Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281
Automatic Translation
1, 1
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

Summary

Здесь мы описываем подробный протокол для изоляции лимфоцитов из индуктивных сайтов, включая патчи Пейера кишечнике связанных лимфоидной ткани и крылом брыжеечных лимфатических узлов и эффекторных сайтов, включая lamina propria и кишечного эпителия кишечной иммунной системы малых.

Abstract

Кишечные иммунная система играет важную роль в поддержании барьерной функции желудочно-кишечного тракта, создавая терпимая(ый) ответы на пищевые антигены и синантропных бактерий во время монтажа эффективного иммунного ответа на энтеропатогенные микробы. Кроме того стало ясно, что местные кишечного иммунитета имеет глубокое влияние на отдаленные и системного иммунитета. Таким образом важно изучить как индуцируется кишечных иммунный ответ и что итоги иммунологического ответа. Здесь описывается подробный протокол для изоляции лимфоцитов из тонкой кишки индуктивный как патчи Пейера кишечнике связанных лимфоидной ткани и крылом брыжеечных лимфатических узлов и эффекторных сайты как lamina propria и кишечного эпителия. Эта техника обеспечивает изоляцию большое количество лимфоцитов из небольших кишечных тканей с оптимальной чистоты и жизнеспособности и минимальным полигамное загрязнения в течение приемлемого времени. Технические возможности изолировать лимфоциты и другие клетки иммунной системы от кишечных тканей позволяет понимание иммунной реакции на инфекции ЖКТ, рак и воспалительные заболевания.

Introduction

Желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) имеет много складок и выступов, которые представляет крупнейший интерфейс, отделяя внутреннего тела и внешней среды. Кишечные иммунная система играет важную роль в поддержании барьерной функции желудочно-Кишечного тракта. Оно постоянно подвергается воздействию пищевых антигенов, синантропных бактерий и болезнетворных микробов. Таким образом оно должно оставаться терпимая(ый) антигенов продовольственной и синантропных бактерий при сохранении способности быстро генерировать эффективного иммунного ответа на энтеропатогенные микробы1. Кишечной иммунной системы может анатомически разделить индуктивных сайтов, где лимфоциты наивной активируются антиген представляющих клеток, перевозящих антигены из слизистой оболочки кишечника, и эффекторных сайтов, где активированных лимфоцитов оказывают конкретные эффекторные функции2. Индуктивный сайты включают организованной лимфоидных структура Пейера (PP), что обследования кишечника люмен непосредственно через действий специализированных клеток M и крылом брыжеечных регионарных лимфатических узлов (млн.). Эффектор сайтов состоят из propria пластинки (LP), который является соединительной ткани ниже базальной мембраны и кишечного эпителия, одноклеточного слоя, расположенный над базальной мембраны, содержащий интраэпителиальных лимфоцитов (IEL). Лимфоциты являются основными участниками адаптивного иммунитета, которые посредником защиту от инфекции и рака и может также способствовать иммунопатологии в воспалительных заболеваний. Это важно и весьма актуальное значение для изучения лимфоцитов в этих различных анатомических слизистой отсеков лучше понять их индукции и эффекторных функций.

Относительно простой и унифицированный протокол для изоляции лимфоцитов из этих отсеков необходима как числа следователей, изучение иммунного события, происходящие в кишечнике ускоряется. Некоторые исследовательские группы опубликовали протоколы, которые разделяют несколько аналогичных процессов для изоляции иммунные клетки от мыши малого кишечника отсеков3,4,5,6,7 . Однако есть несколько технических различий между ними в зависимости от внимания отдельным протоколом. Например с упором на изоляцию иммунные клетки от LP, один протокол рассматривается влияние различных ферментативного пищеварения на жизнеспособность клеток, клеток поверхности маркер выражения и состав изолированных иммунные клетки5. Другой протокол выделяет быстрый и воспроизводимый метод для изоляции лимфоцитов без центрифугирования плотность6. Наконец конкретные протоколы существуют также с целью изолировать мононуклеарных фагоцитов из слоев различных тканей в тонкой кишке7. Здесь представлен высокую воспроизводимость протокол, который позволяет последовательно изоляция популяций лимфоцитов из млн, PP, LP и IEL отсека тонкой кишки.

