Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Forberedelse af Murine submandibulære spytkirtel til opretstående Intravital mikroskopi

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57283
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en protokol for at kirurgisk afsløre og stabilisere den murine submandibulære spytkirtel for intravital billeddannelse ved hjælp af opretstående intravital mikroskopi. Denne protokol er let at tilpasse til andre eksokrine kirtler af hoved og hals region af mus og andre små gnavere.

Abstract

De submandibulære spytkirtel (SMG) er en af de tre store spytkirtler, og er af interesse for mange forskellige områder af den biologiske forskning, herunder cellebiologi, onkologi, tandpleje og Immunologi. SMG er en eksokrine kirtel består af sekretoriske epitelceller, myofibroblasts, endotel celler, nerver og ekstracellulære matrix. Dynamisk cellulære processer i rotter og mus SMG har tidligere været afbildet, for det meste bruger omvendt multi photon mikroskop systemer. Her beskriver vi en enkel protokol for kirurgisk forberedelse og stabilisering af den murine SMG i bedøvede mus for i vivo billeddannelse med oprejst multi photon mikroskop systemer. Vi præsentere repræsentativt intravital billede sæt af endogene og overført adoptively fluorescerende celler, herunder mærkning af blodkar eller spyt kanalerne og andet harmonisk generation til at visualisere fibrillar kollagen. I sum, vores protokol giver mulighed for kirurgisk forberedelse af mus spytkirtlerne i opretstående mikroskopi systemer, som er almindeligt anvendt til intravital imaging inden for immunologi.

Introduction

Spyt er udskilles af eksokrine kirtler at smøre mad, beskytte slimhindeinfektioner af mundtlige tarmkanalen og levere fordøjelsesenzymer samt antimikrobielle stoffer1,2. Foruden mindre spytkirtlerne afbrudt i den mundtlige submucosa, er der tre bilaterale sæt af store kirtler identificeret som parotideale, sublinguale og submandibulære, efter deres placering1,2. Pyramide-formet epitelceller, organiseret i kolbe-formet sække (acini) eller demilunes, der er omgivet af myoepithelial celler og en basalmembran, udskiller komponenterne serøs og slimhinderne af spyt1. Den smalle luminale plads i acini afløb i indtrængere kanaler, der forener i tværstribede kanalerne, indtil de endelig kommer ind i en enkelt ekskretionsorganerne kanal1. De vigtigste ekskretionsorganerne kanalen af SMG kaldes Whartons kanalen (WD) og åbner i sublinguale caruncle3,4. SMG epitelial rum udgør derfor et stærkt arborized struktur med mangfoldige terminal slutpunkter, der ligner et bundt af druer1,5,6. SMG interstitium er sammensat af blod og lymfe-fartøjer indlejret i bindevæv7 indeholdende parasympatiske nerver8 og ekstracellulære matrix5. Normale menneskelige og gnaver spytkirtler også indeholde T celler, makrofager og dendritiske celler9, samt plasmaceller, der udskiller Immunoglobulin en (IgA) i spyt9,10. På grund af sit mangeartede funktioner i sundhed og sygdom er SMG et emne af interesse for mange områder inden for biologisk forskning, herunder tandpleje4, immunologi11, onkologi12, fysiologi8og cellebiologi 3.

Billeddannelse af dynamiske cellulære processer og interaktioner er et kraftfuldt værktøj i biologiske forskning13,14. Udviklingen af dybe væv imaging og innovationer inmicroscopes baseret på ikke-lineær optik (NLO), som er afhængige af spredning eller absorption af flere fotoner af prøven, har lov til at undersøge direkte cellulære processer i komplekse væv13 ,15. Absorption af flere fotoner indebærer levering af den samlede excitation energi af lav energi fotoner, som begrænser fluorophore excitation til brændplanet og dermed giver mulighed for dybere væv penetration med reduceret solskader og støj fra ud af fokus excitation13,15. Dette princip er ansat ved to-foton mikroskopi (2 PM) og giver mulighed for billeddannelse af fluorescerende modellerne i dybet af op til 1 mm15,16. Mens kommercielt tilgængelige 2 PM opsætninger er blevet brugervenlige og pålidelige, er den store udfordring for intravital billeddannelse omhyggeligt udsætte og stabilisere målorgan bedøvede mus, især for billeddannelse af time lapse serie. Flere metoder til digital drift korrektion efter dataopsamling har været udgivet17,18 , og vi for nylig udviklet "VivoFollow", en automatisk korrektion system, som modvirker langsom væv afdrift i realtid ved hjælp af en edb trin19. Men det er stadig kritisk for høj kvalitet imaging for at minimere væv bevægelse, især hurtige bevægelser skyldes vejrtrækning eller puls19. Forberedelse og stabilisering procedurer er blevet udgivet til flere organer, herunder rygmarven20, leveren21, hud22, lunge23og lymfeknude24. Derudover har modeller for rotte spytkirtel imaging været udviklet3,25 og yderligere raffineres for høj opløsning intravital billeddannelse af murine SMG skræddersyet til en inverteret mikroskop setup26, 27 , 28.

