Summary
腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルについて述べると、小さな腸管免疫系の腸上皮は。
Abstract
腸管の免疫系は、急性胃腸炎起因する効果的な免疫応答をマウントしながらレスポンス食物抗原と共生細菌の耐性を生成することによって、腸管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。微生物。さらに、ローカルの腸管免疫では、遠いと全身の免疫力の深遠な影響が明らかになった。そのため、腸内の免疫応答を誘導する方法と、免疫応答の結果を研究することが重要です。腸管関連リンパ組織パイエルとドレインの腸間膜リンパ節のような小腸誘導サイトと粘膜のようなエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルの説明ここと腸上皮。この手法は、最適な純度と生存率と許容可能な時間制約の中での最低限のコンパートメント クロスコンタミネーション多数小さい腸組織からのリンパ球の分離を保証します。リンパ球および小腸組織から他の免疫細胞を分離する技術力により、消化器感染症、癌、炎症性疾患に対する免疫応答の理解。
Introduction
胃腸 (GI) 地域には多くのひだや突起内部の体と外部環境を分離する最大のインターフェイスを表す。腸管の免疫系は、消化管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。それは常に食物抗原、共生細菌と病原微生物にさらされます。そのため、それは急速に急性胃腸炎起因微生物1効果的な免疫応答を生成する能力を維持しながらの食物抗原と共生細菌への耐性に残らなければなりません。腸管免疫系誘導サイト、ナイーブ リンパ球は抗原提示細胞が腸の粘膜から抗原を運ぶがアクティブ化されている、およびエフェクター サイト、活性化リンパ球出す特定に解剖学的分類できます。エフェクター機能2。誘導サイトは、調査専門の M 細胞と地域の排水腸間膜リンパ節 (MLN) の作用により直接腸管パイエル板 (PP) のリンパ組織構造を構成します。エフェクター サイトは基底膜と小腸上皮、上皮間リンパ球 (IEL) を含む基底膜上にある単一の細胞層の下の結合組織である粘膜 (LP) から成っています。リンパ球が、感染症や癌に対する保護を仲介し、炎症性疾患の免疫病理学にまた貢献するかもしれない適応免疫の主要なプレーヤーです。それは重要でありこれらの明瞭なリンパ球の研究に関連性の高いより良い粘膜局所理解の誘導とエフェクター機能。
腸内免疫事象を探る捜査官の数を加速するいると、これらのコンパートメントからのリンパ球の隔離のための比較的シンプルで統一されたプロトコルが必要です。いくつかの研究グループがマウス小さい腸内コンパートメント3,4,5,6,7 から免疫細胞を分離することにいくつかの類似のプロセスを共有プロトコルを公開しています。.ただし、個々 のプロトコルの焦点に応じてそれらの間でいくつかの技術的な違いがあります。たとえば、LP から免疫細胞を孤立させることにフォーカスを 1 つのプロトコルは細胞生存率、細胞表面マーカーの発現と分離免疫細胞5の構成に関するさまざまな酵素の消化力の影響を調べます。他のプロトコルは、密度遠心分離6なくリンパ球の隔離のための迅速かつ再現性のある方法を強調表示します。最後に、特定のプロトコルは、小腸7の異なったティッシュ層から単核食細胞を分離する目的も存在します。ここでは、小腸の MLN PP LP、IEL のコンパートメントからリンパ球集団の連続分離ができる再現性の高いプロトコルが表示されます。
我々 は主無料その他の腸の仕切りからの汚染物質の LP と IEL のコンパートメントから高純度の人口を隔離するのに焦点を当てます。これは広くプロトコル生成に許容可能な時間の制約4,8,9,10、11,12内で最大限に純粋な実行可能なリンパ球の高収率を使用しました。このプロトコルはまたこれらの異なるコンパートメントにリンパ球を勉強する善意の機会をできるように最小限の交差コンパートメント汚染と LP と IEL コンパートメントからのリンパ球の分離を保証します。分離されたリンパ球は、フローサイトメトリーによる解析や機能解析のようなそれ以上の操作を受けることができます。このプロトコルが正常にリンパ球の分離にマウス小腸と大腸から中に適用されたリステリア菌、サルモネラ、エルシニア ペスチスなど細菌感染症感染症や化学物質、病原体誘発大腸炎などの炎症性条件。このプロトコルは、樹状細胞、マクロファージ、好中球と単球マウス小腸結腸からなどの自然免疫系細胞を分離するも使用できます。
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Protocol
すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施され、石の小川の大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
メモ: は、手順を実行する前にすべての承認が与えられていることを確認します。
1. ソリューションの準備
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HGPG (HEPES、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン)、100 ×
- ミックス 59.6 g HEPES (最終的な 500 mM)、14.6 g L-グルタミン (最終的な 200 mM)、1 × 106 U (2,000 U/mL 最終) ペニシリン、ストレプトマイシン 1 g (2 mg/mL 最終) と 2.5 mg ゲンタマイシン (5 μ g/mL 最終)。追加 RPMI 1640 ~ 500 mL。NaOH を使用して 7.5 pH 調整 (調整する前にバッファーが ph 値約 6.0 の黄色/オレンジ色)。フィルターは、0.45 μ m のフィルターを使用して滅菌します。因数とストア 4 ° C、1 ヶ月、最長 1 年間、-20 ° C で。
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HEPES 炭酸バッファーは、10 x
- 23.8 g HEPES (最終的な 100 mM)、21 g NaHCO3 (最終的な 250 mM) を混合し、1,000 mL に水を追加します。塩酸フィルターで 7.2 pH を調整する 0.45 μ m のフィルターを使用して殺菌します。常温で保存します。PH は、時間の経過と共に変更します。再定期的に pH を調整します。
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メディアを収穫 (〜 1 ボトル/2 マウス)
- 500 mL RPMI 1640、25 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (5% 最終)、および 5 mL 100 × HGPG を追加します。4 ° C で最大 6 ヶ月の保存します。
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ジチオエリトリトール (DTE) ソリューション (40 mL/小腸)
- ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca2+- および Mg2+-無料、50 mL 10 × HEPES 炭酸バッファー、および 50 mL の熱不活化ウシ胎児血清 (10%)。350 mL H2O および 15.4 mg ジチオエリトリトール/100 mL (最終的な 1 mM) を追加します。使用する前に新しいこれを準備します。
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エチレンジアミン edta 溶液 (50 mL/小腸)
- ミックス 50 mL 10 × ハンクス平衡塩溶液、Ca2+- および Mg2+-5 mL 100 × HGPG で無料。445 mL H2O を追加 260 μ L 0.5 M の EDTA を追加/100 mL (最終的な 1.3 mM)。使用する前に新しいこれを準備します。
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コラゲナーゼの解決 (30 mL/LP)
- 500 mL RPMI 追加 50 mL FBS (10 %fbs ファイナル) 5 mL 100 × HPGP、1 mL 0.5 M MgCl2 (最終 1 mM)、および 1 mL 0.5 M CaCl2 (最終 1 mM)。タイプ I (100 U/mL ファイナル)、コラゲナーゼを追加します。使用する前に新しいこれを準備します。
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密度勾配 (DG) ソリューション
- 90 mL DG 原液を混合することによって 1 × DG 原液を準備 (材料の表を参照) を 10 mL 10 × PBS の。4 ° C で滅菌を維持します。
- 1 × DG 原液、56 mL RPMI 1640 44 mL を混ぜて 44 %dg ソリューション (8 mL/発想 8 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。
