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Immunology and Infection

ईमानदार Intravital माइक्रोस्कोपी के लिए Murine अवअधोहनुज लार ग्रंथि की तैयारी

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57283
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

हम शल्य चिकित्सा बेनकाब करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और intravital इमेजिंग के लिए ईमानदार intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर murine अवअधोहनुज लार ग्रंथि को स्थिर. यह प्रोटोकॉल चूहों और अन्य छोटे कुतर के सिर और गर्दन क्षेत्र की अन्य exocrine ग्रंथियों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है ।

Abstract

अवअधोहनुज लार ग्रंथि (एके 47) तीन प्रमुख लार ग्रंथियों में से एक है, और सेल जीव विज्ञान, कैंसर विज्ञान, दंत चिकित्सा, और इम्यूनोलॉजी सहित जैविक अनुसंधान के कई विभिन्न क्षेत्रों के लिए ब्याज की है । एके 47 स्रावी उपकला कोशिकाओं, myofibroblasts, endothelial कोशिकाओं, नसों, और extracellular मैट्रिक्स के शामिल एक exocrine ग्रंथि है । चूहे और एके 47 में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं पहले, ज्यादातर औंधा बहु फोटॉन माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग कर, imaged किया गया है । यहां, हम सर्जिकल तैयारी और anesthetized चूहों में murine 47 के स्थिरीकरण के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन vivo इमेजिंग में के लिए ईमानदार बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ । हम अंतर्जात और adoptively के प्रतिनिधि intravital छवि सेट वर्तमान fibrillar कोलेजन कल्पना करने के लिए रक्त वाहिकाओं या लार नलिकाएं और दूसरी सुरीले पीढ़ी के लेबल सहित फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का तबादला, । संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल आमतौर पर इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में intravital इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जो ईमानदार सूक्ष्म प्रणालियों, में माउस लार ग्रंथियों के सर्जिकल तैयारी के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

लार भोजन को चिकना करने के लिए exocrine ग्रंथियों द्वारा स्रावित किया जाता है, मौखिक पथ की श्लैष्मिक सतहों की रक्षा, और पाचन एंजाइमों के साथ ही रोगाणुरोधी पदार्थ1,2उद्धार । मौखिक उप म्यूकोसा में interspersed मामूली लार ग्रंथियों के अलावा, उनके स्थान1,2के अनुसार, कर्णमूल, मांसल, और अवअधोहनुज के रूप में पहचान की प्रमुख ग्रंथियों के तीन द्विपक्षीय सेट कर रहे हैं । पिरामिड के आकार की उपकला कोशिकाओं, कुप्पी के आकार का sacs (acini) या demilunes है कि myoepithelial कोशिकाओं और एक तहखाने झिल्ली से घिरा हुआ है में आयोजित, लार के तरल और श्लेष्म घटकों स्रावित1. acini के संकीर्ण चमकीले अंतरिक्ष intercalated नलिकाओं में नालियों, जो धारीदार नलिकाओं में एकजुट जब तक वे अंत में एक एकल निकालनेवाला वाहिनी में शामिल होने के1। के मुख्य निकालनेवाला वाहिनी है व्हार्टन वाहिनी (WD) कहा जाता है और उपमांसल रसौली3,4में खुलता है । इस 47 उपकला डिब्बे इसलिए कई गुना टर्मिनल समापन के साथ एक उच्च arborized संरचना का प्रतिनिधित्व करता है, अंगूर1,5,6का एक बंडल जैसी । एके 47 interstitium रक्त और लसीका संयोजी ऊतक में एंबेडेड7 parasympathetic नसों8 और extracellular मैट्रिक्स5युक्त से बना है । सामान्य मानव और मूषक लार ग्रंथियों में भी टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, और वृक्ष कोशिकाओं9, साथ ही प्लाज्मा कोशिकाओं है कि Immunoglobulin एक (IgA) लार में9,10स्रावित होते हैं । स्वास्थ्य और रोग में अपनी बहुमुखी कार्यों के कारण, एके 47 दंत चिकित्सा4, इम्यूनोलॉजी11, कैंसर विज्ञान12, फिजियोलॉजी8, और कोशिका जीवविज्ञान सहित जैविक अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए ब्याज का विषय है 3.

गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं और बातचीत की इमेजिंग जैविक अनुसंधान13,14में एक शक्तिशाली उपकरण है । गहरी ऊतक इमेजिंग और नवाचारों unरैखिक प्रकाशिकी (NLO), जो नमूना द्वारा कई फोटॉनों की कैटरिंग या अवशोषण पर निर्भर के आधार पर सूक्ष्मदर्शी का विकास, सीधे जटिल ऊतकों में सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए अनुमति दी गई है13 ,15. एकाधिक फोटॉनों के अवशोषण कम ऊर्जा फोटॉनों द्वारा कुल उत्तेजना ऊर्जा की डिलीवरी शामिल है, जो fluorophore उत्तेजना फोकल विमान को परिभाषित करता है और इस तरह ध्यान से बाहर से कम धूप और शोर के साथ गहरे ऊतक पैठ की अनुमति देता है उत्तेजना१३,१५. यह सिद्धांत दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी (2) द्वारा कार्यरत है और 1 मिमी15,16तक की गहराई में फ्लोरोसेंट नमूनों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2 setups उपयोगकर्ता के अनुकूल और विश्वसनीय बन गए हैं, intravital इमेजिंग के लिए प्रमुख चुनौती को ध्यान से बेनकाब और anesthetized चूहों के लक्ष्य अंग स्थिर है, विशेष रूप से समय चूक श्रृंखला की इमेजिंग के लिए । डेटा अधिग्रहण के बाद डिजिटल बहाव सुधार के लिए कई तरीकों17,18 प्रकाशित किया गया है और हम हाल ही में विकसित "VivoFollow", एक स्वचालित सुधार प्रणाली है, जो वास्तविक समय में धीमी ऊतक बहाव प्रतिक्रिया का उपयोग कर एक मधून स्टेज१९. हालांकि, यह अभी भी ऊतक गति को कम करने के लिए उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से तेजी से श्वास या दिल की धड़कन की वजह से आंदोलनों19. तैयारी और स्थिरीकरण प्रक्रियाओं रीढ़ की हड्डी20, जिगर21, त्वचा22, फेफड़े23, और लिम्फ नोड24सहित कई अंगों, के लिए प्रकाशित किया गया है । इसके अलावा, चूहे लार ग्रंथि इमेजिंग के लिए मॉडल3,25 विकसित किया गया है और आगे murine के उच्च संकल्प intravital इमेजिंग के लिए परिष्कृत एक औंधा माइक्रोस्कोप सेटअप26के अनुरूप है, 27 , 28.

यहां, हम murine के intravital इमेजिंग के लिए एक व्यावहारिक और अनुकूलनीय प्रोटोकॉल मौजूद ईमानदार रैखिक माइक्रोस्कोप, जो सामांयतः इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में intravital इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग कर । यह अंत करने के लिए, हम एक व्यापक रूप से नियोजित स्थिरीकरण जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया मंच संशोधित ।

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Protocol

सभी पशु काम पशु प्रयोग के लिए गुआंगज़ौ समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और संघीय दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित की ।

1. माउस Anesthetize

  1. लैब कोट और दस्ताने सहित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें ।
  2. मिश्रण ketamine, xylazine, और खारा करने के लिए एक काम एकाग्रता की 20 मिलीग्राम/एमएल और 1 मिलीग्राम/एमएल, क्रमशः । काम शेयर intraperitoneally (आईएफसआई) पर 8-10 µ एल सुई माउस के जी/ माउस को पिंजरे में वापस रखें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए परीक्षण किया गया है 6-४० के लिए सप्ताह पुराने पुरुष और मादा चूहों के साथ एक C57BL/
  3. २.५ मिलीग्राम/एमएल पर acepromazine समाधान तैयार करें और ketamine-xylazine इंजेक्शन (७५ µ g/माउस) के बाद 30 µ l आईएफसआई, 15 min इंजेक्षन करें ।
  4. 5-15 मिनट के बाद, पर्याप्त संज्ञाहरण और सजगता के लिए नियंत्रित करने के द्वारा analgesia के लिए जांच, उदा, पंजा या corneal पलटा की वापसी पलटा ।
  5. प्रयोग की पूरी अवधि के दौरान लगभग हर 30 मिनट सजगता के लिए नियंत्रण । ketamine/xylazine पर १.५ µ एल/माउस के जी, हर ६० मिनट या पहले अगर सजगता सकारात्मक है/
    नोट: isoflurane के रूप में साँस लेना संज्ञाहरण इस प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल नहीं किया जा सकता, माउस के निर्धारण के कारण.