Her præsenterer vi en praktisk og fleksibel protokol for intravital billeddannelse af murine SMG bruger oprejst nonlinear mikroskopi, som er almindeligt anvendt til intravital imaging inden for immunologi. Med henblik herpå ændrede vi et bredt ansat immobilisering fase bruges til popliteal lymfeknude præparater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbejde er godkendt af den kantonale Udvalget for dyr eksperimenter og gennemføres i henhold til føderale retningslinjer.

1. bedøver musen

  1. Bære personlige værnemidler, herunder laboratoriekittel og handsker.
  2. Bland ketamin, xylazin og saltvand til en fungerende koncentration af 20 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis. Injicere arbejder stock intraperitoneal (i.p.) på 8-10 µL/g af musen. Placer musen tilbage ind i buret.
    Bemærk: Denne protokol er blevet testet for 6 til 40 uger gamle mandlige og kvindelige mus med C57BL/6 baggrund.
  3. Forberede Acepromazin løsning på 2,5 mg/mL og injicere 30 µL i.p., 15 min efter ketamin-xylazin injektion (75 µg/mus).
  4. Efter 5-15 min, kontrollere, om tilstrækkelig anæstesi og analgesi ved at kontrollere for reflekser, f.eks., tilbagetrækning refleks pote eller cornea refleks.
  5. Kontrol for reflekser ca. hver 30 min. under hele varigheden af forsøget. Subkutant injicere ketamin/xylazin på 1,5 µL/g musen, hver 60 min eller tidligere, hvis reflekser er positive.
    Bemærk: Inhalation anæstesi som isofluran kan ikke bruges med denne protokol, på grund af fiksering af musen.

2. Fjern skind fra det operationelle område

  1. Bruge en barbermaskine til at barbere et område som udvider omtrent fra 5 mm caudale i munden mod de forreste ben, stretching over kæberne over begge ører.
  2. Anvende Hårfjerningscreme på det barberede område med en vatpind. Omhyggeligt og grundigt fjerne efter 3 min, fxved aftørring med vådt væv.

3. Fastgør musen på scenen

Bemærk: Denne protokol bruger en tilpasset scenen (figur 1) udstyret med to frit justerbare holdere til dække underkjoler (en knyttet til scenen med en skrue, den anden monteret permanent på det); justerbar stereotactic øre barer; en streng, der kan strammes med en skrue; en frit indstillelig metal opvarmning ring; og en hævet område udpeget til at placere torso af musen. Denne fase er ændret fra en popliteal lymfeknude fase, med en ekstra stereotactic indehaveren og en støtte til den lavere dække slip holding exteriorized SMG. Detaljerede planer eller citater af scenen er tilgængelige efter anmodning.

