Summary
手術を公開し、直立した生体顕微鏡を用いた生体イメージングのマウス顎下腺唾液腺を安定させるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、頭部および頸部マウスの他の小さい齧歯動物の他の外分泌腺に容易に適応です。
Abstract
顎下腺の唾液腺 (SMG) は、生物学的研究、細胞生物学、腫瘍学、歯科学、免疫学などの様々 な分野の関心の 3 つの大唾液腺の一つです。SMG は外分泌腺の分泌の上皮細胞、芽、血管内皮細胞、神経、細胞外マトリックスで構成されています。ラット、マウス SMG の動的な細胞プロセス イメージが以前作成された、逆多光子顕微鏡システムを用いた主。ここでは、直立した多光子顕微鏡システムを生体内イメージングのための麻酔下のマウスのマウスの SMG の安定化と手術の準備のための簡単なプロトコルについて述べる。我々 は内因性の代表的な生体画像セットを提示し、に対して転送蛍光細胞、血管や唾液管フィブリル型コラーゲンを視覚化する第 2 高調波発生のラベルを含みます。合計では、私達のプロトコルは生体イメージング免疫学の分野でよく使用される正立顕微鏡システムでマウス唾液腺の手術準備のためことができます。
Introduction
唾液は消化酵素として抗菌物質1,2を提供する食品を注油、口腔管の粘膜の表面を保護する外分泌腺から分泌されます。口腔粘膜に散在の小唾液腺、に加えて、位置1,2によると主要な腺、舌下腺, 顎下腺, 耳下腺, として識別の 3 つの両側セットがあります。ピラミッド状の上皮細胞がフラスコ状嚢 (腺) に編成または筋上皮細胞と基底膜に囲まれた demilunes 唾1の漿液性と粘液の成分を分泌します。彼らは最終的に単一の排泄ダクト1に参加するまで横紋筋性ダクトに結合する介在部に腺下水管の狭い内腔領域。SMG の主排泄管ウォートンのダクト (WD) と舌下涙丘3,4に表示されます。SMG 上皮区画は、したがって、マニホールド ターミナル エンドポイント、ブドウ1,5,6のバンドルに似た高い葉状構造を表します。SMG 間質は、副交感神経神経8と細胞外マトリックス5を含む結合組織7に埋め込まれた血液やリンパ容器で構成されます。通常の人間と齧歯動物の唾液腺には、T 細胞、マクロファージ、樹状細胞9と同様、免疫グロブリンを分泌する形質細胞 (伊賀) 唾9,10にも含まれます。健康と病気、その多面的な機能のため、SMG は生物学的研究、細胞生物学、生理学8、腫瘍12免疫11歯科4などの多くの分野の関心の対象3。
細胞の動的過程と相互作用のイメージングは、生物学研究13,14の強力なツールです。複雑な組織13 の細胞プロセスを直接調べるの深部組織イメージングと革新的な inmicroscopes 非線形光学 (固定) に基づく、散乱またはサンプルによって複数の光子の吸収を利用する開発ができました、15。複数の光子の吸収低エネルギー光子、焦点面にどの範囲蛍光励起によって合計励起エネルギーの配信を含みより深い組織浸透還元生成やフォーカスの外からのノイズをできるように励起13,15。この原則は 2 光子励起顕微鏡 (14) で採用されている、まで 1 mm15,16の深さにおける蛍光試料のイメージングできます。市販 14 ユーザーフレンドリーかつ信頼性の高い設定となっている、生体イメージングのための主要な挑戦は慎重に公開し、イメージング時系列経過のため特に麻酔下マウスの臓器を安定させます。デジタル ドリフト補正データ集録後のいくつかのメソッド公開17,18と我々 は最近"VivoFollow"、リアルタイムを使用して遅い組織ドリフトを打ち消す自動補正システムを開発、コンピューター化されたステージ19。ただし、まだ高画質化組織運動、呼吸や鼓動19によって引き起こされる特に高速な動きを最小限に抑えるために重要です。準備および安定化の手順は、脊髄20、肝21、皮膚22、23肺リンパ節24など、複数の臓器に発行されています。さらに、ラット唾液腺イメージングのためのモデル開発3,25をされているし、さらに洗練された高解像度 SMG に合わせて、倒立顕微鏡セットアップ26,マウスの生体イメージング27,28。
ここでは、免疫学の分野で生体イメージングに用いられる直立非線形顕微鏡を用いたしてマウス SMG の生体イメージングのための実用的かつ適応プロトコルを提示します。このため、膝窩リンパ節の準備に使用される広く使用されている固定ステージを変更しました。
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Protocol
すべての動物の仕事を動物実験のための州委員会によって承認されており、連邦政府のガイドラインに従って実施します。
1. マウスを麻酔します。
- 白衣、手袋など保護具を着用します。
- ケタミン、キシラジンと作業濃度 20 mg/mL と 1 mg/mL の生理食塩水をそれぞれ混ぜます。在庫を腹腔内注入 (i. p.) 8-10 μ L/マウスの g で。ケージに戻るには、マウスを置きます。
注: このプロトコルは、C57BL/6 背景を持つ 6-40 週齢の雌雄マウスのテストされています。 - 2.5 mg/ml アセプロマジン ソリューションを準備し、30 μ L i. p.、(75 μ g/マウス) ケタミン ・ キシラジン投与後 15 分を注入します。
- 5-15 分後に、、反射など足や角膜反射の逃避反射を制御することにより十分な麻酔と鎮痛を確認します。
- 実験の全体の持続期間の間約 30 分毎に制御反射します。ケタミン ・ キシラジンを皮下注入 1.5 μ L/g マウス、すべて 60 分またはそれ以前の場合、反射は正。
注: イソフルランなどの吸入麻酔はマウスの固定のため、このプロトコルでは使用できません。
2. 動作領域から毛皮を削除します。
- 約 5 mm 両方の耳に向かって顎伸びる前足に向かって口の尾から展開された領域を剃る電気かみそりを使用します。
- 脱毛クリームを綿棒で剃毛エリアに適用されます。慎重かつ徹底的にウェットティッシュで拭くことによって、例えば、3 分後削除します。
3 段階のマウスを修正します。
注: このプロトコルを使用して、カバー スリップ (ネジでステージに 1 つ、上に完全に固定された他) の 2 つの自由に調節可能なホルダーを備えたカスタマイズされたステージ (図 1)調節可能な定位イヤバーねじで締めることができる文字列自由に調節可能な金属製のリングを加熱マウスの胴体を配置する上げられた区域。この段階は、追加された定位ホルダーと外在化した SMG を押し下のカバー スリップのサポート膝窩リンパ節段階から変更されます。詳細な計画やステージの引用符のリクエストも承ります。
- 加熱リング用ホルダー、取り外し可能なカバー スリップ ホルダーを外してステージを準備します。耳バー ホルダー ・固定カバー スリップ ホルダーのネジを緩めます。マウスのための寝具として、ステージの中央の領域に新しいガーゼをテープします。
- 接着剤を使用 (材料の表を参照) (下のカバーガラスになります) 円筒金属ホルダーの上部に 20 mm 直径のカバーガラスを添付します。(上のカバーガラスになります) 平らな金属ホルダーの下に 25 mm カバーガラスを接着します。金属ホルダーと約 2-3 mm をカバー メガネに重複のグリースや接着剤、ガラスの残りの部分が空いてを確認します。
- 耳バー間の中央に頭をガーゼ、弦に対して垂直に背中にマウスを配置します。
- サージカル テープでステージ上にマウスの上肢を修正します。
- 次に、文字列をフック フロント上顎、顎は水平位置までを締めます。少し呼吸を容易に口から舌を抜くカーブ鉗子を使用します。
- しっかりと、しかし、強制的に、しっぽを引っ張るし、ステージにテープします。
- バーとステージの端の間約 30 ° の角度を達成するために耳のバーを配置します。この角度を確保するため、三角定規を使用して、紙のシート上左右 30 ° の角度で描画してそれに応じて所有者に合わせて紙の上に透明な段階を置きます。
- 顎は運動となるまで同時に左と右のバーを移動することによって耳バーの間顎を修正し、ネジを締めます。前に、中と顎を固定した後、胸の動きを観察します。減少または呼吸欠席バーがない顎の骨に、首で固定されることを示します。この場合、すぐに固定の手順を繰り返します。
- マウスには、例えば、近くに暖房ランプおよび/または下にステージ加熱パッドを配置することによって暖房を提供します。
4. 手術手技、顕微鏡を使用して唾液腺の
メモ: 次の手順は、実体顕微鏡、微細鉗子、手術用はさみの使用を必要。手順は端末なので、滅菌の動作状態を維持する必要はありません。エタノール洗浄器で十分です。
- 約 15 mm の口とあごのラインの 5 mm 内側の尾の皮膚にわずかな膨らみを探して右の SMG 葉のおおよその位置を検索します。膨らみの中心に小さな皮膚のひだを持ち上げ、それを作成して約 5 mm の開口部をカットします。
- すぐにカットを周囲の皮膚に真空用グリースの 4 mm 高リングを適用します。(鈍化 25 G 注射針による真空グリース充填注射器を使用)。
- 組織の操作中に湿ったまま確保するため生理食塩水でグリース リングを入力します。
- 次の手順を使用して結合組織を妨害、実体顕微鏡下で: SMG に直接接続されている結合組織の部分をしっかりと持つこと 1 つの微細鉗子を使用し、それが破裂するまで遠位の結合組織をプルする 2 番目の鉗子を使用します。いくつかの結合組織の SMG に接続されているを確保します。それは処理を可能にするので、これが望ましいです。これは出血を引き起こすので、鉗子で腺自体を触れないでください。
- 腺上に、内側 (SMG の右と左葉) の間の結合組織をまず中断のこの動きを繰り返します。舌下腺は、顎下腺から分離しません。
- 横方向の結合組織 (吻側への遠位に、尾の内側) の SMG の反時計回りの削除を続行します。
- 血液供給、遠心性リンパ管、唾液管腺の頭蓋のサイトの束にあるすべてはない破裂したことを確認します。
- 外側の結合組織を破壊すると、一度は、SMG の尾の端を持ち上げて上方向に SMG の尾側に付着した結合組織をプルするのに鉗子を使用します。SMG の葉の下の結合組織を混乱させる、尾から始まって、吻側端に向かって移動します。
- (主な供給/排出血管と WD 吻側のサイトを除く) SMG のすべてのサイトに結合組織が削除されるまで続行します。
5. 腺を修正
- 生理食塩水を保持しているグリース リングが少なくとも 4 mm 高く、そして、漏れ (手順 4.2 を参照) であることを確認します。
- 下部カバー ガラス (3.2 を参照) インストールと高さ調節可能なホルダーの金属製のバーを接続することによって。カバー スリップ ホルダーを最大限の位置調整、グリース リング ステージにアタッチしたときに触れないことを確認します。カバー スリップ カバー約 3 分の 2 (尾と遠位部分) 露出の葉とマウスに約 60 ° の角度で尾側方向からホルダーを配置します。それまでカバー ガラスを下げる腺との接触します。
- 新しい生理食塩水の貯水池を形成するカバーガラスの上にグリース リングを完了します。
- それに付着した結合組織に触れるだけ、鉗子、カバー スリップの上に SMG 葉を慎重に引き出します (器官は上を向いて下サイトに反転ことができます)。
- グリース リングも高さは 4 mm 以上、漏れていないことを確認します。必要に応じて、リフィル シリンジ 30 G を用いた生理食塩水の貯留層は、生理食塩水でいっぱい。
- 上部カバー ガラス カバー ガラス ホルダーがその最大限の位置にあることを確認します。ネジを使用してホルダー 25 mm 上部カバー ガラスとメタル ホルダーを取り付けます。途中で SMG を中心に配置するには、カバー ガラス ホルダーの調節ネジを使用します。
- SMG は、直接接触するまでトップ カバー ガラスを下げる調節可能なホルダーのネジを使用します。形状とこの手順中に腺の色を確認します。腺の表面積が大きく、表示されますやカラーリング変更 (例えばから白にピンク)、すぐに場合は、SMG の上の圧力を緩和するために高い位置にカバーガラスを置きます。
- タンク外生理食塩水の滴や、空気の泡をお探ししてリークを生理食塩水の貯水池を確認します。漏れや空気の泡が検出された場合を削除カバー スリップとすべてのグリースし、手順 2 から再開します。
- ネジは、すべての固定ネジをシャット ダウンします。
6. 加熱リング、温度プローブの固定
- 貯水池の温度プローブの挿入し腺の近くに位置し、ステージにプローブのワイヤーをテープします。
- (グリース リングの直径は加熱リングの直径に対応する必要があります) センターで SMG とトップのカバー スリップにグリース リングを適用します。カバー スリップの上に加熱リングを置き、グリースでシールします。ステージに加熱リングのチューブをテープします。
7. イメージング
注: 我々 は波長可変 Ti:Sa レーザと水浸漬 20 X、25 X 目標と蛍光顕微鏡を備えた直立二光子励起顕微鏡システムを使用します。集録中に組織のドリフトのリアルタイム補正は、自動ステージと VivoFollow19を使用して実装できます。これは画像取得の安定性の向上が必須ではありません。
- 顕微鏡メーカーによって提供される適切なソフトウェアを使用して直立した顕微鏡システムを入れます。Ti:Sa レーザー 780-900 nm の励起波長を調整します。
- 加熱管を加熱リングに接続します。蠕動ポンプは、SMG を暖かくリングをお湯 (80 ° C の水浴のチューブの一部を水没によって加熱) を循環します。
- デジタル温度計には、温度プローブを接続します。温度は 35-39 ° c. の間にない場合、蠕動運動型ポンプの速度を調整します。ポンプの高速動作、オブジェクトを取得しますが暖かい、およびその逆。
- 画像の取得を開始する前に血流速のビジュアル コントロールを実行します。細い毛細血管や蛍光デキストラン注入による白血球の通路を入念にチェックします。
注: 血流が生理学的な静脈内注入蛍光デキストランは全体の SMG 血管を記入すぐに。これは事実上常にこの手順の場合です。 - 免疫細胞に従う、イメージング深さは通常 2nd高調波発生信号によって識別される SMG の表面の下 20-150 μ m の間。約 512 x 512 以上のピクセルの解像度で 150-300 μ m の視野の記録画像のスタックと画像間の 2-4 μ m の間隔で 20-60 μ m の z-深さ。20-60 分の合計時間に対してスタックの取得すべての 20-30 秒を繰り返します。
- デジタル温度計を使用して、1 つのイメージ シーケンスの取得後最小値と最大温度レベルを制御します。最小値または最大値が 37 ± の範囲にない場合は、イメージ シーケンスを破棄 2 ° c.イメージ シーケンスの間の目的の浸漬のための水を補充します。
- 撮像セッションの最後に、麻酔下で CO2窒息によってマウスを安楽死させます。
注: これは動物実験; スイス連邦政府のガイドラインに基づき、します。安楽死に関する他のガイドラインは、別の場所にあります。
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Representative Results
このプロトコルでは、ほぼ全体背や腹側の SMG の画像をことができます。また、ビューのフィールドには、細胞構成4の SMG とは少し異なります舌下腺の唾液腺も含まれています。両方の腺はフィブリル型コラーゲンによってカプセル化され、葉に細分されます。ほとんど 14 システム 2nd高調波信号を測定することによってフィブリル型コラーゲンのラベル画像を作り出すことができるが、通常蛍光分子は細胞および細胞レベル下の構造の可視化に必要な。例えば、2nd高調波信号との組み合わせで緑の蛍光蛋白質 (GFP) 発現のユビキタス トランスジェニックは、形態学的特徴によって腺、ダクト、SMG の血管を特定するのに足りる。このセットアップは、特定の細胞のサブセットを識別する細胞型特異的発現と形質転換蛍光マーカーを観察する使用ことができます。図 2は、結合組織の ofCOL1A1 GFP レポーターを表現する線維芽細胞のような細胞ネットワークを示しています。また、血管、静脈注射高分子量デキストランと結合した蛍光色素でラベル付けされました。管の内腔の区画も、WD29に retrogradually を注入する色素、(図 3) が表示します。
図 1: ステージをカスタマイズします。(と *) 2 つの自由に調節可能なホルダー カバー スリップ;(b と b *) 調節可能な定位耳バー(; ねじで締めることができます c) の文字列(d) 自由に調整可能な金属製のリングを加熱(e) マウスの胴体を配置する区域に発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 血管マーカー (赤) と COL1A1 GFP 発現細胞 (緑) のネットワーク。テキサス赤デキストラン共役 (MW 70 kDa) の静脈注射によってラベル付けされた血管系。2 つの葉の間にフィブリル型コラーゲンは、2ndの次高調波 (青) として視覚化です。47 μ m 深さ 15 スタックのイメージの単一の z 投影は、示されています。スケール バー = 40 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 内腔ダクト WD 注射後ラベルします。70 kDa MW テキサス赤デキストラン (赤), 管腔の付いた血管の付いたカスケード ブルー-デキストラン (白; 10 kDa MW) WD と本移された GFP の+ CD8 を逆行性注入、+ T 経由で SMG の細胞 (緑)。表示は 50 μ m 深さ 27 スタックのイメージの単一の z 投影。スケール バー = 40 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、免疫学の分野でよく使用されます直立の非線型顕微鏡を用いたマウスの顎下腺と舌下腺唾液腺の生体内イメージングのための簡単な方法を提供しています。メソッドは、頭頸部領域の他の外分泌腺のイメージングのために合わせることができます。例えば、私たちの研究室は (図示せず) 類似している方法で、涙腺のイメージングを実行しています。
偶発的な組織の損傷が発生することができますのでこのプロトコルの最も重要なステップは、SMG の周りの結合組織を除去します。SMG の主な血液供給への損傷は、SMG 組織が低酸素になるので、実験の即時の終了を必要とします。SMG は組織自体が破損している場合は通常出血凝固して自然停止します。ただし、それは傷害トリガー無菌性炎症と炎症性サイトカインのリリース30、実験的読み出しに影響を与える可能性があります考慮する必要があります。一般的なしかし、以下の重要な合併症はマイクロサージャリーの中には、生理食塩水の貯留層における漏れです。リークの発生を最小限に抑えるために常に乾燥、毛のない肌にグリースを塗布します。リークを修正、通常無駄です: 代わりに、グリスをすべて削除、乾いた綿棒で清潔肌が、スクラッチから再適用します。
画像の中に生理的体温に近い温度 (およそ 37 ° C 男性と女性の C567BL/6 マウス31) を保守しなければなりません。低刺激と温熱療法は、血流32,33を変更、ために、これらの条件の下で SMG の生理機能を想定できません。ただし、我々 は血流や小 (± 2 ° C) T 細胞運動、過渡の違い認められなかった (< 5 分) 最適温度からの偏差。
組織の動きを最小限に抑えることは、良好な画像品質に不可欠です。不要な組織運動の種類が発生し、トラブルシューティングを受けることができる典型的な原因があります。まず、継続的な xyz ドリフトは通常による SMG 添付の結合組織を元の位置に戻ってゆっくり漂流します。下カバー ガラスが高すぎると、インストールされたか SMG 周囲結合織は徹底的に中断されない場合です。第二に、ゆっくりと継続的な z ドリフトは、温度が安定している場合に発生します。この場合は慎重に加熱を調整し、イメージングの前に約 15 分、安定する温度を待ちます。最後に、脈動の組織運動は、生理食塩水室は密閉式でない場合に発生します。圧力を構築し、すべての呼吸サイクル チャンバー内に生理食塩水でのリリースします。リークや気泡との組み合わせで、これは SMG 組織に直接翻訳脈動流動に します。この場合、カバーガラスと生理食塩水室の再構築は、最も信頼性の高いソリューションです。
イメージング深さ最大は、使用される励起波長と fluorophores の採用によって異なります。事実上すべての生体イメージング セットアップ、赤いシフト染料または長い波長 (900-1,100 nm) の興奮できる蛍光タンパク質のように深部より緑の染料と短い励起波長イメージングを可能にします。
SMG は、遠藤とエキソサイトーシスと膜腫瘍生物学1211自己免疫、感染症343,27,28を改造モデル器官として使用されています。それはさらに操作の多くの形態を許可: 染料、薬理学的化合物、抗体が血流を介して甲状腺に配信できます。また、ウイルス11, dextrans3、DNA25、染料29, や薬理学的エージェント3を提供する使用されている WD のカニュレーションを介して直接対象に SMG をできます。
生体イメージングの分野は、遺伝的・生化学的蛍光ラベリング技術のこれまで成長しているツールボックスから利益を続けています。遺伝子工学の進歩は、洗練された蛍光マーカーをマウスの行とセルの行を提供します。最近の例としては、特定の細胞のサブセットのラベリング (CD11c+細胞35) または動的細胞骨格蛋白質 (Lifeact36)、 37と原子力のリアルタイムのレポーター細胞の蛍光マーカー転流 (NFAT38) またはカルシウム39。他のアプリケーションは、(DNA 結合 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) または親油性膜色素) などの特定の細胞内コンパートメントを強調する生化学的、蛍光プローブを使用可能性があります。現代の固定顕微鏡実験の質問に答えられる多くの可能なソリューションを提供しています。例えば、最大取込速度40を強く増加する多重 2 光子イメージングをしました。その他の技術提供ラベル無料多光子イメージング、生成の 2 番目または第 3 高調波信号15、または分子の共振振動を測定することによって (コヒーレント ・ アンチストークス ・ ラマン散乱)41。したがって、実験者のリソースおよび創造性によって組織の露出と安定化の実用的な手順を利用できる場合、実験的デザインの限界主設定されます。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、スイス国立財団 (SNF) プロジェクト助成金 31003A_135649、31003A_153457 と (合弁会社) に 31003A_172994 とレオポルジナ親睦 LPDS 2011-16 (BS) の資金を供給されました。この作業を「顕微鏡イメージング センター」(MIC) ベルン大学光セットアップから恩恵を受けて。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
References
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