2. ऑपरेटिंग क्षेत्र से फर निकालें

  1. एक बिजली के रेजर का प्रयोग करें एक क्षेत्र है कि मोटे तौर पर सामने पैरों की ओर मुंह के 5 मिमी caudal से फैलता है दाढ़ी, दोनों कानों की ओर जबड़े पर खींच ।
  2. बालों को हटाने क्रीम एक कपास झाड़ू के साथ मुंडा क्षेत्र के लिए लागू करें । ध्यान से और अच्छी तरह से 3 मिनट के बाद निकालने के लिए, उदा, गीले ऊतकों के साथ पोंछते द्वारा.

3. मंच पर माउस को ठीक

नोट: इस प्रोटोकॉल एक स्वनिर्धारित चरण का उपयोग करता है (चित्रा 1) कवर फिसल जाता है के लिए दो स्वतंत्र रूप से समायोज्य धारकों के साथ सुसज्जित (एक पेंच के साथ मंच से जुड़ी, दूसरे पर स्थाई रूप से तय); समायोज्य स्टीरियोटैक्टिक कान सलाखों; एक स्ट्रिंग है, जो एक पेंच के साथ मजबूत किया जा सकता है; एक स्वतंत्र रूप से समायोज्य धातु हीटिंग अंगूठी; और एक उठाया क्षेत्र के लिए माउस के धड़ जगह नामित । इस चरण में एक जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड चरण से संशोधित किया गया है, एक जोड़ा स्टीरियोटैक्टिक धारक और कम कवर स्लिप के लिए एक समर्थन के साथ बाहरी एके 47 पकड़े । विस्तृत योजनाओं या मंच के उद्धरण अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।

  1. हीटिंग रिंग और हटाने योग्य आवरण स्लिप धारक के लिए धारकों को निकाल कर चरण तैयार करें । कान बार धारकों और फिक्स्ड कवर स्लिप धारक के शिकंजा ढीला । टेप चरण के केंद्र क्षेत्र में धुंध का एक टुकड़ा, माउस के लिए बिस्तर के रूप में सेवारत ।
  2. गोंद का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक बेलनाकार धातु धारक के शीर्ष करने के लिए एक 20 मिमी व्यास कवर गिलास संलग्न करने के लिए (यह कम कवर गिलास हो जाएगा). गोंद एक 25 मिमी कवर ग्लास फ्लैट धातु धारक के नीचे करने के लिए (यह ऊपरी आवरण गिलास हो जाएगा) । सुनिश्चित करें कि कवर चश्मा धातु धारकों के साथ लगभग 2-3 mm ओवरलैप और है कि कांच के बाकी तेल और गोंद से मुक्त रहता है ।
  3. धुंध पर अपनी पीठ पर माउस रखें, फैला स्ट्रिंग के लिए सीधा, कान सलाखों के बीच केंद्रित सिर के साथ ।
  4. शल्य टेप के साथ मंच पर माउस के ऊपरी छोर को ठीक करें ।
  5. अगले, ऊपरी सामने कृन्तक में स्ट्रिंग हुक और कस जब तक जबड़े एक क्षैतिज स्थिति तक पहुंचता है । एक angled घुमावदार संदंश का उपयोग करने के लिए थोड़ा मुंह से जीभ बाहर खींच, जो सांस लेने की सुविधा ।
  6. कसकर, लेकिन जबरदस्ती नहीं, पूंछ खींचो और इसे मंच पर टेप करें ।
  7. पट्टी और मंच के किनारे के बीच लगभग 30 डिग्री का एक कोण को प्राप्त करने के लिए कान सलाखों संरेखित करें । इस कोण को सुनिश्चित करने के लिए, एक त्रिकोण शासक का उपयोग करने के लिए एक सही और कागज के एक पत्रक पर 30 ° कोण छोड़ दिया आकर्षित, और कागज पर पारदर्शी मंच जगह धारकों तदनुसार संरेखित करें ।
  8. जबड़े immotile है, और शिकंजा कस जब तक एक साथ छोड़ दिया और सही पट्टी की ओर बढ़ द्वारा कान सलाखों के बीच जबड़े को ठीक करें । छाती आंदोलन से पहले निरीक्षण, के दौरान, और जबड़े फिक्सिंग के बाद । कम या अनुपस्थित श्वास इंगित करता है कि सलाखों गर्दन पर तय कर रहे हैं, नहीं जबड़े की हड्डी; इस स्थिति में, तुरंत फिक्सिंग प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  9. माउस को हीटिंग प्रदान करें, उदा, एक हीटिंग लैंप पास रखकर और/या मंच के नीचे एक हीटिंग पैड ।