  1. Forberede scenen ved at fjerne holdere til varme ring og aftageligt cover slip indehaveren. Løsne skruerne øre bar indehavere og faste dække slip indehaveren. Tape et stykke gaze til området center i den fase, der tjener som strøelse til musen.
  2. Bruge lim (Se Tabel af materialer) til at vedhæfte en 20 mm diameter cover glas til toppen af en cylindrisk metal indehaveren (dette vil være den lavere dækning glas). Lim en 25 mm cover glas til bunden af flad metal indehaveren (dette vil være den øverste dække glas). Sikre at dække briller overlapper ca 2-3 mm med metal indehavere og at resten af glasset forbliver fri for fedt og lim.
  3. Placer musen på ryggen på gaze, vinkelret i forhold til at strengen strakte med hovedet centreret mellem øre barer.
  4. Lave den øvre ekstremiteter musen ind på scenen med kirurgisk tape.
  5. Næste, krog strengen i den øvre forreste fortænder og stramme indtil kæben når vandret position. Bruge en vinklet buet pincet til at træk lidt tunge fra munden, hvilket letter vejrtrækning.
  6. Stramt, men ikke kraftigt træk hale og tape det på scenen.
  7. Juster øre barer for at opnå en vinkel på ca. 30° mellem baren og kanten af scenen. For at sikre denne vinkel, brug en trekant lineal til at tegne en højre og venstre 30° vinkel på et ark papir, og Placer den gennemsigtige fase på papir til at justere indehavere i overensstemmelse hermed.
  8. Fix kæbe mellem øre barer ved samtidig flytter den venstre og højre bar indad indtil kæben er immotile, og spænd skruerne. Observere bryst bevægelse, før, under og efter fastsættelse af kæben. Reduceret eller fraværende vejrtrækning angiver, at bjælkerne er faste på halsen, ikke kæbeknoglen; i dette tilfælde gentage proceduren for fastsættelse af straks.
  9. Give varme til musen, fxved at placere en varme lampe i nærheden og/eller en varmepude under scenen.

4. kirurgiske eksponering af spytkirtel ved hjælp af et stereomikroskop

Bemærk: Følgende trin kræver brug af et stereomikroskop, fine pincet og kirurgisk saks. Da proceduren er terminal, er det ikke nødvendigt at opretholde sterile driftsbetingelser. Ethanol-rengjort instrumenter er tilstrækkeligt.

  1. Find den omtrentlige placering af den rigtige SMG lap af på udkig efter en lille bule i huden, ca. 15 mm caudale af munden og 5 mm mediale af kæben linje. Løft en lille hud fold i midten af bule og skære det til at skabe og åbning af ca 5 mm længde.
  2. Straks iværksætte en 4 mm-høj ring af vakuum fedt på huden omkring snittet. (Brug en vakuum fedt-fyldte sprøjte med en afrundede 25 G kanyle).
  3. Fyld fedt ring med saltvand til at sikre væv forbliver fugtig under operationen.
  4. Under stereomikroskopet, forstyrre bindevæv ved hjælp af følgende fremgangsmåde: Brug en fin pincet til fast hold et stykke af bindevæv, der er direkte knyttet til SMG, og bruge en anden pincet til at trække den distale bindevæv, indtil det brister. Sikre, at nogle bindevæv forbliver knyttet til SMG; Det er ønskeligt, da det giver mulighed for håndtering. Ikke røre kirtlen med pincet, da dette vil forårsage blødning.
  5. Gentag denne bevægelse for at forstyrre bindevæv først på toppen af kirtel, så på den mediale side (mellem højre og venstre lap af SMG). Ikke adskille sublinguale fra submandibulære kirtel.
  6. Fortsætte med at fjerne mod uret omkring SMG (mediale til caudale, at distalt for rostralt) lateral bindevæv.
  7. Sikre at blodforsyningen, Efferente lymfevejene og spyt kanalen, som er alle placeret i en bundle på webstedet kranie af kirtlen, ikke er bristet.
  8. Når den laterale bindevæv er afbrudt, skal du bruge pincet til at trække bindevæv knyttet til caudale slutningen af SMG opad for at løfte den caudale slutningen af SMG. Forstyrre bindevæv under SMG lap, startende fra den caudale og bevæger sig mod den rostralt ende.
  9. Fortsætte indtil bindevæv til alle steder i SMG fjernes (undtagen den rostralt websted med store fodring/dræning blodkar og WD).

5. fastsættelse af kirtel

  1. Bekræfte, at fedt ring holding saltvand er mindst 4 mm høje og ikke utæt (Se trin 4.2).
  2. Installer den nederste dæksel glas (Se trin 3.2) ved at knytte den metal bar til sin højde-justerbar holder. Sikre at dække slip indehaveren er justeret til den yderste position og ikke røre fedt ring når knyttet til scenen. Placer indehaveren fra den caudale retning i en vinkel på ca. 60° til musen, med cover slip dækker omtrent to tredjedele (caudale og distale dele) af den udsatte lap. Sænke dækslet glas indtil det gør kontakt med kirtel.
  3. Komplet fedt ring oven i dækslet glas til at danne en ny saltvand reservoir.
  4. Træk forsigtigt SMG lap på toppen af coveret slip med pincet, kun at røre det bindevæv, der er knyttet til det (orglet kan vendes med bunden websted opad).
  5. Sikre, at fedt ring har en endda højde på mindst 4 mm og ikke lække. Hvis det er nødvendigt, fyldt refill saltvand reservoiret ved hjælp af en 30 G sprøjten med saltvand.
  6. Sikre, at indehaveren af dækslet glas til den øverste dække glas i sin yderste position. Bruge skruen til at vedhæfte metal indehaveren med 25 mm øvre cover glas til indehaveren. Bruge de justerbare skruer af indehaveren til at placere cover glas, så SMG er centreret i midten.
  7. Brug skruer med justerbar holder til at sænke det øverste cover glas indtil det direkte kontakter SMG. Observere form og farve af kirtel under dette trin. Hvis kirtel areal vises større, eller farve ændringer (for eksempel fra Rosa til hvid), straks sætte dækslet glas til en højere position til at lette presset på SMG.
  8. Kontrollere den saltholdige reservoir for utætheder ved udkig efter luftbobler og eller dråber af saltvand udenfor reservoiret. Hvis en lækage eller luft boblen er fundet, skal du fjerne både dække følgesedler og alle fedt og genstarte fra trin 2.
  9. Skrue lukke alle fiksering skruer.

6. fastsættelse af varme Ring og temperatur sonde

  1. Indsæt en temperatur sonde i reservoiret og placere det tæt på kirtlen, så tape sonde wire til scenen.
  2. Anvend en fedt ring til den øverste dække slip, med SMG i midten (diameter af fedt ring bør svare til diameteren af den varme ring). Placer den varme ring oven på dækslet slip og forsegle med fedt. Tape rør i den varme ring til scenen.

7. billedbehandling

Bemærk: Vi bruger en opretstående to-foton mikroskop system udstyret med en justerbar Ti:Sa Laser og en fluorescerende mikroskop med vand-fordybelse 20 X eller 25 X mål. Realtid korrektion af væv drift under erhvervelse kan gennemføres ved hjælp af en automatiseret fase og VivoFollow19. Dette forbedrer stabiliteten i image erhvervelse, men er ikke påkrævet.

  1. Tænde oprejst mikroskopi system ved hjælp af en passende software leveret af mikroskop producent. Tune Ti:Sa Laser til en 780-900 nm excitation bølgelængde.
  2. Tilslut varme rør til varme ring. En peristaltiske vandpumpe cirkulerer varmt vand (opvarmet af nedsænkning del af slangen i en 80° C vandbad) gennem ringen til at varme SMG.
  3. Tilsluttes en digital termometer temperatursonden. Juster hastigheden på den peristaltiske pumpe, hvis temperaturen er ikke mellem 35-39 ° C. Jo hurtigere pumpen virker, jo varmere objektet får, og vice versa.
  4. Før du starter billede erhvervelse, udføre en visuel kontrol af blod flow hastigheder. Nøje kontrollere leukocyt passage gennem de tynde kapillærer eller ved fluorescerende dextran injektion.
    Bemærk: Intravenøst indplantede fluorescerende dextran vil umiddelbart udfylde hele SMG Vaskulaturen når blodgennemstrømningen er fysiologiske. Dette er næsten altid er tilfældet i denne procedure.
  5. For at følge immunceller, er imaging dybde typisk mellem 20-150 µm under overfladen af SMG identificeret ved 2nd harmonisk generation signal. Optag billedstakke af 150-300 µm synsfelt med pixel opløsning af ca. 512 x 512 eller højere, og z-dybder på 20-60 µm med afstanden mellem 2-4 µm mellem billeder. Gentag stakken erhvervelsen hver 20-30 s for en samlet varighed på 20-60 min.
  6. Brug den digitale termometer til at styre minimums- og temperaturniveauer efter erhvervelse af en billedsekvens. Kassér billedsekvens, hvis minimum eller maksimum ikke er i rækken af 37 ± 2 ° C. Påfylde vand til nedsænkning af mål mellem billedsekvenser.
  7. For enden af imaging-session aflive mus af CO2 kvælning under anæstesi.
    Bemærk: Dette er i overensstemmelse med schweiziske føderale retningslinjer for dyreforsøg; andre retningslinjer for eutanasi kan anvende andre steder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol tillader billeddannelse af næsten den hele dorsale eller ventrale side af SMG. Synsfeltet omfatter typisk også den sublinguale spytkirtel, der adskiller sig lidt fra SMG i cellulære sammensætning4. Begge kirtler er indkapslet af fibrillar kollagen og opdelt i fliger. De fleste 2 PM systemer kan producere en etiket-gratis billede af fibrillar kollagen ved at måle 2nd harmoniske signal, men normalt fluorescerende molekyler er nødvendige for visualisering af cellulært og subcellulært strukturer. For eksempel, er allestedsnærværende transgene udtryk for grøn fluorescerende proteiner (NGL) i kombination med 2nd harmoniske signalet tilstrækkeligt til at identificere acini, kanaler og blodkarrene i SMG ved deres morfologiske træk. Denne opsætning kan bruges til at observere transgene fluorescerende markører med celle type specifikke udtryk til at identificere specifikke celle subsets. Figur 2 viser et netværk ofCOL1A1-NGL reporter-udtrykker fibroblast-lignende celler i bindevævet. Der vises også blodkar, mærket ved intravenøs injektion af et fluorescerende farvestof koblet til høj molekylvægt dextran. Den luminale rum af kanalerne kan også mærkes (figur 3), når farvestoffet injiceres retrogradually i WD29.

Figure 1
Figur 1 : Tilpassede fase. (a og a *) to frit justerbare holdere til dække podekviste; (b og b *) justerbar stereotactic øre barer; (c) en streng, der kan strammes med en skrue; (d) en frit indstillelig metal opvarmning ring; e hævet område udpeget til at placere torso af musen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Vaskulaturen markør (rød) og netværk af COL1A1-NGL udtrykker celler (grøn). Vaskulaturen mærket ved intravenøs injektion af Texas rød-dextran konjugat (MW 70 kDa). Fibrillar kollagen i mellem to kamre er visualiseret som 2nd harmoniske signal (blå). Vist er en enkelt z-projektion af 15 stablet billeder med 47 µm dybde. Skalalinjen = 40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Luminale kanalen mærket efter WD injektion. Blodkar mærket med 70 kDa-MW Texas rød-dextran (rød), kanalen lumen mærket med cascade blå-dextran (hvid, 10 kDa MW) via retrograd injektion gennem WD og adoptively overførte normal god landbrugspraksis+ CD8+ T celler (grønne) i SMG. Vist er en enkelt z-projektion af 27 stablet billeder med 50 µm dybde. Skalalinjen = 40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol tilbyder en ligetil tilgang til i vivo billeddannelse af murine submandibulære og sublinguale spytkirtler ved hjælp af oprejst ikke-lineære mikroskopi ofte bruges inden for immunologi. Metoden kan være tilpasset til billeddannelse af andre eksokrine kirtler i regionen hoved og hals. For eksempel, har vores lab udført billeddannelse af lacrimal kirtel på en tilsvarende måde (ikke vist).

At fjerne bindevæv omkring SMG er den mest afgørende skridt i denne protokol, da utilsigtet vævsskader kan forekomme. Skade på den væsentligste blodforsyning af SMG kræver omgående opsigelse af eksperimentet, da SMG væv vil blive hypoksiske. Hvis SMG væv, selv er beskadiget, blødning typisk stopper naturligvis af koagulation. Det skal imidlertid overvejes at skaden, der udløser steril betændelse og proinflammatoriske cytokiner frigive30, som kunne påvirke den eksperimentelle udlæsning. En mere almindelige, men mindre kritiske komplikation under mikrokirurgi er lækager i saltvand reservoiret. For at minimere forekomsten af lækager, altid anvende fedt til tørre, hårløs hud. Lappe en lækage er som regel forgæves: i stedet, fjerne alt fedt, rense huden med en tør vatpind, og genanvende fra bunden.