- 1 × DG 原液、33 mL RPMI 1640 67 mL を混ぜて 67 %dg 溶液 (5 mL/発想 5 mL/LP) を準備します。使用する前に新しいこれを準備します。
2. 腸間膜リンパ節、腸、の分離およびパイエル パッチ
- 炭酸ガス麻酔とセカンダリの頚部転位を使用してマウスを安楽死させます。その裏にマウスを置き、70% エタノールをスプレーします。はさみを使用して正中切開し、皮膚と腹壁腹腔内を公開するを開きます。
- 盲腸を検索し、鉗子を使用して盲腸をそっと引き下げます。鉗子を使用して、慎重にチェーンは、コロンが提携した全体の MLN の公開、右に小腸に移動します。
注: 腸のチェーンやリンパ排水であった腸間膜リンパ節の地図には、13が描かれています。 - 盲腸に近い、チェーンの下のノードを識別します。その周りに腸間膜/脂肪をつかんで鉗子の別のセットを持つリンパ節の周りから脂肪を tweezing によっては下部から上部の MLN チェーンを削除優しくする鉗子のセットを使用します。
- MLN チェーンを収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに置きます。ペーパー タワーのチェーンをローリングと鉗子の 2 つセットで脂肪を引っ張って腸間膜/脂肪を削除します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの MLN の場所。
注: ノードの (i) 直接操作は推奨されません。代わりに、それらの周りの腸間膜/脂肪を把握します。(ii) 細胞生存率を改善するために可能な限り多くの腸間膜/脂肪を削除するが重要です。 - 幽門括約筋の下とはさみを使って盲腸上小腸をカットします。腸を引き出しますゆっくり回腸から十二指腸鉗子の別のセットを使用して接続されている腸間膜/脂肪を除去しながら 1 組の鉗子を使用します。
- 収穫メディアで湿らせたペーパー タオルに腸を置き、鉗子の 2 つのセットをオフ任意の残りの腸間膜/脂肪をいじめます。
注: (i) は最適な細胞収量および実行可能性のために、できるだけ多くの腸間膜/脂肪を除去することを確認します。(ii) 収穫メディアを定期的に適用することによってこの手順と次の手順で湿らせた腸を維持します。 - 曲線はさみで腸からそれらを削除することによって、パイエル板を収集します。解離性のスコープまたは虫眼鏡 (初心者) を必要な場合使用します。パイエル板のほとんどは訓練された目に見えるはずです。小腸から 5 11 (典型的な) パイエルを収集します。冷たい収穫後の分離手順でメディアの場所 Peyer のパッチ。
注: Peyer のパッチが小さく、主に丸腸間膜付着線向かい外側腸壁の膨らみ。 - 糞便のコンテンツ、粘液を追放するのに回腸に向けて十二指腸から鉗子と優しくスライドの平らな側面を使用します。一度粘液の大部分を削除する手順を繰り返します。
注: 粘液の削除が不完全する細胞生存率が低下し、降伏。それにもかかわらず、必ず腸絨毛をストリッピングや基底膜の損傷を避けるためにゆっくりスライドしてください。 - 高級はさみを使用し一点に鈍い端腸に鈍い端を挿入し、腸を縦十二指腸から回腸までオープン カットします。横方向に ~ 2 cm 開いた腸を切る。25 mL 冷たい収穫メディア分離手順については後で 50 mL の円錐管で腸の作品を配置します。
注: メディアで湿らせたはさみを維持に役立ちます腸で楽々 スライドします。
3. 誘導サイトからリンパ球の分離
- 3 mL シリンジのプランジャーを使用して 70 μ m セル ストレーナーにどう優しく MLN リンパ球を分離します。5 ml の冷たい収穫メディアのセル ストレーナーを洗浄します。
- 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット MLN 細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。
注: 赤い血セル換散バッファーは削除中に出血した場合、赤色の血液細胞を削除する使用できます。 - 37 ° C で 30 分間 220 rpm prewarmed 5 mL コラゲナーゼ溶液 15 mL の円錐管にパイエル板の孵化によって、パイエル板のリンパ球を分離します。
- 15 の渦最大設定でフィルター s 消化組織及び上澄み 50 mL の円錐管に 70 μ m セル ストレーナー。優しく 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して、冷たい収穫メディアの 5 mL のセル ストレーナーを洗浄します。
- 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によってパイエル パッチ細胞をペレットし、1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。
注: Peyer のパッチ分離いくつかの汚染の粘膜固有層リンパ球および上皮間リンパ球があります。
4. 小腸上皮間リンパ球の分離
- 10 回チューブを反転し、解決、腸の部分をさせる、上澄みを離れて注ぐ冷たい収穫メディア 25 mL で 3 回小腸の部分を洗います。
注: 組織の部分はチューブの底に容易に解決すべき。そうでない場合あまりにも多くの腸間膜/脂肪が添付されているか、空気の泡を関連付けられている指標です。 - 腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL のシリル エルレンマイヤー フラスコに転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。
- 渦で最大に設定 10 s. 転送清新しい 50 mL の円錐管に元管内組織部分を保つように注意しながら 70 μ m セル ストレーナー管。の上清を廃棄しないでください上清には、上皮間リンパ球が含まれています。4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞10 mL の冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します、氷保存できます。
- 腸を含んでいる 50 mL の円錐管に prewarmed DTE 溶液 20 mL を追加し、攪拌棒を含む 50 mL シリコーン エルレンマイヤー フラスコに戻って転送します。37 ° C で攪拌し、220 rpm 20 分マグネチックスターラーで攪拌棒を保持し、組織とソリューションを 50 mL の円錐管に転送するフラスコの外に大きな磁石を使用します。
注: DTE は上皮間リンパ球を豊かにする還元剤です。 - 渦で最大に設定 10 s. 転送清 70 μ m セル ストレーナー (ステップ 4.3) から最初の DTE 治療上清から細胞を含む前のチューブにチューブ。
注: 残りの腸管部分、粘膜からリンパ球を分離する使用されます。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に上皮細胞が存在し、基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。 - 4 ° C で 5 分間 400 × g で上清を遠心分離によって細胞をペレット室温 (RT) で 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- 転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。RT 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。ブレーキを使用せず室温で 20 分間 1600 × g で遠心分離機します。
注: チューブは細胞が管壁に付着するを防ぐためにウシ血清前処理した可能性があります。 - 生菌が 44% から 67% 界面バンド (バフィー コート) を結成、死んだ細胞といくつかの上皮細胞は、グラデーションの上部に粘液状のフィルムと赤の血液細胞は、ペレットに注意してください。真空吸引によりインターフェイスの ~ 2 cm 以内へのグラデーションの最上位のレイヤーを削除します。パスツール ピペットを使用して、インターフェイスでバフィー コートを収穫し、40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管にそれらを転送します。
- 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。
5. 小腸粘膜固有層リンパ球の分離
- 残りの腸の部分を含むフラスコに prewarmed EDTA 溶液の 25 mL を追加することによって腸の組織片から上皮細胞を削除します。37 ° C で 30 分のマグネチックスターラー 220 速回転撹拌フラスコは、攪拌棒を保持し、フラスコ内の腸の部分を維持しながら上澄みを慎重に廃棄フラスコの外に大きな磁石を使用します。
注: (i) EDTA はカルシウム依存性接合をターゲット、腸管上皮細胞の剥離を促進するカルシウムのキレート剤です。(ii)、上清は曇りであるべきし、自分のコレクションが必要な場合は、IEC を分離するために使用可能性があります。 - 5.1 のステップを繰り返します。
注: 上清は少ない曇りこの培養に続くはずです。品質管理: 組織の部分ことができます削除、組織学的に腸上皮細胞を削除されている基底膜が損なわれていないことを確認するチェックします。上清からのサンプルも確認するフローサイトメトリーによって評価されるその白血球 (CD45+細胞) が存在しません。 - RT 収穫メディアの 50 mL をフラスコに追加します。磁石で簡単にかき混ぜます。腸管部分を解決し、慎重に上澄みを廃棄しなさい
注: この手順により、コラゲナーゼの消化力の前に EDTA の除去、EDTA は、コラゲナーゼの機能にとって重要なカルシウムをキレートでコラゲナーゼを不活性化します。 - フラスコに prewarmed コラゲナーゼ溶液 30 mL を加え、マグネチックスターラー 45 分に 37 ° C および 220 rpm で腸の部分をかき混ぜます。
- 転送は、70 μ m セル ストレーナー フィルタ リングによって組織し、50 mL コニカル チューブに上清を消化しました。軽くフィルターをマッシュ アップする 3 mL シリンジのプランジャーを使用して残りの組織部分を切り離して考えます。10 ml の冷たい収穫メディアのフィルターを洗います。
- 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞周囲温度 44 %dg 溶液 8 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- 転送 8 mL 44 %dg ソリューション/細胞懸濁液に 17 mm ø x 100 mm 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブをスタイルします。周囲温度 67 %dg 溶液 5 mL にアンダーレイします。常温、1600 × g 20 分でないブレーキとグラデーションを遠心します。
- 真空吸引により上に脂肪の層を削除します。パスツール ピペットを使用して、インタ フェースと 40 mL 冷たい収穫メディアを含む 50 mL の円錐管に転送でバフィー コートを収穫します。
- 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によるペレット細胞1 mL 冷たい収穫メディアで細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。
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Representative Results
プロトコルの概略図が描かれている (図 1)。腸粘膜誘導とエフェクターのサイト内にあるリンパ球がはっきりと整理されています。Peyer のパッチ (PP) および腸間膜リンパ節 (MLN) を含むよく組織化された T 細胞領域と B 細胞濾胞リンパ腸上皮に分布よりびまん性リンパ球が含まれています。粘膜 (LP) には、分散びまん性リンパ球とリンパ球分離リンパ濾胞 (ILF) と cryptopatches のようなリンパ組織内の両方が含まれています。各腸内免疫のコンパートメントはまたリンパ球サブセット (図 2) のユニークな組成に代表されます。MLN は主に PP リンパ球が B 細胞 (約 80%) 主 αβ T 細胞 (約 70%) から成る。LP リンパ球構成は主ひずみ依存 αβ T 細胞と B 細胞の主成分です。その他の腸の仕切りとは異なる、上皮に存在するリンパ球は、主に γδ T 細胞 (~ 60%) と αβ T 細胞 B セルは基本的にいません。Αβ T 細胞サブセットの異なる比率は腸の明確な解剖学的位置内にも存在します。LP の αβ T 細胞は主として cd4 抗原+ T 細胞 (約 70%) の CD8α、+ T 細胞 (~ 85%) 上皮内リンパ球 (IEL) コンパートメントで一世を風靡。CD8α+ LP と IEL のコンパートメント内にある αβ T 細胞表現 CD8αα ホモまたは CD8αβ ヘテロダイマーに対し誘導サイト CD8α+ αβ T 細胞主エクスプレス CD8αβ ヘテロダイマー (図 3)。IEL コンパートメントにおける γδ T 細胞の大半も表現 CD8α、γδ T 細胞 CD8α 百万不足で発見 (図 3)。一般論に関係なくリンパ球サブセットの構成はマウス系統によって異なります、年齢や疾患の変更になる場合があります。など、実験操作のために利用の背景の緊張の定常状態における腸管粘膜内のリンパ球集団を慎重に分析を行わなければなりません。
セル降伏ひずみやマウス、および使用の実験条件の年齢によって大きく異なります。診断またはトリパン ブルー色素排除を使用して自動細胞計数機のシングル、ライブのセルを数えることができます。リンパ球の数として計算されます: 細胞数 × CD45+細胞 (%) のゲート 3 × リンパ球 (%) ゲート 4 (図 2)。約 15 × 106 MLN リンパ球、5-10 × 106 PP リンパ球、2-5 × 106 LP リンパ球、および 3-6 × 106 IEL は、8-12 週齢世間知らず C57Bl/6 または Balb/c マウスから入手できます。また、染色処理中にセルの損失が発生すること注意してセル人口を定量化するフロー ベース カウント ビーズを使用できます。最終的には、カウント法の一貫性は、実験間で適切に比較を行うことができますようにラボ内で維持されなければなりません。
このプロトコルでは、DTE 治療高濃縮リンパ球の最適な分離の IEC を削除する EDTA 処理に続いて発想を豊かにされます。2 つの DTE の治療が十分に分離 > IEL の 95%。リンパ球数が非常に少ない EDTA 処理もあります。これらのリンパ球 IEL および LP リンパ球 (図 4) の混合物のように。DTE および IEL を分離する結合された DTE EDTA 施術の比較も行われています。結合された DTE EDTA 処理 IEL に備えて (図 5) IEC 汚染を増加し、密度勾配遠心後のライブの免疫細胞の最終利回りを軽減します。腸内のコンパートメントからリンパ球を分離する密度勾配遠心法を推奨します。死んだ細胞、上皮細胞などの粘液、高濃縮のリンパ球の分離を促進がなくなり、フローサイトメトリーを大幅に減少獲得回 (図 6)。
図 1.隔離のプロトコルのフロー チャート。DTE、ジチオエリトリトール。EDTA、エチレンジアミン四酢酸。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.腸の組織からのリンパ球集団の戦略をゲート フローサイトメトリー 。腸間膜リンパ節 (MLN)、粘膜 (LP)、パイエル板のパッチ (PP) および上皮内リンパ球 (IEL) コンパートメントから作製した単一細胞懸濁液は修正可能性染料で染色した (例えば Live/デッド) とそれに続く蛍光標識抗体: 造血細胞、B 細胞 CD19、t CD3ε の同定の CD45 の細胞、αβ T 細胞、γδ T 細胞、CD8α の CD8α の TCRδ の T 細胞受容体 (TCR) β+ αβ T 細胞および CD4 の CD4+ αβ T 細胞。0, 前方散乱 (FSC) - A/側方散乱 (SSC) - A のプロパティをゲートします。ゲート 1 は、単一のセルを識別されます。ゲート 2 は、生きた細胞を識別されます。ゲート 3 には、造血細胞が識別されます。FSC/A SSC プロパティに基づいて 4 識別されたリンパ球をゲートします。ゲート 5 には、T 細胞と B 細胞が識別されます。ゲート 6 識別された αβ T 細胞および総 T 細胞の中で γδ T 細胞。ゲート 7 識別 CD8α+と CD4+ T 細胞の αβ T 細胞集団。フォルス カラー プロット内で (赤のフォント) の割合は、前の親の人口の中で示されたゲート内のセルの周波数に対応しています。0 門と門 1 イベントの合計数を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.表現型 ofCD8α+ αβ T 細胞、γδ T 細胞の腸組織。CD8α による CD8β の発現+ αβ T 細胞、γδ T 細胞の CD8α の発現が描かれています。ヒストグラム内 (赤のフォント) の割合は、指定された親の人口の中で示されたマーカーを発現する細胞の頻度に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.DTE、EDTA、およびコラゲナーゼの治療からのリンパ球の構成。親のゲーティング戦略は図 2のように同じです。ゲート 5 には、T 細胞と B 細胞が識別されます。ゲート 6 識別された αβ T 細胞および総 T 細胞の中で γδ T 細胞。ゲート 7 識別 CD8α+と CD4+ T 細胞の αβ T 細胞集団。フォルス カラー プロット内で (赤のフォント) の割合は、前の親の人口の中で示されたゲート内のセルの周波数に対応しています。リンパ球分離 EDTA から DTE およびコラゲナーゼのトリートメントからそれぞれ分離された IEL および LP のリンパ球の混合物に似ています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.DTE 処理と IEL の隔離のための結合された DTE EDTA 処理比較します。このプロトコルによれば DTE 治療を行った。IEL は DTE の治療後、EDTA 治療前に収集されました。結合された DTE EDTA 処理をこのプロトコルで使用される同じ濃度で、同時に行った。FSC/SSC-A の特性、生存率、CD45 の割合+造血細胞が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.IEL と LP のリンパ球製剤の純度に密度勾配遠心の影響。このプロトコルによると分離した単一細胞懸濁液が密度勾配遠心法を受けるか、直接フローサイトメトリーで分析しました。FSC/SSC-A の特性、生存率、CD45 の割合+造血細胞が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
誘導 (MLN と PP)、腸内から粘膜のリンパ球の隔離のため詳細なプロトコルを提示とエフェクター (LP、IEL コンパートメント) サイト。プロトコルが (時間) の入力と出力 (生存率と収量) の生産性と成果を最大化するバランスを開発しました。プロトコルはまた LP と IEL のコンパートメント間の最小限のコンパートメント クロスコンタミネーションを保証します。
マウス小腸から免疫細胞を分離するためのいくつかのプロトコルが公開された3,をされている4,5,6,7。これらのプロトコルのほとんどは LP から免疫細胞を分離することに焦点を当てます。腸上皮は、直接外部環境にさらされるが、リンパ球のユニークな組成で構成されています LP から明確なコンパートメントです。最近のアプローチはこれらのコンパートメントとの関係で発生する免疫反応のユニークな側面を理解するために、同時に腸内の異なるコンパートメントを調べることによって腸の免疫機能のよりグローバルな分析を求めています。それらの間.したがって、すべてのこれらのコンパートメントから免疫細胞を分離するための信頼性の高いプロトコルが望まれます。2 つの DTE の治療が十分に分離 > IEL といくつかの IEC の 95%。EDTA はカルシウム依存性接合を対象とされ、IEC をデタッチする効率的です。したがって、後続の EDTA 処理から上清は大抵 IEC を構成します。リンパ球数が非常に少ないした EDTA 処理; 清しかし、約 20 のより多くのリンパ球は、DTE 分数から取得されます。また、EDTA 処理からリンパ球 IEL と LP リンパ (図 4)、絨毛やクリプトから LP 汚染を示唆しているの混合集団のように被害。したがって、このプロトコルで IEL から収集されます EDTA 処理前処理 DTE 間区画の汚染を最小限に抑えることにより純度を最大化します。他のプロトコルを使用して、シーケンシャル ジチオトレイトール (DTT)-EDTA 治療または IEL5,6、7の隔離のための結合の DTT EDTA 処理。DTT は DTE のエピマーと両方の還元剤として行為。これらのプロトコルの DTT が粘液をのみ削除する報告され、EDTA IEL を分離するために使用します。DTT と DTE の効果を直接比較したないが DTE 治療または結合された DTE EDTA 処理後 IEL を評価しました。当然、結合された DTE EDTA 処理増加 IEL に備えて (図 5) IEC 汚染と IEC の多数の存在密度勾配遠心後 IEL 利回りに減少しました。いくつかの絨毛と陰窩 EDTA を損傷することができます、結合された DTE EDTA 処理も IEL に備えて LP リンパ球の汚染または LP 分離から LP 細胞の損失であります。また、> IEL の 95% は DTE 画分から分離した、別の DTE と EDTA の治療が優先されます。一部のプロトコルは、免疫細胞の6を豊かにする密度勾配遠心法を用いたなくリンパ球を分離します。密度勾配遠心法追加時間がかかるし、いくつかの細胞の損失が発生する可能性があります。ただし、それは死んだ細胞、上皮細胞、粘液、高濃縮のリンパ球集団 (図 6)、セルの小さい人口の検出を高めるのに役立ちますし、フローの収集時間が大幅に減少につながる削除されます。フローサイトメトリー。密度勾配遠心法は、単核食細胞サブセット7の変化率で結果を報告しています。しかし、リンパ球サブセットの構成は、正常に表示されます。IEL の隔離のための密度勾配遠心法を実行すると特に便利です。全体的にみて、クロス コンパートメント雑菌 LP と IEL を含む腸組織のすべてから高濃縮で最適な実行可能なリンパ球を分離する完全なプロトコルが表示されます。
かなりの時間と介護の準備の間の汚染を制限する組織分離のステップの間に取られなければなりません。PP の不完全な除去は大きく LP リンパ球をスキューできます。连日 ILF も LP 準備を汚染できます。ただし、连日 ILF 肉眼で見ることができない、したがって手術削除できません消化前に。異なるマウス系統は、连日 ILF14LP リンパ球マウス系統間の変数の組成に大きく貢献するかもしれない別の番号を持っています。粘液を取り外す場合は、基底膜および LP は、IEL の LP の汚染につながる可能性がありますへの損傷を避けるために腸を優しくスライドすることを確認します。汚染の 1 つの徴候 IEL 準備における B 細胞の多数の存在であります。IEL を含む少数の B 細胞 (~ 1% 以下)、LPL がマウス株に応じて最大 60 %b 細胞を持つことができます一方。腸管 T 細胞はまた B22015を述べることができるよう、CD19 がない B220 を LP と IEL のコンパートメントにおける B 細胞を識別するために使用必要があります。さらに、多くの腸管 T 細胞は、伝統的なマクロファージと CD11b など CD11c、それぞれ16DC マーカーを述べることができます。したがって、適切な分析を確保するための戦略をゲート適切なダンプを活用すべき。
研究者のニーズに合わせて手順を変更できます。機械的消化は定常状態で PP のリンパ球の隔離のための十分な可能性があります。 またはリンパ節のコラゲナーゼの消化力は、炎症時の白血球サブセットの分離を促進するかもしれない。コラゲナーゼの使用の種類は、細胞表面マーカーの発現と生存率や LP リンパ球5,17の純度に実質的な影響があります。腸は、細胞収率を高める可能性がありますコラゲナーゼの消化力のための小さな断片に切断可能性があります。ただし、生存率も減ります。コラゲナーゼとインキュベーション時間は生きているセルの最大回復につながる細胞死を最小限に抑えながら収率を最大限に最適化可能性があります。別のラボでは、リンパ球を分離するのにわずかに異なる密度勾配を使用します。老舗の 44/67% 密度勾配プロトコルを次に示します。研究者は、個々 のニーズに合わせて異なる密度勾配をテストことがあります。リンパ球の大きい数が必要な場合、DTE トリートメント、EDTA トリートメント、コラゲナーゼの消化力の 2 つの小腸を組み合わせて使用できます。以上 2 つの腸は非常にまれなイベントに必要なそれは単一細胞懸濁液を分離後プールすることを推奨は。
分離されたリンパ球は、さらに表現型・機能・ ゲノム解析に使用できます。フローサイトメトリーによる解析を実行すると、それは常に強くお勧め使用、生存の染料と死んだ細胞や分析を非常に高める非造血細胞を除外する抗 CD45 抗体。純粋な球の人口が必要な場合は、CD45 の並べ替えセル+の選択の他の印に沿って細胞を実行ことができます。反 CD8α コーティング プレートにパンは、大半のこれらの T 細胞表現 CD8α IEL 準備から純粋な T 細胞を分離する使用できます。パンまたはセルの並べ替えは、IEL の成長を阻害することができます上皮細胞を汚染、IEL の文化一般に必要です。IEL 文化の生存を促進する素朴な脾細胞などフィーダー細胞を追加もできます。フィーダーを使用している場合、集団を区別するために congenically 一致しない細胞を活用することが重要です。細菌汚染はほとんどこれらの短期的機能研究で問題収穫メディアには、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンが含まれています。さらに、多数の洗浄のステップと密度勾配遠心法は、ほとんどの細菌を削除します。
分離プロセスは時間がかかると、最適な結果を得るのため, 精度と速度のバランスを要求します。十分な時間はマウスの犠牲の間の時間を最小限に抑え、細胞生存率と収量を最大化する単一細胞懸濁液を取得しながら各ステップの適切な操作を確認する必要があります。これはまた高い生存率と収量でリンパ球を分離するの整合性を得るためにしようとしている初心者のためのボトルネックは、微妙なバランスです。カウントの単一細胞懸濁液を取得するマウス安楽死から始まる全体の分離プロセスを取る 8 マウスの経験豊富な研究員約 8 h。高品質で再現性のある結果を生成するよりも 8 マウスの支援を得るためにお勧めします。分離手順17に伴う人工の変化につながる可能性がありますこれらの組織から、脾臓、血液、または広範な孵化として他のリンパ組織からのリンパ球のリンパ球を比較するときに注意を使用することが重要です。同様に扱われるリンパ組織に LP と IEL の人口のルーチンの比較評価関心のマーカーは小腸組織からのリンパ球分離中に調節するかどうか。腸からリンパ組織からの RNA プロファイルを比較するとき、同様の問題は主要な関心事をいます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
B.S.S. をサポートするには、NIH グラント (R01 AI076457) とストーニブ ルック大学によって提供される資金。Z.q 値は NIH 支え (K12 GM102778) を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
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