4. एक Stereomicroscope का उपयोग लार ग्रंथि के सर्जिकल जोखिम

नोट: निंन चरणों का पालन एक stereomicroscope, ठीक संदंश, और सर्जिकल कैंची के उपयोग की आवश्यकता है । चूंकि प्रक्रिया टर्मिनल है, यह बाँझ ऑपरेटिंग शर्तों को बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं है. इथेनॉल साफ उपकरणों पर्याप्त ।

  1. त्वचा में एक मामूली उभार के लिए लगभग 15 मिमी मुंह के caudal और जबड़े की रेखा के 5 मिमी औसत दर्जे की तलाश द्वारा सही 47 पालि की अनुमानित स्थिति का पता लगाएं । एक छोटी सी त्वचा उभार के केंद्र में गुना लिफ्ट और इसे बनाने के लिए और लगभग 5 मिमी लंबाई के खोलने में कटौती ।
  2. तुरंत एक 4 मिमी कटौती आसपास के त्वचा पर वैक्यूम चर्बी के उच्च अंगूठी लागू होते हैं । (एक वैक्यूम तेल एक कुंद 25 ग्राम hypodermic सुई के साथ सिरिंज भरा) का उपयोग करें ।
  3. ऊतकों को सुनिश्चित करने के लिए खारा के साथ तेल की अंगूठी भरें आपरेशन के दौरान नम रहता है ।
  4. stereomicroscope के तहत, संयोजी ऊतक निंनलिखित प्रक्रिया का उपयोग बाधित: एक ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए दृढ़ता से संयोजी ऊतक का एक टुकड़ा सीधे पकड़, और एक दूसरे संदंश का उपयोग करने के लिए बाहर संयोजी ऊतक खींच जब तक यह टूटना । यह सुनिश्चित करें कि कुछ संयोजी ऊतक 47 से जुड़ा रहता है; यह वांछनीय है क्योंकि यह हैंडलिंग की अनुमति देता है । संदंश के साथ ग्रंथि खुद को छूने मत करो, क्योंकि यह खून बह रहा कारण होगा ।
  5. पहले ग्रंथि के शीर्ष पर संयोजी ऊतक को बाधित करने की इस गति को दोहराएँ, तो औसत दर्जे की ओर (के बीच सही और वाम पालि). अवअधोहनुज ग्रंथि से अलग नहीं है ।
  6. 47 के आसपास पार्श्व संयोजी ऊतक की सुइयों को दूर करने के लिए जारी रखें (औसत दर्जे का caudal करने के लिए, बाहर करने के लिए, rostral के लिए).
  7. यह सुनिश्चित करें कि रक्त की आपूर्ति, efferent लसीका, और लार वाहिनी, जो सभी ग्रंथि के कपाल स्थल पर एक बंडल में स्थित हैं, टूटना नहीं है ।
  8. पार्श्व संयोजी ऊतक बाधित है एक बार, संदंश का उपयोग करने संयोजी ऊपर की caudal अंत से जुड़ी ऊतक खींचने के लिए ए. ए. के caudal अंत लिफ्ट । caudal से शुरू और rostral अंत की ओर बढ़ रही है, एके पालि के नीचे संयोजी ऊतक बाधित ।
  9. जारी रखें जब तक कि 47 के सभी साइटों के लिए संयोजी ऊतक निकाल दिया जाता है (प्रमुख खिला/draining रक्त वाहिकाओं और WD के साथ rostral साइट को छोड़कर) ।

5. ग्रंथि फिक्सिंग

  1. की पुष्टि करें कि तेल की अंगूठी खारा पकड़ है और अधिक से कम 4 मिमी उच्च और लीक नहीं है (४.२ कदम देखें) ।
  2. कम कवर ग्लास स्थापित करें (३.२ कदम देखें) अपनी ऊंचाई समायोज्य धारक के लिए धातु पट्टी संलग्न द्वारा । सुनिश्चित करें कि कवर स्लिप धारक सबसे अधिक स्थिति के लिए समायोजित किया जाता है और जब मंच से जुड़ी तेल की अंगूठी को छूने नहीं है । लगभग ६० डिग्री के एक कोण पर caudal दिशा से माउस को धारक की स्थिति, कवर पर्ची के साथ मोटे तौर पर दो तिहाई (caudal और बाहर भागों उजागर पालि के) को कवर स्लिप के साथ । कवर गिलास कम जब तक यह ग्रंथि के साथ संपर्क बनाता है ।
  3. एक नया खारा जलाशय बनाने के लिए कवर ग्लास के शीर्ष पर तेल की अंगूठी को पूरा करें ।
  4. ध्यान से संदंश के साथ कवर पर्ची के शीर्ष पर 47 पालि खींच, केवल संयोजी ऊतक इसे से जुड़े छू (अंग ऊपर की ओर का सामना करना पड़ नीचे साइट के साथ फ़्लिप किया जा सकता है) ।
  5. सुनिश्चित करें कि तेल की अंगूठी की एक भी ऊंचाई से कम 4 मिमी है और रिसाव नहीं है । यदि आवश्यक हो, खारा से भरा एक 30 ग्राम सिरिंज का उपयोग कर खारा जलाशय फिर से भरना ।
  6. यह सुनिश्चित करें कि ऊपरी आवरण कांच के लिए कवर ग्लास धारक अपनी सबसे अधिक स्थिति में है । पेंच का प्रयोग करें धारक को 25 मिमी ऊपरी कवर गिलास के साथ धातु धारक संलग्न करने के लिए । एके 47 के बीच में केंद्रित है ताकि कवर ग्लास की स्थिति के लिए धारक के समायोज्य शिकंजा का प्रयोग करें ।
  7. शीर्ष कवर ग्लास कम करने के लिए समायोज्य धारक के शिकंजा का प्रयोग करें जब तक यह सीधे 47 संपर्क । इस चरण के दौरान ग्रंथि के आकार और रंग का निरीक्षण करें । यदि ग्रंथि की सतह क्षेत्र बड़ा दिखाई देता है, या रंग परिवर्तन (उदाहरण के लिए गुलाबी से सफेद), तुरंत एक उच्च स्थिति के लिए कवर गिलास डाल करने के लिए एके 47 पर दबाव को राहत देने के ।
  8. हवा के बुलबुले और जलाशय के बाहर खारा की बूंदों की तलाश के द्वारा लीक के लिए खारा जलाशय की जांच करें । एक रिसाव या हवा बुलबुला का पता चला है, दोनों कवर फिसल जाता है और सभी तेल निकालें और चरण 2 से पुनः आरंभ.
  9. पेंच सभी निर्धारण शिकंजा बंद ।

6. हीटिंग की अंगूठी और तापमान जांच फिक्सिंग

  1. जलाशय में एक तापमान जांच डालें और यह ग्रंथि के करीब स्थिति है, तो मंच के लिए जांच तार टेप ।
  2. शीर्ष कवर पर्ची के लिए एक तेल की अंगूठी लागू करें, केंद्र में एके के साथ (तेल की अंगूठी के व्यास हीटिंग अंगूठी के व्यास के अनुरूप होना चाहिए) । कवर स्लिप और तेल के साथ सील के शीर्ष पर हीटिंग अंगूठी की स्थिति । टेप हीटिंग रिंग की टयूबिंग मंच के लिए ।

7. इमेजिंग

नोट: हम एक स्वरित्र ती: Sa लेजर और जल विसर्जन 20X या 25X उद्देश्यों के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित एक ईमानदार दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग करें । अधिग्रहण के दौरान ऊतक बहाव के वास्तविक समय सुधार एक स्वचालित चरण का उपयोग करके लागू किया जा सकता है और19VivoFollow । यह छवि प्राप्ति की स्थिरता में सुधार करता है, लेकिन आवश्यक नहीं है ।

  1. खुर्दबीन निर्माता द्वारा प्रदान की एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ईमानदार माइक्रोस्कोप प्रणाली पर बारी. धुन तिवारी: Sa लेजर 780-900 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए ।
  2. हीटिंग की अंगूठी के लिए हीटिंग टयूबिंग कनेक्ट । एक सिकुड़नेवाला पानी पंप गर्म पानी प्रसारित (एक 80 ° c पानी के स्नान में ट्यूबिंग के भाग को विलय द्वारा गर्म) के लिए इस अंगूठी के माध्यम से एके 47 को गर्म ।
  3. एक डिजिटल थर्मामीटर के लिए तापमान की जांच से कनेक्ट करें । तापमान 35-39 डिग्री सेल्सियस के बीच नहीं है, तो सिकुड़नेवाला पंप की गति को समायोजित करें । तेजी से पंप काम करता है, गर्म वस्तु हो जाता है, और इसके विपरीत ।
  4. छवि प्राप्ति शुरू करने से पहले, रक्त प्रवाह वेग का एक दृश्य नियंत्रण करते हैं । ध्यान से पतली केशिकाओं के माध्यम से या फ्लोरोसेंट dextran इंजेक्शन द्वारा ल्युकोसैट बीतने की जांच करें ।
    नोट: नसों में फ्लोरोसेंट dextran इंजेक्शन तुरंत बाहर पूरे एके vasculature भर जाएगा जब रक्त प्रवाह शारीरिक है । यह वस्तुतः इस प्रक्रिया में हमेशा मामला है ।
  5. प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पालन करने के लिए, इमेजिंग गहराई विशेष रूप से 2एन डी हार्मोनिक उत्पादन संकेत द्वारा की पहचान की सतह के नीचे 20-150 µm के बीच है । रिकॉर्ड छवि के ढेर के 150-300 µm पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ दृश्य के फ़ील्ड लगभग ५१२ x ५१२ या उच्च और z-गहराई 20-60 µm की रिक्ति के साथ छवियों के बीच 2-4 µm की । दोहराएं ढेर अधिग्रहण 20-60 मिनट की कुल अवधि के लिए हर 20-30 एस ।
  6. एक छवि अनुक्रम के अधिग्रहण के बाद न्यूनतम और अधिकतम तापमान के स्तर को नियंत्रित करने के लिए डिजिटल थर्मामीटर का प्रयोग करें । यदि न्यूनतम या अधिकतम ३७ ± 2 ° c की श्रेणी में नहीं हैं, तो छवि अनुक्रम छोड़ें । छवि दृश्यों के बीच उद्देश्य के विसर्जन के लिए पानी फिर से भरना ।
  7. इमेजिंग सत्र के अंत में, संज्ञाहरण के तहत सह2 asphyxiation द्वारा चूहों euthanize ।
    नोट: यह पशु प्रयोग के स्विस संघीय दिशा निर्देशों के अनुसार है; इच्छामृत्यु के लिए अन्य दिशानिर्देश कहीं और लागू हो सकते हैं ।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल लगभग पूरे पृष्ठीय या ventral की इमेजिंग की अनुमति देता है । देखने के क्षेत्र में आम तौर पर भी शामिल है मांसल लार ग्रंथि, जो सेलुलर रचना4में एके 47 से थोड़ा अलग है । दोनों ग्रंथियों fibrillar कोलेजन द्वारा समझाया और पालियों में विभाजित कर रहे हैं । 2 अधिकांश प्रणालियों के एक लेबल का उत्पादन कर सकते है मुक्त fibrillar कोलेजन की छवि को मापने के द्वारा दोएन डी हार्मोनिक संकेत है, लेकिन आमतौर पर फ्लोरोसेंट अणुओं सेलुलर और सेलुलर संरचनाओं के दृश्य के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, 2nd हार्मोनिक सिग्नल के साथ संयोजन में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की सर्वव्यापी ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति अपने रूपात्मक सुविधाओं द्वारा acini, नलिकाओं, और एके 47 में रक्त वाहिकाओं की पहचान करने के लिए पर्याप्त है । इस सेटअप के लिए विशिष्ट सेल सबसेट की पहचान के लिए सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट मार्करों का निरीक्षण किया जा सकता है । चित्रा 2 एक नेटवर्क ofCOL1A1-GFP रिपोर्टर-व्यक्त fibroblast संयोजी ऊतक की तरह कोशिकाओं को दर्शाता है । यह भी दिखाया रक्त वाहिकाओं हैं, उच्च आणविक वजन dextran के लिए युग्मित एक फ्लोरोसेंट डाई की नसों में इंजेक्शन द्वारा लेबल । नलिकाओं के चमकीले डिब्बे को भी लेबल किया जा सकता है (चित्रा 3) जब डाई29WD में retrogradually इंजेक्शन है ।

Figure 1
चित्र 1 : अनुकूलित चरण. (एक और एक *) कवर के लिए दो स्वतंत्र रूप से समायोज्य धारकों फिसल जाता है; (बी और बी *) समायोज्य स्टीरियोटैक्टिक कान सलाखों; (ग) एक तार, जिसे एक पेंच से कस दिया जा सकता है; (घ) एक स्वतंत्र रूप से समायोज्य धातु हीटिंग अंगूठी; (ङ) उठाया क्षेत्र के लिए माउस के धड़ जगह नामित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Vasculature मार्कर (लाल) और COL1A1-GFP एक्सप्रेस कोशिकाओं (हरा) के नेटवर्क। Vasculature टेक्सास रेड-dextran संयुग्मी (मेगावाट ७० केडीए) की नसों में इंजेक्शन द्वारा लेबल । दो पालियों के बीच में Fibrillar कोलेजन 2एनडी हार्मोनिक संकेत (नीला) के रूप में visualized है । दिखाया गया है एक z-४७ µm गहराई के साथ 15 खड़ी छवियों का प्रक्षेपण । स्केल बार = ४० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : चमकदार वाहिनी WD इंजेक्शन के बाद लेबल । ७० केडीए के साथ लेबल रक्त वाहिकाओं-मेगावाट टेक्सास लाल-dextran (लाल), डक्ट लुमेन के साथ लेबलित झरना नीला-dextran (सफेद; 10 केडीए मेगावाट) के माध्यम से प्रतिगामी इंजेक्शन के माध्यम से WD और adoptively हस्तांतरित GFP+ सीडी 8 + टी कोशिकाओं (हरा) में 47. दिखाया गया है एक z-५० µm गहराई के साथ 27 स्टैक्ड छवियों का प्रक्षेपण । स्केल बार = ४० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल अक्सर इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में इस्तेमाल किया ईमानदार गैर रेखीय माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर murine अवअधोहनुज और मांसल लार ग्रंथियों के vivo इमेजिंग में के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता है. विधि सिर और गर्दन क्षेत्र में अन्य exocrine ग्रंथियों के इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला अश्रु ग्रंथि की इमेजिंग एक अनुरूप तरीके से प्रदर्शन किया है (नहीं दिखाया गया है) ।

इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है, के बाद से लगभग 47 के संयोजी ऊतक हटाने, आकस्मिक ऊतक क्षति हो सकती है । एके 47 के मुख्य रक्त की आपूर्ति को नुकसान आवश्यक तत्काल प्रयोग की समाप्ति, के बाद से एके 47 के ऊतकों hypoxic हो जाएगा । यदि एके 47 ऊतक ही क्षतिग्रस्त है, खून बह रहा है स्वाभाविक रूप से जमावट से रोकता है । हालांकि, यह माना जाता है कि चोट बाँझ सूजन और भड़काऊ साइटोकिंस जारी30, जो प्रयोगात्मक readout को प्रभावित कर सकता है की जरूरत है । एक अधिक आम है, लेकिन microsurgery के दौरान कम महत्वपूर्ण जटिलता खारा जलाशय में लीक कर रहे हैं । लीक की घटना को कम करने के लिए, हमेशा सूखी, गंजा त्वचा के लिए तेल लागू होते हैं । एक रिसाव समझौता आमतौर पर व्यर्थ है: इसके बजाय, तेल के सभी निकालें, एक सूखी कपास झाड़ू के साथ त्वचा को साफ, और खरोंच से फिर से लागू ।

इमेजिंग के दौरान, एक तापमान शारीरिक शरीर के तापमान के करीब बनाए रखा जाना चाहिए (लगभग ३७ ° c पुरुष और महिला C567BL/6 चूहों के लिए31) । के बाद से दोनों hypo-और अतिताप परिवर्तन रक्त प्रवाह३२,३३, 47 के शारीरिक समारोह उन शर्तों के तहत ग्रहण नहीं किया जा सकता है । हालांकि, हमने छोटे (± 2 ° c) के दौरान रक्त प्रवाह या टी सेल गतिशीलता में कोई अंतर नहीं देखा, इष्टतम तापमान से परिवर्तनीय (< 5 min) विचलन ।

न्यूनतम ऊतक आंदोलन अच्छी इमेजिंग गुणवत्ता के लिए आवश्यक है । अवांछित ऊतक गति के विभिंन प्रकार हो सकता है, और सामांय कारण है कि समस्या निवारण से गुजरना कर सकते हैं । सबसे पहले, निरंतर xyz-बहाव आमतौर पर के कारण होता है कि धीरे से संलग्न संयोजी ऊतक के माध्यम से अपनी मूल स्थिति में वापस बहती । यह होता है अगर कम कवर गिलास बहुत अधिक स्थापित किया गया था, या 47 के आसपास संयोजी ऊतक अच्छी तरह से बाधित नहीं किया गया था । दूसरे, धीमी और निरंतर z-बहाव हो सकता है अगर तापमान अस्थिर है । इस मामले में ध्यान से हीटिंग समायोजित करें और तापमान स्थिर होने के लिए प्रतीक्षा करें, इमेजिंग से पहले लगभग 15 मिनट । अंत में, pulsating ऊतक गति होता है जब खारा चैंबर कसकर सील नहीं है । दबाव बनाता है और हर श्वास चक्र के साथ खारा चैंबर में रिलीज । लीक या हवा के बुलबुले के साथ संयोजन में इस pulsating द्रव प्रवाह है, जो सीधे एके 47 के ऊतकों को अनुवाद करने के लिए सुराग । इस मामले में, दोनों को कवर चश्मा और खारा चैंबर के विधानसभा सबसे विश्वसनीय समाधान है ।

अधिकतम इमेजिंग गहराई उत्तेजना तरंग दैर्ध्य इस्तेमाल किया और fluorophores कार्यरत पर निर्भर करता है । लगभग सभी intravital इमेजिंग setups में के रूप में, लाल रंग या फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि लंबी तरंग दैर्ध्य (900-1100 एनएम) के साथ उत्साहित किया जा सकता है हरे रंगों और छोटे उत्तेजना तरंग दैर्ध्य से गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं ।

एके 47 इंडो के लिए मॉडल अंग के रूप में इस्तेमाल किया गया है और exocytosis और झिल्ली remodeling3,27,28, संक्रमण३४, प्रतिरक्षा11, और ट्यूमर जीव विज्ञान12। यह आगे हेरफेर के कई रूपों परमिट: रंजक, औषधीय यौगिकों, और एंटीबॉडी रक्त प्रवाह के माध्यम से ग्रंथि को दिया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एके 47 WD, जो वायरस11, dextrans3, डीएनए25, रंजक29, या औषधीय एजेंटों3उद्धार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है की cannulation के माध्यम से सीधे निशाना बनाया जा सकता है ।

intravital इमेजिंग क्षेत्र आनुवंशिक और जैव रासायनिक फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक की एक बढ़ती toolbox से लाभ के लिए जारी है । आनुवंशिक इंजीनियरिंग में अग्रिमों माउस लाइनों और परिष्कृत फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ सेल लाइनों प्रदान करते हैं । हाल के उदाहरणों में विशिष्ट कक्ष उपसमुच्चयों (CD11c+ कक्ष३५) या डायनामिक cytoskeletal प्रोटीन्स (Lifeact३६), सेल ट्रैकिंग ३७के लिए photoconvertible मार्कर, और परमाणु के रीयल-टाइम रिपोर्टर के लेबल शामिल हैं translocation (NFAT३८) या कॅल्शियम सिग्नलिंग३९. अन्य अनुप्रयोगों फ्लोरोसेंट जैव रासायनिक जांच का उपयोग कर सकते हैं, जो विशिष्ट उपसेलुलर डिब्बों पर प्रकाश डाला (जैसे कि डीएनए बाइंडिंग 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) या lipophilic झिल्ली रंजक). आधुनिक NLO माइक्रोस्कोपी कई संभव समाधान प्रदान करता है प्रयोगात्मक प्रश्नों का सबसे अच्छा जवाब । मसलन, मल्टीप्लेक्स्ड दो-फोटॉन इमेजिंग को अधिकतम अधिग्रहण की गति४०को दृढ़ता से बढ़ाने के लिए विकसित किया गया है । अन्य तकनीकों की पेशकश लेबल मुक्त multiphoton इमेजिंग, या तो दूसरे या तीसरे हार्मोनिक संकेतों के उत्पादन के द्वारा15, या अणुओं की विशेषता अनुनाद कंपन को मापने के द्वारा (सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन कैटरिंग)४१. इस प्रकार, जब ऊतक जोखिम और स्थिरीकरण के लिए व्यवहार्य प्रक्रियाओं उपलब्ध हैं, प्रयोगात्मक डिजाइन की सीमा ज्यादातर प्रयोगकर्ता के संसाधनों और रचनात्मकता द्वारा निर्धारित कर रहे हैं ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

यह काम स्विस नेशनल फाउंडेशन (SNF) परियोजना अनुदान 31003A_135649, 31003A_153457 और 31003A_172994 (JVS करने के लिए), और Leopoldina फैलोशिप LPDS 2011-16 (बी एस) द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह काम बर्न् स विश्वविद्यालय के "माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सेंटर" (एमआईसी) के ऑप्टिकल setups से लाभांवित हुआ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

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Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

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