Under imaging holdes en temperatur tæt på fysiologiske kropstemperaturen (ca. 37 af ° C for mandlige og kvindelige C567BL/6 mus31). Da både hypo- og hypertermi alter blod flow32,33, antages ikke fysiologisk funktion af SMG under disse betingelser. Men vi observerede ingen forskel i blodgennemstrømning eller T-celle motilitet under små (± 2 ° C), forbigående (< 5 min) afvigelser fra optimal temperatur.

Minimere væv bevægelse er afgørende for god billeddiagnostiske kvalitet. Forskellige former for uønsket væv bevægelse kan forekomme og har typiske årsager, der kan underkastes fejlfinding. For det første er løbende xyz-drift normalt forårsaget af SMG langsomt glide tilbage til sin oprindelige position gennem vedlagte bindevæv. Dette sker hvis de lavere dækning glas blev installeret for høj, eller bindevæv omkring SMG var ikke grundigt forstyrret. For det andet, langsom og kontinuerlig z-drift kan opstå, hvis temperaturen er ustabil. I dette tilfælde nøje justere opvarmning og vente på temperatur til at være stabil, ca. 15 min. før billeddannelse. Endelig, pulserende væv bevægelse opstår, når saltvand salen ikke er tætsluttende lukket. Presset hober sig op og udgivelser i saltvand salen med hver vejrtrækning cyklus. I kombination med lækager eller luftbobler fører dette til pulserende væske strømme, som oversætte direkte til SMG væv. I dette tilfælde er gensamling af både dække briller og saltvand kammer den mest pålidelige løsning.

Den maksimale imaging dybde afhænger af excitation bølgelængde bruges og fluorophores ansat. Som i næsten alle intravital imaging opsætninger, rød-forskudt farvestoffer eller fluorescerende proteiner, der kan være glade med lange bølgelængder (900-1100 nm) giver mulighed for dybere væv imaging end grønne farvestoffer og kortere excitation bølgelængder.

SMG har været brugt som model orgel for endo - og exocytose og membran remodeling3,27,28, infektion34, autoimmunitet11og tumor biologi12. Det tillader yderligere mange former for manipulation: farvestoffer, farmakologiske forbindelser og antistoffer kan leveres til kirtel via blodet. Alternativt, at SMG kan målrettes direkte via cannulation af WD, som har været brugt til at levere virus11, dextrans3, DNA25, farvestoffer29eller farmakologiske midler3.

Feltet intravital imaging fortsætter med at drage fordel af en stadigt voksende værktøjskasse af genetiske og biokemiske fluorescerende mærkning teknikker. Fremskridt inden for genteknologien giver musen linjer og cellelinjer sofistikerede fluorescerende markører. De seneste eksempler omfatter mærkning af specifikke celle subsets (CD11c+ celler35) eller dynamisk cytoskeletal proteiner (Lifeact36), photoconvertible markører for celle tracking 37, og real-time indberettere af nukleare translokation (NFAT38) eller calcium signalering39. Andre programmer kan bruge fluorescerende biokemiske sonder, som fremhæver særlige subcellulært rum (såsom DNA bindende 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller lipofile membran farvestoffer). Moderne NLO mikroskopi tilbyder mange mulige løsninger for at bedst besvare de eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, er multiplex to-foton imaging blevet udviklet kraftigt øge maksimale erhvervelse hastighed40. Andre teknikker tilbyde etiket-fri multiphoton imaging, ved at generere anden eller tredje harmoniske signaler15, eller ved at måle karakteristiske resonans vibrationer af molekyler (sammenhængende anti-Stokes Raman spredning)41. Når praktisk procedurer for væv eksponering og stabilisering er tilgængelige, angives grænserne for eksperimenterende design således, for det meste af eksperimentatorens ressourcer og kreativitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af schweiziske nationale Foundation (SNF) project grant 31003A_135649, 31003A_153457 og 31003A_172994 (til JVS) og Leopoldina fellowship LPDER 2011-16 (til BS). Dette arbejde nydt godt af optiske opsætninger af "Mikroskopi Imaging Center" (MIC) af Berns universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 135 Intravital imaging mus model multiphoton mikroskopi spytkirtel analyse af adaptive immunrespons immunologi
Forberedelse af Murine submandibulære spytkirtel til opretstående Intravital mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B.,… More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter