फोसाइट संरचना मुख्यतः तनाव पर निर्भर है, लेकिन मुख्य रूप से αβ टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं से बना । अंय आंत्र डिब्बों से अलग, उपकला में रहने वाले लिम्फोसाइटों मुख्य रूप से γδ टी कोशिकाओं (~ ६०%) और अनिवार्य रूप से कोई बी कोशिकाओं के साथ αβ टी कोशिकाओं रहे हैं । αβ टी सेल उपसमुच्चय के विशिष्ट अनुपात भी आंतों के विभिंन शारीरिक स्थानों के भीतर मौजूद हैं । एल. पी. में αβ टी कोशिकाओं मुख्य रूप से CD4+ टी कोशिकाओं (~ ७०%), जबकि CD8α+ टी कोशिकाओं (~ ८५%) प्रबल intraepithelial लिम्फोसाइटों (IEL) डिब्बे में । एल. पी. सी. और IEL डिब्बों के भीतर CD8α+ αβ टी कोशिकाओं CD8αα homodimer या CD8αβ heterodimer जबकि आगमनात्मक साइट CD8α+ αβ टी कोशिकाओं predominately CD8αβ (चित्रा 3) एक्सप्रेस । IEL डिब्बे में γδ टी कोशिकाओं का बहुमत भी CD8α व्यक्त करता है, जबकि γδ टी कोशिकाओं में पाया मिलियन कमी CD8α (चित्रा 3) । जनरलों की परवाह किए बिना, लिम्फोसाइट सबसेट की संरचना माउस उपभेदों के बीच भिंन हो सकते है और उंर या रोग के साथ बदल सकता है । इस तरह, स्थिर-राज्य में आंत्र म्यूकोसा के भीतर लिम्फोसाइट आबादी का एक सावधान विश्लेषण प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए उपयोग पृष्ठभूमि तनाव में किया जाना चाहिए ।

सेल उपज बहुत तनाव और चूहों की उंर के आधार पर भिंन हो सकते हैं, और प्रायोगिक शर्तों का इस्तेमाल किया । एकल, लाइव कोशिकाओं trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल गिनती मशीन पर गिना जा सकता है । लिम्फोसाइटों की संख्या के रूप में गणना कर रहे हैं: कक्ष गिनती × CD45+ कक्ष (गेट में 3 × लिम्फोसाइटों (%) 4 (चित्रा 2) । लगभग 15 × 106 मिलियन लिम्फोसाइटों, 5-10 ×10 6 पीपी लिम्फोसाइटों, 2-5 × 10 6 एल. पी. एस. लिम्फोसाइटों, और3 -6 × 10 6 IEL एक 8 से प्राप्त किया जा सकता है 12 सप्ताह पुरानी भोली C57Bl/6 या बालब/ वैकल्पिक रूप से, प्रवाह आधारित गिनती मोतियों को चेतावनी है कि सेल नुकसान धुंधला प्रक्रिया के दौरान होता है के साथ सेल आबादी यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । अंततः, तकनीक गिनती में निरंतरता प्रयोगशाला के भीतर बनाए रखा जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि उचित तुलना प्रयोगों में किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में, DTE उपचार IEL, जो उच्च समृद्ध लिम्फोसाइटों के इष्टतम अलगाव के लिए आईईसी को दूर करने के लिए EDTA उपचार के बाद है को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है । दो DTE उपचार > IEL के 95% को अलग करने के लिए पर्याप्त हैं । लिम्फोसाइटों की एक बहुत कम संख्या में भी EDTA उपचार में पाया जा सकता है । ये लिम्फोसाइटों IEL और एल पी एस लिम्फोसाइटों (चित्रा 4) का एक मिश्रण के समान है । IEL को अलग करने के लिए DTE उपचार और संयोजित DTE-EDTA उपचार की तुलना भी की गई है । संयुक्त DTE-EDTA उपचार IEL तैयारी में आईईसी संदूषण बढ़ जाती है (चित्रा 5) और घनत्व ढाल केंद्रापसारक के बाद जीने प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अंतिम पैदावार कम कर देता है । घनत्व ढाल केंद्रापसारक आंतों के डिब्बों से लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए सिफारिश की है । यह मृत कोशिकाओं को निकालता है, कई उपकला कोशिकाओं और बलगम, अत्यधिक समृद्ध लिम्फोसाइटों के अलगाव को बढ़ावा देने और तेजी से प्रवाह cytometry अधिग्रहण टाइम्स (चित्रा 6) को कम.

Figure 1
चित्र 1 . आइसोलेशन प्रोटोकॉल का चार्ट प्रवाह ित करना. DTE, dithioerythritol । EDTA, ethylenediaminetetraacetic अम्ल. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . आंत्र ऊतकों से लिम्फोसाइट आबादी के लिए एक प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति । mesenteric लिम्फ नोड्स (मिलियन), लेमिना propria (एल. पी. एस.), Peyer के पैच (पीपी) और intraepithelial लिम्फोसाइटों (IEL) डिब्बे से तैयार एकल कोशिका निलंबन fixable व्यवहार्यता डाई के साथ दाग थे (जैसे जीवित/ फ्लोरोसेंट-लेबल एंटीबॉडी: टेम कोशिकाओं की पहचान के लिए CD45, बी कोशिकाओं के लिए CD19, टी कोशिकाओं के लिए CD3ε, टी-सेल रिसेप्टर (TCR) β के लिए αβ टी कोशिकाओं, TCRδ के γδ टी कोशिकाओं, CD8α के लिए CD8α+ αβ टी कोशिकाओं और CD4 के लिए CD4+ αβ टी कोशिकाओं. Gate 0 showed फॉरवर्ड स्कैटर (FSC)-a/साइड स्कैटर (SSC)-a गुण । गेट 1 एकल कोशिकाओं की पहचान की । 2 गेट पहचान जीवित कोशिकाओं । गेट 3 टेम कोशिकाओं की पहचान की । Gate 4 की पहचान लिम्फोसाइटों के आधार पर FSC-a/SSC-a गुण । गेट 5 टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की पहचान की । गेट 6 कुल टी कोशिकाओं के बीच αβ टी कोशिकाओं और γδ टी कोशिकाओं की पहचान की । गेट 7 αβ टी सेल जनसंख्या में CD8α+ और CD4+ टी कोशिकाओं की पहचान की । pseudocolor भूखंडों के भीतर प्रतिशत (लाल फ़ॉंट में) पूर्ववर्ती पैतृक आबादी के बीच संकेत गेट के भीतर कोशिकाओं की आवृत्ति के अनुरूप हैं । गेट 0 और गेट 1 प्रदर्शन कुल घटनाओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . phenotype ofCD8α+ αβ टी कोशिकाओं और आंतों के ऊतकों में γδ टी कोशिकाओं । CD8α+ αβ टी कोशिकाओं और γδ टी कोशिकाओं द्वारा CD8α की अभिव्यक्ति द्वारा CD8β की अभिव्यक्ति चित्रित कर रहे हैं. हिस्टोग्राम के भीतर प्रतिशत (लाल फ़ॉंट में) कोशिकाओं की आवृत्ति के अनुरूप है कि संकेत माता पिता की आबादी के बीच संकेत मार्कर व्यक्त करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . DTE, EDTA, और collagenase उपचार से लिम्फोसाइटों की संरचना । पैतृक गेटिंग रणनीति चित्रा 2में के रूप में ही है । गेट 5 टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की पहचान की । गेट 6 कुल टी कोशिकाओं के बीच αβ टी कोशिकाओं और γδ टी कोशिकाओं की पहचान की । गेट 7 αβ टी सेल जनसंख्या में CD8α+ और CD4+ टी कोशिकाओं की पहचान की । pseudocolor भूखंडों के भीतर प्रतिशत (लाल फ़ॉंट में) पूर्ववर्ती पैतृक आबादी के बीच संकेत गेट के भीतर कोशिकाओं की आवृत्ति के अनुरूप हैं । लिम्फोसाइटों EDTA अलगाव भालू समानता से IEL और एल. पी. लिम्फोसाइटों के मिश्रण को DTE और collagenase उपचार से अलग, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . DTE उपचार और संयुक्त DTE-IEL के अलगाव के लिए EDTA उपचार की तुलना. DTE उपचार इस प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था । IEL DTE उपचार के बाद एकत्र किए गए और EDTA उपचार से पहले । संयुक्त DTE-EDTA उपचार एक ही इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक ही समय में सांद्रता पर प्रदर्शन किया गया । FSC-a/SSC-एक गुण, व्यवहार्यता और CD45+ टेम कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . IEL और एल. पी. लिम्फोसाइट तैयारी की शुद्धता पर घनत्व ढाल केंद्रापसारक के प्रभाव । एकल सेल इस प्रोटोकॉल के अनुसार पृथक निलंबन घनत्व ढाल केंद्रापसारक के अधीन थे या प्रवाह cytometry द्वारा सीधे विश्लेषण । FSC-a/SSC-एक गुण, व्यवहार्यता और CD45+ टेम कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक विस्तृत प्रोटोकॉल आंत्र श्लैष्मिक आगमनात्मक (मिलियन और पीपी) और प्रभाव (एल पी एस और IEL डिब्बे) साइटों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए प्रस्तुत किया है । प्रोटोकॉल उत्पादकता और परिणाम को अधिकतम करने के लिए इनपुट (समय) और उत्पादन (व्यवहार्यता और उपज) संतुलन के लिए विकसित किया गया है । प्रोटोकॉल भी एल. पी. और IEL डिब्बों के बीच ंयूनतम पार कंपार्टमेंट संदूषण सुनिश्चित करता है ।

माउस छोटी आंत से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किया गया है3,4,5,6,7। इन प्रोटोकॉल के अधिकांश एल. पी. से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने पर ध्यान केंद्रित । आंतों उपकला एल. पी. से एक अलग डिब्बे है कि सीधे बाहरी वातावरण के संपर्क में है और लिम्फोसाइटों की एक अनूठी रचना के होते हैं. हाल के दृष्टिकोण से आंतों में प्रतिरक्षा समारोह की एक और वैश्विक विश्लेषण की मांग की है एक साथ अलग आंत्र डिब्बों का परीक्षण करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अद्वितीय पहलुओं को समझने के लिए इन डिब्बों और रिश्तों में होने वाली उन दोनों के बीच । इसलिए, इन सभी डिब्बों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल वांछित है । दो DTE उपचार > IEL और कुछ आईईसी के 95% को अलग करने के लिए पर्याप्त हैं । EDTA लक्ष्य कैल्शियम पर निर्भर जंक्शनों और आईईसी अलग करने के लिए कुशल है । इसलिए, बाद में EDTA उपचार से supernatant ज्यादातर आईईसी शामिल हैं । लिम्फोसाइटों की एक बहुत छोटी संख्या EDTA उपचार के बाद supernatant में पाया जा सकता है; हालांकि, लगभग 20 गुना अधिक लिम्फोसाइटों DTE अंश से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, EDTA उपचार से लिम्फोसाइटों IEL और एल पी एस लिम्फोसाइटों (चित्रा 4) है, जो विल्ली और तहखाना नुकसान से एल ई एस संदूषण पता चलता है की मिश्रित आबादी के समान है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, IEL उपचार EDTA से पहले DTE उपचार से एकत्र कर रहे हैं, पार डिब्बे संदूषण को कम करने से शुद्धता अधिकतम । अंय प्रोटोकॉल अनुक्रमिक dithiothreitol (डीटीटी) का उपयोग करें-EDTA उपचार या संयुक्त डीटीटी-EDTA उपचार के अलगाव के लिए IEL5,6,7। डीटीटी DTE की एक epimer है और एजेंटों को कम करने के रूप में दोनों कार्य करते हैं । इन प्रोटोकॉल में, डीटीटी केवल बलगम को दूर करने के लिए सूचित किया जाता है और EDTA IEL को अलग करने के लिए प्रयुक्त होता है । हालांकि डीटीटी और DTE का प्रभाव सीधे तुलना में नहीं था, IEL DTE उपचार या संयुक्त DTE-EDTA उपचार के बाद मूल्यांकन किया गया था । आश्चर्य नहीं, संयुक्त DTE-EDTA उपचार IEL तैयारी में आईईसी संदूषण बढ़ जाती है (चित्रा 5) और आईईसी की बड़ी संख्या की उपस्थिति के बाद घनत्व ढाल केंद्रापसारक IEL पैदावार में कमी आई. के रूप में EDTA कुछ विल्ली और तहखाने को नुकसान पहुंचा सकता है, संयुक्त DTE-EDTA उपचार भी एल ई पी लिम्फोसाइटों की तैयारी में IEL के संक्रमण या एल पी एस अलगाव से lp कोशिकाओं की हानि में परिणाम हो सकता है । इसके अलावा, के रूप में > IEL के 95% DTE अंश, अलग DTE और EDTA उपचार से अलग किया गया पसंद कर रहे हैं । कुछ प्रोटोकॉल घनत्व ढाल केंद्रापसारक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को समृद्ध6का उपयोग कर के बिना लिम्फोसाइटों अलग । घनत्व ढाल केंद्रापसारक अतिरिक्त समय लगता है और कुछ कोशिकाओं के नुकसान हो सकता है । तथापि, यह मृत कोशिकाओं को हटा, उपकला कोशिकाओं और बलगम, अत्यधिक समृद्ध लिम्फोसाइट आबादी के लिए अग्रणी (चित्रा 6), जो कोशिकाओं की छोटी आबादी का पता लगाने को बढ़ाने में मदद करता है और काफी हद तक प्रवाह के लिए अधिग्रहण समय घटाता है cytometry । घनत्व ढाल केंद्रापसारक mononuclear phagocyte सबसेट के बदल अनुपात में परिणाम की सूचना दी है7; हालांकि, लिम्फोसाइट सबसेट संरचना सामांय दिखाई देता है । यह विशेष रूप से IEL के अलगाव के लिए घनत्व ढाल केंद्रापसारक प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है । कुल मिलाकर, एक पूरा प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है उच्च समृद्ध और बेहतर व्यवहार्य लिम्फोसाइटों सहित सभी आंतों के ऊतकों से एल. पी. एस. और IEL न्यूनतम पार-डिब्बा संक्रमण के साथ.

पर्याप्त समय और देखभाल ऊतक अलगाव कदम के दौरान लिया जाना चाहिए के लिए तैयारियों के बीच संदूषण सीमा । पीपी की अधूरी हटाने काफी लिम्फोसाइटों एल सी तिरछा कर सकते हैं । ILF LP की तैयारी को भी दूषित कर सकते हैं. हालांकि, ILF नग्न आंखों से नहीं देखा जा सकता है और इसलिए शल्य चिकित्सा के पाचन से पहले हटाया नहीं जा सकता । विभिंन माउस उपभेदों ILF14, जो बहुत माउस उपभेदों के बीच एल पी एस लिम्फोसाइटों के चर संरचना में योगदान कर सकते है की विभिंन संख्या है । जब बलगम हटाने, धीरे आंत स्लाइड करने के लिए तहखाने झिल्ली और एल. पी., जो IEL के lp संदूषण में परिणाम सकता को नुकसान से बचने के लिए सुनिश्चित करें । संक्रमण का एक संकेत IEL तैयारी में बी कोशिकाओं की बड़ी संख्या की उपस्थिति है । IEL में कुछ b कक्ष (~ 1% या उससे कम) होते हैं, जबकि LPL में माउस दबाव के आधार पर ६०% b कक्ष हो सकते हैं । CD19 लेकिन नहीं B220 एल पी और IEL डिब्बे में बी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, आंत्र टी कोशिकाओं के रूप में भी B22015व्यक्त कर सकते हैं. इसके अलावा, कई आंत्र टी कोशिकाओं पारंपरिक मैक्रोफेज और ऐसे CD11b और CD11c के रूप में डीसी मार्करों, क्रमशः16व्यक्त कर सकते हैं । इसलिए उचित विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए उचित डंप गेटिंग रणनीतियों का उपयोग किया जाना चाहिए ।

कदम शोधकर्ताओं की जरूरतों को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । यांत्रिक पाचन स्थिर राज्य पर पीपी लिम्फोसाइट अलगाव के लिए पर्याप्त हो सकता है या लिम्फ नोड्स के collagenase पाचन सूजन के दौरान ल्यूकोसाइट्स के कुछ सबसेट के अलगाव की सुविधा हो सकती है । इस्तेमाल किया collagenase के प्रकार सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति और व्यवहार्यता और एल ई डी लिम्फोसाइटों5,17की शुद्धता पर काफी प्रभाव पड़ सकता है । आंत collagenase पाचन के लिए छोटे टुकड़ों में काटा जा सकता है, जो कोशिका उपज में वृद्धि हो सकती है । हालांकि, यह भी व्यवहार्यता कम कर देता है । collagenase के साथ मशीन समय उपज को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जबकि सेल मौत को कम करने, जीवित कोशिकाओं की अधिकतम वसूली के लिए अग्रणी । विभिंन प्रयोगशालाओं थोड़ा अलग घनत्व ढाल का उपयोग करने लिम्फोसाइटों अलग । एक अच्छी तरह से स्थापित 44%/67% घनत्व ढाल प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया है । शोधकर्ताओं ने अलग घनत्व ढाल का परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा उनके व्यक्तिगत आवश्यकताओं के अनुरूप हो सकता है । यदि लिम्फोसाइटों की एक बड़ी संख्या वांछित हैं, दो छोटी आंत DTE उपचार, EDTA उपचार और collagenase पाचन के लिए संयुक्त किया जा सकता है । यदि दो से अधिक आंतों बहुत दुर्लभ घटनाओं की जांच के लिए आवश्यक हैं, तो यह अनुशंसित है कि एकल सेल निलंबन अलगाव के बाद परित हैं ।

पृथक लिम्फोसाइटों आगे phenotypic, कार्यात्मक, और जीनोमिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रवाह cytometric विश्लेषण करते समय, यह अत्यधिक उचित है कि हमेशा एक व्यवहार्यता रंजक और विरोधी CD45 एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए मृत कोशिकाओं और गैर टेम कोशिकाओं है, जो बहुत विश्लेषण में वृद्धि होगी बाहर । यदि शुद्ध लिम्फोसाइट आबादी की जरूरत है, पसंद के अंय मार्करों के साथ CD45+ कोशिकाओं की छंटाई सेल किया जा सकता है । विरोधी CD8α-लेपित प्लेटों पर panning भी CD8α एक्सप्रेस इन टी कोशिकाओं के बहुमत के रूप में IEL तैयारी से शुद्ध टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । panning या सेल छँटाई आम तौर पर उपकला कोशिकाओं को दूषित IEL विकास को बाधित कर सकते हैं के रूप में IEL की संस्कृति के लिए आवश्यक है. संस्कृति में IEL अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए भोले splenocytes जैसे फीडर सेल को भी जोड़ा जा सकता है । यदि भक्षण किया जाता है, यह congenically बेमेल कोशिकाओं का उपयोग करने आबादी भेद महत्वपूर्ण है । बैक्टीरियल संदूषण फसल मीडिया के रूप में इन अल्पकालिक कार्यात्मक अध्ययन में शायद ही कभी एक समस्या है पेनिसिलिन, streptomycin और gentamicin । इसके अलावा, कई धोने कदम और घनत्व ढाल केंद्रापसारक सबसे बैक्टीरिया को हटा दें ।

अलगाव प्रक्रिया समय लेने वाली है और इष्टतम परिणामों के लिए देखभाल, परिशुद्धता और गति का संतुलन मांगता है । पर्याप्त समय प्रत्येक चरण के उचित हेरफेर सुनिश्चित करने के लिए खर्च किया जाना चाहिए, जबकि माउस बलिदान के बीच समय को कम करने और सेल व्यवहार्यता और उपज को अधिकतम करने के लिए एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने । यह एक नाजुक संतुलन है कि यह भी beginners के लिए उच्च व्यवहार्यता और उपज के साथ लिम्फोसाइटों अलग में निरंतरता प्राप्त करने की कोशिश कर के लिए एक अड़चन है । एक पूरी अलगाव प्रक्रिया एक गिने एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए माउस इच्छामृत्यु से शुरू एक अनुभवी शोधकर्ता 8 चूहों के लिए लगभग 8 एच लेता है । यह उच्च गुणवत्ता और reproducible परिणाम उत्पन्न करने के लिए 8 से अधिक चूहों के लिए सहायता प्राप्त करने की सलाह दी है. यह महत्वपूर्ण है देखभाल जब तिल्ली, रक्त, या अंय लसीकावत् ऊतकों से लिम्फोसाइटों के साथ इन ऊतकों से लिम्फोसाइटों की तुलना के रूप में व्यापक मशीन कृत्रिम अलगाव प्रक्रिया के साथ जुड़े परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते है17। एल. पी. और IEL आबादी की नियमित तुलना इसी तरह लसीकावत् ऊतकों का इलाज करने के लिए कि ब्याज की मार्कर आंतों के ऊतकों से लिम्फोसाइट अलगाव के दौरान संग्राहक है का आकलन करेगा । इसी तरह के मुद्दों को भी एक प्रमुख चिंता का विषय है जब लसीकावत् ऊतकों से उन लोगों के साथ आंतों से आरएनए प्रोफाइल की तुलना.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

B.S.S. NIH अनुदान (R01 AI076457) और पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गई निधियों द्वारा समर्थित है । Z.Q. को NIH ग्रांट (K12 GM102778) द्वारा सपोर्ट किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

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References

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अलग माउस से लिम्फोसाइटों छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली
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Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

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