Мы сосредоточены на изоляцию высокоочищенных населения от LP и IEL отсеков, которые основном свободны от загрязнений от других кишечных отсеков. Это широко используется протокол производит высокий урожай лимфоцитов максимально чистой и жизнеспособными в течение приемлемого времени ограничения4,8,9,10,,1112. Этот протокол также обеспечивает изоляцию лимфоцитов из LP и IEL отсека с минимальными загрязнения электрованна, позволяя bona fide возможность изучить лимфоцитов в этих различных отсеках. Изолированные лимфоциты могут быть подвергнуты дальнейшей манипуляции как гранулярных анализа потока или функционального анализа. Этот протокол успешно применяется для изоляции лимфоциты от мыши тонкой кишки и толстой кишки при бактериальных инфекций, таких как Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumи Yersinia pseudotuberculosis инфекций и воспалительных заболеваний таких как химико - и возбудителя индуцированной колит. Этот протокол может использоваться также для изоляции innate иммунных клеток, таких как дендритные клетки, макрофаги, нейтрофилы и моноциты из мыши тонкой кишки и толстой кишки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения и утверждены Стоуни-Брук университета уход для институциональных животных и использования Комитетом.

Примечание: Убедитесь, что все утверждений перед выполнением процедуры.

1. решение подготовка

  1. HGPG (HEPES, L-глютамин, пенициллин/стрептомицина и гентамицина), 100 ×
    1. Смесь 59,6 g HEPES (500 мм окончательный), 14,6 г Л-глютамин (окончательный 200 мм), 1 × 106 U пенициллин (2000 ед/мл окончательный), стрептомицина 1 г (2 мг/мл окончательный) и гентамицин 2,5 мг (5 мкг/мл окончательный). Добавить RPMI 1640 до 500 мл. Отрегулируйте пэ-аш до 7,5 с использованием NaOH (до перестройки, буфер желто оранжевый с pH около 6.0). Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.45 мкм. Алиготе и хранить при температуре-20 ° C до 1 года или на 4 ° C до 1 месяца.
  2. HEPES-бикарбонат буфера, 10 x
    1. Mix 23.8 g HEPES (окончательный 100 мм), 21 g NaHCO3 (окончательный 250 мм) и добавляют воду до 1000 мл. Отрегулируйте pH 7.2 с HCl. фильтр стерилизации с помощью фильтра 0.45 мкм. Хранить при комнатной температуре. Со временем изменяется рН. Подрегулировать рН периодически.
  3. Урожай СМИ (~ 1 бутылка/2 мышей)
    1. 500 мл RPMI 1640 добавьте 25 мл тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (5% окончательный) и 5 мл 100 × HGPG. Хранить до 6 месяцев при 4 ° C.
  4. Dithioerythritol (DTE) решение (40 мл/малого кишечника)
    1. Mix 50 мл 10 × Хэнкс сбалансированного солевого раствора, Ca2+- и+мг2-бесплатно, 50 мл 10 × HEPES-бикарбонат буфер и 50 мл тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (10% окончательного). Добавьте 350 mL H2O и 15,4 мг dithioerythritol/100 мл (окончательный 1 мм). Подготовьте этот свежий перед использованием.
  5. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) раствор (50 мл/малого кишечника)
    1. Mix 50 мл 10 × Хэнкс сбалансированного солевого раствора,+- Ca2и Mg2+-бесплатно с 5 мл 100 × HGPG. Добавьте 445 мл H2O. Добавить 260 мкл 0,5 М ЭДТА/100 мл (окончательный 1,3 мм). Подготовьте этот свежий перед использованием.
  6. Коллагеназы раствор (30 мл/LP)
    1. 500 мл RPMI, добавить 50 мл FBS (10% FBS финал), 5 мл 100 × HPGP, 1 мл 0,5 М MgCl2 (окончательный 1 мм) и 1 мл 0,5 М CaCl2 (окончательный 1 мм). Добавить коллагеназы, тип I (100 ед/мл финал). Подготовьте этот свежий перед использованием.
  7. Плотность градиента (ГД) решения
    1. Подготовка 1 × DG Стоковый раствор путем смешивания 90 мл DG Стоковый раствор (см. Таблицу материалы) с 10 мл 10 × PBS. Держите стерильной при 4 ° C.
    2. Готовят раствор DG 44% (8 мл/IEL, 8 мл/LP), смешивая 44 мл 1 × DG Стоковый раствор и 56 мл RPMI 1640. Подготовьте этот свежий перед использованием.
    3. Готовят раствор DG 67% (5 мл/IEL, 5 мл/LP), смешивая 67 мл 1 × DG Стоковый раствор и 33 мл RPMI 1640. Подготовьте этот свежий перед использованием.

2. изоляция брыжеечных лимфатических узлов, кишечника и Пейера в патчи

  1. Усыпить мыши с использованием двуокиси углерода наркоза и средней шейки матки дислокации. Поместите курсор мыши на его спине и спрей с 70% этиловом спирте. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез средней линии и открыть кожи и брюшной стенки подвергать брюшной полости.
  2. Найдите caecum и использовать щипцы для осторожно потяните caecum. Используйте щипцы для тщательно вправо в тонком кишечнике, подвергая всю цепочку млн, которая совмещена с двоеточием.
    Примечание: Карта верхней брыжеечной лимфатических узлов, цепи и лимфатической дренирования кишечника был ранее изображены13.
  3. Определите нижний узел в цепочке, расположенный ближе всего к слепой кишки. Используйте один набор щипцов для восприятия брыжейка/жир вокруг него и аккуратно удалить цепочке млн от дна к верхней, выщипывание жир от вокруг лимфатических узлов с другой набор щипцов.
  4. Положите цепь млн на бумажным полотенцем, смоченным урожай СМИ. Удалите брыжейка/жира подвижного цепь на башне бумаги и снимая жир с двумя наборами щипцов. Место в холодной урожай СМИ для последующих шагов изоляции млн.
    Примечание: (i) для обработки узлов не рекомендуется. Вместо этого возьмите брыжейка/жир вокруг них. (ii) важно, чтобы удалить столько брыжейка/жир как можно улучшить жизнеспособность клеток.
  5. Вырежьте в тонком кишечнике ниже привратник и выше слепой кишки с помощью ножниц. Вытяните ЖКТ медленно из подвздошной кишки в двенадцатиперстную кишку, используя один набор щипцов при удалении прилагаемый брыжейка/жир, используя другой набор щипцов.
  6. Место кишечника на бумажным полотенцем, смоченным урожай СМИ и дразнить любые оставшиеся брыжейка/жира покинуть с двумя наборами щипцов.
    Примечание: (i) не забудьте удалить столько брыжейка/жир как можно скорее для оптимального клеток урожайность и жизнеспособности. (ii) Держите кишечник, смоченным в этот и следующие шаги путем применения урожай СМИ периодически.
  7. Собирайте, удаляя их из кишечника с изогнутые ножницы патчи Пейера в. Используйте рассечения область или увеличительное стекло при необходимости (для начинающих); Большинство Пейера патчи должны быть видны наметанный глаз. Соберите 5-11 (типичный) Пейера из тонкой кишки. Место Пейера патчи в холодной урожай СМИ для последующих шагов изоляции.
    Примечание: Пейера в патчи малы, главным образом вокруг выпуклости в наружной стенки кишечника напротив линии брыжейка вложения.
  8. Используйте плоскую сторону щипцы и осторожно слайд из двенадцатиперстной кишки к подвздошной кишки высылать содержание фекальных и слизи. Повторите один раз, чтобы удалить большую часть слизи.
    Примечание: Неполное удаление слизи может уменьшить жизнеспособность клеток и выход. Тем не менее не забудьте слайд в кишечнике осторожно, чтобы избежать зачистки ворсинки или повреждения базальной мембраны.
  9. Используйте ножницы штраф с тупым концом на одной точке, вставьте тупой конец в кишечнике и разрезали кишечника продольно от двенадцатиперстной кишки к подвздошной кишки. Боков нарежьте открыл кишки ~ 2 см. Место части кишечника в 50-мл Конические трубки с 25 мл холодной урожай СМИ для последующих шагов изоляции.
    Примечание: Держать ножницы, смоченным СМИ поможет им легко скользить через кишечник.

3. изоляция лимфоцитов от индуктивных сайтов

  1. Изолируйте лимфоциты от млн, нежно отделения через стрейнер ячейки 70 мкм, с использованием плунжера шприц 3 мл. Вымойте клетки ситечко с 5 мл холодного урожай СМИ.
  2. Пелле млн клетки центрифугированием при 400 g × 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодной урожай СМИ. Количество жизнеспособных клеток, с помощью исключения Трипановый синий.
    Примечание: буфера lysis красных кровяных клеток может использоваться для удаления красных кровяных клеток, если кровотечение произошло во время удаления.
  3. Изолируйте лимфоцитов из Пейера, инкубации Пейера в 15 мл конические трубка, содержащая 5 мл подогретую коллагеназы раствора при 37 ° C и 220 об/мин за 30 мин.
  4. Вихрь для 15 s на максимальной скорости и фильтр переваривается ткани и супернатант в 50-мл Конические трубки через стрейнер ячейки 70 мкм. Аккуратно отделить оставшиеся куски ткани, с помощью поршень шприца 3-мл и вымыть клетки ситечко с 5 мл холодного урожай СМИ.
  5. Пелле Peyer патч клетки центрифугированием при 400 g × 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодной урожай СМИ. Количество жизнеспособных клеток, с помощью исключения Трипановый синий.
    Примечание: Пейера патчи изоляция может иметь некоторые загрязняющие lamina propria лимфоцитов и интраэпителиальных лимфоцитов.

4. изоляция интраэпителиальных лимфоцитов из тонкой кишки

  1. Промойте части тонкой кишки три раза с 25 мл холодного урожай СМИ, инвертирование трубки 10 раз, давая части кишечника урегулировать и лить покинуть супернатант.
    Примечание: Куски ткани должен легко поселиться в нижней части трубки. Если они не делают, это признак, что слишком много брыжейка/жира остается прикрепленным или они связаны с пузырек воздуха.
  2. Добавить 20 мл раствора подогретую DTE в 50-мл конические трубка, содержащая кишечника штук и передачи в 50-мл силицированного колбу Эрленмейера содержащий перемешать бар. Движение при 37 ° C и 220 rpm на магнитной мешалкой для 20 мин использовать большой магнит на внешней колбы провести перемешать бар и ткани и решение перенести обратно в 50-мл Конические трубки.
  3. Вихрь трубки на максимум, установка для 10 с передачей супернатант в новой 50 мл Конические трубки через стрейнер ячейки 70 мкм, стараясь держать части ткани в оригинальной трубки. Не выбрасывайте супернатант; супернатант содержит интраэпителиальных лимфоцитов. Пелле клетки центрифугированием при 400 g × 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл холодной урожай СМИ и хранить на льду.
  4. Добавить 20 мл раствора подогретую DTE в 50-мл конические трубка, содержащая кишечника штук и передачи обратно в 50-мл силицированного Эрленмейер колбу, содержащий перемешать бар. Движение при 37 ° C и 220 rpm на магнитной мешалкой для 20 мин использовать большой магнит на внешней колбы провести перемешать бар и ткани и решение перенести обратно в 50-мл Конические трубки.
    Примечание: DTE является восстанавливающего агента, который обогащает интраэпителиальных лимфоцитов.
  5. Вихревой трубе при максимальной настройки для 10 с передачей супернатант через стрейнер ячейки 70 мкм в предыдущем трубка, содержащая клетки от супернатант первого лечения DTE (от шага 4.3).
    Примечание: Оставшиеся части кишечника используются для изоляции лимфоцитов из lamina propria. Контроль качества: Кусок ткани можно удалить и проверить гистологически обеспечить эпителиальные клетки присутствуют и базальной мембраны неповрежденными.
  6. Пелле клетки центрифугированием супернатант в 400 g × 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 8 мл раствора ГД 44% при комнатной температуре (RT).
  7. Передача 8 мл 44% DG решения/ячейку подвеска в 17 мм ø x 100 мм стиле 14-мл полипропиленовые раунд снизу. Подложка с 5 мл раствора DG 67% рт. Центрифуга на 1600 × g 20 мин на RT без использования тормозов.
    Примечание: Может быть предварительно обработанных трубки с бычьим сывороточным чтобы предотвратить прилипание к стенкам трубки клетки.
  8. Обратите внимание, что жизнеспособные клетки образуют группу (Баффи пальто) на 44% до 67% интерфейс, эпителиальные клетки и отмершие клетки находятся в слизистый фильм на верхней части градиента, и красные кровяные клетки находятся в гранулы. Снимите верхний слой градиента к в течение ~ 2 см интерфейса, вакуум-аспирации. Использование пипетки Пастера урожай Баффи пальто на интерфейс и передача их в 50-мл конические трубка, содержащая 40 мл холодной урожай СМИ.
  9. Пелле клетки центрифугированием при 400 g × 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодной урожай СМИ. Количество жизнеспособных клеток, с помощью исключения Трипановый синий.

5. изоляция Lamina Propria лимфоцитов из тонкой кишки

  1. Удаление эпителиальных клеток из кусочков ткани кишечника путем добавления 25 мл раствора подогретую ЭДТА в колбу, содержащая оставшиеся части кишечника. Настой перемешать при 37 ° C и 220 rpm на магнитной мешалкой для 30 min. использовать большой магнит на внешней колбы провести перемешать бар и тщательно удалить супернатант сохраняя кишечника штук в колбу.
    Примечание: (i) ЭДТА-кальция хелатором, что цели кальций зависимые узлы и продвигает отряд клеток кишечного эпителия. (ii супернатант должно быть ясно и могут быть использованы для изоляции IEC по желанию их коллекции.
  2. Повторите шаг 5.1.
    Примечание: Супернатант должна быть менее ясно после этого инкубации. Контроль качества: Кусок ткани можно удалить и гистологически проверены для обеспечения были удалены клеток кишечного эпителия и базальной мембраны неповрежденными. Пример из супернатант может также оцениваться проточной цитометрии для подтверждения что лейкоциты (CD45+ клетки) отсутствуют.
  3. Добавьте 50 мл RT урожай СМИ в колбу. Перемешать кратко, с магнитом. Пусть кишечных штук урегулировать и тщательно удалить супернатант.
    Примечание: Этот шаг обеспечивает удаление ЭДТА до коллагеназы пищеварение, как ЭДТА инактивирует коллагеназы по хелатирующих кальция, что имеет решающее значение для функции коллагеназы.
  4. Добавление флакон 30 мл раствора подогретую коллагеназы и движение кишечника штук при 37 ° C и 220 rpm на магнитной мешалкой для 45 мин.
  5. Передачи усваивается фильтрации через стрейнер 70 мкм клеток ткани и супернатант в 50-мл Конические трубки. Аккуратно отделить оставшиеся куски ткани, используя поршень шприца 3 мл пюре через фильтр. Промойте фильтр с 10 мл холодного урожай СМИ.
  6. Пелле клетки центрифугированием при 400 g × 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 8 мл раствора DG температура 44%.
  7. Передача 8 мл 44% DG решения/ячейку подвеска в 17 мм ø x 100 мм стиле 14-мл полипропиленовые раунд снизу. Подложка с 5 мл раствора DG 67% температуры окружающей среды. Центрифуга градиенты при комнатной температуре и 1600 × g 20 мин с без тормозов.
  8. Удаление жировой слой на вершине с вакуум-аспирацией. Использование пипетки Пастера урожай Баффи пальто на интерфейс и передача в 50-мл конические трубка, содержащая 40 мл холодной урожай СМИ.
  9. Пелле клетки центрифугированием при 400 g × 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодной урожай СМИ. Количество жизнеспособных клеток, с помощью исключения Трипановый синий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематическое представление протокола изображен (рис. 1). Лимфоциты в пределах слизистой кишечника индуктивный и эффекторных сайты отчетливо организуются. Пейера в патчи (PP) и брыжеечных лимфатические узлы (млн.) содержат лимфоциты в хорошо организованной районах Т-клеток и B-клеток фолликулов, тогда как кишечного эпителия содержит лимфоцитов, которые распространяются более диффузно. Propria пластинки (LP) содержит диффузно распределенных лимфоцитов и лимфоцитов, содержащиеся в рамках организованной лимфоидных структур как изолированные лимфоидных фолликулов (ILF) и cryptopatches. Каждый кишечной иммунной отсек также характерна уникальный состав лимфоцитов (рис. 2). МЛН-преимущественно состоит из αβ Т-клеток (~ 70%), в то время как PP лимфоцитов являются главным образом клетки B (~ 80%). LP лимфоцитов композиции во многом зависит от штамма, но главным образом состоит из αβ T-клеток и клеток B. Отличается от других кишечных отсеков, лимфоцитов, проживающих в эпителии в основном γδ Т-клетки (~ 60%) и T-клетки αβ с по существу не B клеток. Различные пропорции αβ Т-клеток подмножеств существуют также в рамках различных анатомических местах кишечника. Αβ T клетки в LP являются главным образом CD4 клеток,+ T (~ 70%), при CD8α+ T в отсеке интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) преобладают клетки (~ 85%). CD8α+ αβ T клетки внутри отсеков LP и IEL Экспресс Антуану CD8αα или гетеродимера CD8αβ, тогда как индуктивного сайта CD8α+ αβ T клетки преимущественно Экспресс гетеродимера CD8αβ (рис. 3). Большинство клеток γδ T в отсеке IEL также выразить CD8α, в то время как γδ T клетки обнаружены в отсутствие млн CD8α (рис. 3). Независимо от обобщений состав лимфоцитов может варьироваться от мыши штаммов и могут стать изменены с возрастом или болезнью. Таким образом тщательный анализ популяций лимфоцитов в слизистой оболочке кишечника в стационарном состоянии должно выполняться в фон штамм, используемых для экспериментальных манипуляций.

Ячейка урожай может сильно варьироваться в зависимости от штамма и возраст мышей и экспериментальных условий используется. Единый, живой клетки может быть подсчитано на Горяева или автоматизированных клеток подсчета машины, с помощью исключения Трипановый синий. Число лимфоцитов рассчитываются как: × количество клеток CD45+ клеток (%) в ворота 3 × лимфоцитов (%) в ворота 4 (рис. 2). Примерно 15 × 106 млн лимфоцитов, 5-10 × 106 PP лимфоцитов, 2-5 × 106 LP лимфоцитов и 3-6 × 106 IEL можно получить от 8 - до 12-недельных наивно C57Bl/6 или Balb/c мыши. В качестве альтернативы на основе потока подсчета бисер может использоваться для количественного определения клеточных популяций с той оговоркой, что потеря клеток происходит во время процесса окрашивания. В конечном счете последовательность в подсчет техника должна поддерживаться в пределах лаборатории, чтобы обеспечить соответствующие сравнения различных экспериментов.

В этом протоколе DTE лечение используется для обогащения IEL, которым следуют ЭДТА лечение для удаления МЭК для оптимального изоляции высокообогащенного лимфоцитов. Два DTE лечения достаточно, чтобы изолировать > 95% IEL. Очень небольшое количество лимфоцитов можно также найти в лечении ЭДТА. Эти лимфоциты напоминают смесь IEL и LP-лимфоцитов (рис. 4). Также проведено сравнение лечения DTE и комбинированного лечения DTE-ЭДТА изолировать IEL. Комбинированное лечение DTE-ЭДТА увеличивает загрязнение IEC в IEL подготовки (рис. 5) и уменьшает окончательный урожайности живой иммунных клеток после плотность градиентного центрифугирования. Плотность градиентного центрифугирования рекомендуется изолировать лимфоцитов из кишечника отсеков. Она удаляет мертвые клетки, многие эпителиальных клеток и слизи, содействия изоляции высокообогащенного лимфоцитов и резко уменьшается проточной цитометрии приобретение раз (рис. 6).

Figure 1
Рисунок 1 . Блок-схема протокола изоляции. DTE, dithioerythritol. ЭДТА, Этилендиаминтетрауксусная кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Проточной цитометрии стробирования стратегия для популяций лимфоцитов от кишечных тканях. Одноячеистый суспензий, приготовленных из верхней брыжеечной лимфатические узлы (млн.), propria пластинки (LP), Peyer патчей (PP) и интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) отсек окрашивали поправимо жизнеспособности краситель (например Live/погибших) и следующие Флуоресцентный обозначенного антитела: CD45 для идентификации гемопоэтических клеток, CD19 для B-клеток, CD3ε для T-клеток, Т-клеточных рецепторов (TCR) β для αβ T-клеток, TCRδ для γδ T-клеток, CD8α для CD8α+ αβ T клетки и CD4 CD4+ αβ T клетки. Ворота 0 показали вперед точечной (FSC) - точечной (SSC) A/сторона - A свойства. Ворота 1 определены отдельные клетки. Ворота 2 определены живой клетки. Ворота 3 определены гемопоэтических клеток. Лимфоциты ворота 4 определены на основе свойств FSC-A/SSC-A. Ворота 5 выявлены Т-клеток и лимфоцитов. Ворота, 6 выявленных αβ T клетки и клетки γδ T среди всего Т-клеток. Ворота 7 определены CD8α+ и CD4+ T-клеток в популяции клеток T αβ. Проценты (в красным цветом) в псевдоцветном участки соответствуют частоте клеток в пределах указанной ворота среди населения предыдущего родительского. Всего событий отображения ворота 0 и 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Фенотип ofCD8α+ αβ T клетки и γδ T клеток в тканях кишечника. Выражение CD8β по CD8α+ αβ T клетки и выражение CD8α клетками γδ T изображены. Проценты (в красным цветом) в пределах гистограммы соответствуют частоте клеток, которые выражают указанный маркер среди населения указанных родительского. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Состав лимфоцитов из DTE, ЭДТА и коллагеназы лечения. Родительский стробирования стратегия является то же самое, как показано на рисунке 2. Ворота 5 выявлены Т-клеток и лимфоцитов. Ворота, 6 выявленных αβ T клетки и клетки γδ T среди всего Т-клеток. Ворота 7 определены CD8α+ и CD4+ T-клеток в популяции клеток T αβ. Проценты (в красным цветом) в псевдоцветном участки соответствуют частоте клеток в пределах указанной ворота среди населения предыдущего родительского. Лимфоциты от ЭДТА изоляции имеют сходство смеси IEL и LP лимфоцитов, изолированные от DTE и коллагеназы лечения, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Сравнение лечения DTE и комбинированного лечения DTE-ЭДТА для изоляции IEL. DTE лечение проводилось согласно настоящему Протоколу. IEL были собраны после лечения DTE и до лечения ЭДТА. Комбинированное лечение DTE-ЭДТА была выполнена в том же концентрациях, используемые в настоящем Протоколе, но в то же время. FSC-A/SSC-A свойства, жизнеспособность и процент CD45+ показаны гемопоэтических клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 . Влияние плотности градиентного центрифугирования на чистоту IEL и LP лимфоцитов препаратов. Одноячеистый суспензий, изолированные согласно протоколу подвергались плотность градиентного центрифугирования или непосредственно анализируемой проточной цитометрии. FSC-A/SSC-A свойства, жизнеспособность и процент CD45+ показаны гемопоэтических клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подробный протокол представляется для изоляции лимфоцитов из кишечной слизистой индукционные (млн и PP) и эффектор (LP и IEL отсека) сайтов. Протокол был разработан чтобы сбалансировать ввод (время) и выходного (жизнеспособности и урожайность) для обеспечения максимальной производительности и результатов. Протокол также обеспечивает минимальный полигамное загрязнения между LP и IEL отсеков.

Несколько протоколов для изоляции иммунных клеток из тонкой кишки мыши были опубликованы3,4,5,6,7. Большинство из этих протоколов сосредоточиться на изоляцию иммунные клетки от LP. Кишечного эпителия — собственный отсек от LP, которая подвержена непосредственному воздействию внешней среды и состоит из уникальный состав лимфоцитов. Недавние подходы стремились более глобальный анализ иммунной функции в кишечнике путем изучения различных кишечных отсеков одновременно, чтобы понимать уникальные аспекты иммунных реакций, происходящих в этих отделениях и отношения между ними. Поэтому желательно надежный протокол для изоляции иммунных клеток от всех этих отсеков. Два DTE лечения достаточно, чтобы изолировать > 95% IEL и некоторые IEC. ЭДТА цели кальций зависимые узлы и является эффективным для отсоединения IEC. Таким образом супернатанта от последующего лечения ЭДТА составляют главным образом IEC. Очень небольшое количество лимфоцитов можно найти в надосадке после ЭДТА терапии; Однако около кратной больше лимфоцитов получаются из фракции DTE. Кроме того, лимфоциты от лечение ЭДТА напоминают смешанных популяций лимфоцитов IEL и LP (рис. 4), которые предлагает LP загрязнения от Вилли и склеп повреждения. Таким образом в настоящем Протоколе, IEL собраны из DTE лечения до начала лечения ЭДТА, максимальной чистоты путем минимизации загрязнения кросс купе. Другие протоколы используют последовательные Дитиотреитол (DTT)-лечение ЭДТА или комбинированного лечения DTT-ЭДТА для изоляции IEL5,6,7. ДТТ является эпимера DTE и оба действуют как восстановителей. В этих протоколах DTT сообщается только удалить слизь и EDTA используется для изоляции IEL. Хотя непосредственно не сравнивали эффект DTT и DTE, оценивалась IEL после лечения DTE или комбинированного лечения DTE-ЭДТА. Не удивительно комбинированного лечения DTE-ЭДТА увеличивает загрязнение IEC в IEL подготовки (рис. 5) и присутствие большого числа IEC снижение урожайности IEL после плотность градиентного центрифугирования. Как ЭДТА может повредить некоторые ворсинки и склепов, комбинированного лечения DTE-ЭДТА может также привести к загрязнению LP лимфоцитов в подготовке IEL или потери LP клеток от изоляции, LP. Кроме того, как > 95% IEL были изолированы от фракции DTE, отдельные процедуры для DTE и ЭДТА являются предпочтительными. Некоторые протоколы изоляции лимфоциты без использования плотность градиентного центрифугирования обогатить иммунные клетки6. Плотность градиентного центрифугирования требует дополнительного времени и может привести к потере некоторых клеток. Однако он удаляет мертвые клетки, клетки эпителия и слизи, ведущих к популяций высокообогащенного лимфоцитов (рис. 6), которая помогает для повышения вероятности обнаружения небольшой популяции клеток и существенно уменьшает время аэросъёмки для потока цитометрии. Плотность градиентного центрифугирования сообщил привести измененное соотношение подмножеств мононуклеарных фагоцитов7; Однако состав лимфоцитов подмножество отображается обычным. Это особенно полезно для выполнения плотность градиентного центрифугирования для изоляции IEL. В целом полный протокол представляется изолировать высокообогащенного и оптимально жизнеспособной лимфоцитов из всех кишечных тканей, включая LP и IEL с минимальными кросс полигамное загрязнения.

Значительное время и уход должны приниматься во время ткани изоляции шаги для ограничения загрязнения между препаратов. Неполное удаление PP может существенно исказить LP лимфоцитов. Юридическая фирма ILF также могут загрязнять LP препаратов. Однако ILF нельзя увидеть невооруженным глазом и поэтому не могут быть удалены хирургическим путем до пищеварение. Штаммы различными мыши имеют разное количество ILF14, которая может в значительной степени способствовать переменного состава LP лимфоцитов между мыши штаммов. При удаление слизи, необходимо аккуратно вставьте в кишечнике, чтобы избежать повреждения базальной мембраны и LP, который может привести к загрязнению LP IEL. Одним из признаков загрязнения является наличие большого числа клеток в IEL подготовки. IEL содержат несколько клетки B (~ 1% или меньше), тогда как LPL может иметь до 60% B клеток в зависимости от штамма мыши. CD19, но не B220 должен использоваться для идентификации клетки B в LP и IEL отсеке, как кишечные Т-клетки могут также выразить B22015. Кроме того многие кишечная Т-клетки могут выразить традиционных макрофагов и DC маркеры например CD11b и CD11c, соответственно16. Таким образом надлежащее дамп стробирования стратегии должны использоваться для обеспечения надлежащего анализа.

Шаги могут быть изменены для удовлетворения потребностей исследователей. Механическая, пищеварение может быть достаточно для PP лимфоцитов изоляции на стационарном или коллагеназы пищеварение лимфатических узлов может способствовать изоляции некоторых подмножеств лейкоцитов во время воспаления. Тип используемых коллагеназы может иметь существенное влияние на клетки поверхности маркер выражения и жизнеспособность и чистоту LP лимфоцитов5,17. ЖКТ может нарезать на мелкие кусочки для переваривания коллагеназы, которые могут повысить урожайность клеток. Однако это также снижает жизнеспособность. Время инкубации с коллагеназы могут быть оптимизированы для максимальной доходности при сведении к минимуму гибели клеток, приводит к максимального восстановления живых клеток. Различные лаборатории использовать слегка разной плотности градиенты для изоляции лимфоцитов. Здесь представлены устоявшихся 44% / 67% плотность градиента протокол. Исследователи могут протестировать различные плотности градиенты, чтобы наилучшим образом удовлетворить их индивидуальные потребности. Если необходимо большее количество лимфоцитов, два тонкий кишечник могут быть объединены для DTE лечение, лечение ЭДТА и коллагеназы пищеварение. Если более двух кишечника необходимы для изучения чрезвычайно редких событий, то рекомендуется, что подвески одной ячейки объединяются после изоляции.

Изолированные лимфоцитов может использоваться для дальнейшего анализа фенотипические, функциональных и геномики. При выполнении анализа гранулярных потока, это весьма желательно, чтобы всегда использовать жизнеспособности красители и антитела анти CD45 исключить мертвые клетки и не гемопоэтических клеток, которые значительно повысит анализа. Если необходимы популяций лимфоцитов чистой, ячейке Сортировка CD45+ клетки вместе с другими маркеры выбора может быть выполнена. Панорамирование на пластины с покрытием анти CD8α может использоваться также для изоляции чистой Т-клетки от IEL подготовки как большинство этих T клетки Экспресс CD8α. Панорамирование или сортировки клеток обычно требуется для культуры IEL как заражение эпителиальных клеток может ингибировать рост IEL. Фидер клетки, такие как наивный splenocytes также могут добавляться содействовать IEL выживания в культуре. Если используются кормушки, важно использовать congenically несоответствие клеток отличить населения. Бактериальное загрязнение редко является проблемой в этих краткосрочных функциональные исследования как СМИ урожай содержит пенициллин, стрептомицин и гентамицина. Кроме того многочисленные шаги стиральные и плотности градиентного центрифугирования удалить большинство бактерий.

Процесс изоляции отнимает много времени и требует баланса ухода, точность и скорость для достижения оптимальных результатов. Достаточно времени должны быть потрачены для обеспечения надлежащего манипуляции каждого шага при минимизации времени между мыши жертву и получения одной ячейки подвеска для максимальной жизнеспособности клеток и урожайность. Это хрупкое равновесие, которое также является узким местом для начинающих, пытаясь получить последовательность в изоляции лимфоцитов с высокой жизнеспособности и урожайность. Весь изоляции процесса, начиная от мыши эвтаназии для получения подсчитанных одноклеточного подвеска принимает опытный исследователь примерно 8 h для 8 мышей. Рекомендуется для получения помощи для более чем 8 мышей обеспечивать высокое качество и воспроизводимость результатов. Важно соблюдать осторожность при сравнении лимфоцитов из этих тканей с лимфоцитов из селезенки, крови или других лимфоидных тканей как обширные инкубаций может привести к искусственного изменения, связанные с процедурой изоляции17. Рутинной сравнения LP и IEL населения к аналогичным образом обработанной лимфоидной ткани будет оценивать ли маркер интерес модулируется в лимфоцитов изоляции от кишечных тканей. Аналогичные проблемы также являются серьезной проблемой при сравнении профилей РНК из кишечника с теми из лимфоидной ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Б.С.Ш поддерживается гранта NIH (R01 AI076457) и средства, предоставленные Университет Стоуни-Брук. Z.Q. поддерживается NIH Грант (K12 GM102778).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Tags

Иммунология выпуск 132 лимфоцитов тонкой кишки брыжеечный лимфатические узлы патчи Пейера в lamina propria интраэпителиальных лимфоцитов проточной цитометрии
Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating… More

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter