Summary
Descreveremos um protocolo para cirurgicamente expor e estabilizar a glândula salivar submandibular murino para intravital imagem usando microscopia intravital vertical. Este protocolo é facilmente adaptável a outras glândulas exócrinas da cabeça e região do pescoço dos ratos e outros pequenos roedores.
Abstract
Glândula salivar submandibular (SMG) é uma das três principais glândulas salivares e é de interesse para muitos diferentes campos de pesquisa biológica, incluindo Imunologia, oncologia, odontologia e biologia celular. O SMG é uma glândula exócrina composta de células epiteliais secretoras, miofibroblastos, células endoteliais, nervos e matriz extracelular. Processos celulares dinâmicos no rato e rato SMG anteriormente tem sido fotografados, principalmente utilizando invertido sistemas multi fóton microscópio. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a preparação cirúrgica e estabilização da SMG murino em ratos anestesiados para a imagem latente na vivo com sistemas vertical multi fóton microscópio. Apresentamos a moda imagem intravital representativa de endógena e enviaram transferido células fluorescentes, incluindo a rotulagem dos vasos sanguíneos ou dutos salivares e geração segundo harmônica Visualizar fibrillar colágeno. Em suma, nosso protocolo permite a preparação cirúrgica das glândulas salivares de rato em sistemas de microscopia na posição vertical, que são comumente usados para intravital imagem no campo da imunologia.
Introduction
Saliva é secretada pelas glândulas exócrinas para lubrificar o alimento, proteger as superfícies mucosas do trato oral e entregar as enzimas digestivas, bem como substâncias antimicrobianas1,2. Além de glândulas salivares menores intercaladas na submucosa oral, existem três conjuntos bilaterais das glândulas maiores identificados como parótida, sublingual e submandibular, de acordo com sua localização1,2. Células epiteliais em forma de pirâmide, organizados em sacos em forma de balão (ácinos) ou demilunes que são circundadas por células mioepiteliais e uma membrana basal, secretam os componentes seroso e mucosos de saliva1. O estreito espaço luminal dos ácinos drenos para dutos intercalados, que se unem para dutos estriados até que eles finalmente se juntam em um único Ducto excretor1. O Ducto excretor principal da SMG é chamado ducto de Wharton (WD) e abre para a carúncula sublingual3,4. O compartimento de epiteliais SMG representa, portanto, uma estrutura altamente arborized com múltiplos pontos de extremidade do terminais, assemelhando-se a um pacote de uvas1,5,6. O interstício SMG é composto de vasos sanguínea e linfática, incorporados no tecido conjuntivo7 que contém nervos parassimpáticos8 e matriz extracelular5. Glândulas salivares normais de humanas e roedores também contêm células T, macrófagos e células dendríticas9, bem como plasmócitos que secretam a imunoglobulina A (IgA) na saliva9,10. Devido a suas funções multifacetadas na saúde e na doença, a SMG é um assunto de interesse para muitos campos de pesquisa biológica, incluindo Odontologia4Imunologia11, oncologia12, fisiologia8e biologia celular 3.
Imagem de interações e processos celulares dinâmicos é uma ferramenta poderosa em pesquisas biológicas13,14. O desenvolvimento do tecido profundo imaging e inovações inmicroscopes baseado em óptica não-linear (NLO), que contam com dispersão ou absorção de múltiplos fótons pela amostra, permitiu-se diretamente, examinar processos celulares em tecidos complexos13 ,15. Absorção de múltiplos fótons envolve a entrega da energia total excitação por fótons de baixa energia, que excitação de fluoróforo limites para o plano focal e, portanto, permite a penetração mais profunda do tecido com Fotodano reduzido e ruído fora do foco excitação de13,15. Este princípio é empregado pela microscopia de dois fotões (14:00) e permite que para a imagem latente de amostras fluorescentes em profundidades de até 1 mm15,16. Enquanto comercialmente disponível 14:00 configurações tornaram-se amigável e confiável, o grande desafio para a imagem latente intravital é cuidadosamente expor e estabilizar o órgão-alvo de ratos anestesiados, especialmente para a imagem latente da série de lapso de tempo. Vários métodos para a correção de deriva digital depois de aquisição de dados ter sido publicado17,18 anos e recentemente desenvolvemos a "VivoFollow", um sistema de correção automática, que neutraliza o tecido lenta deriva em tempo real usando um estágio informatizado19. No entanto, é ainda essencial para alta qualidade de imagem para minimizar o movimento do tecido, especialmente movimentos rápidos causados pela respiração ou batimento cardíaco19. Procedimentos de preparação e estabilização foram publicados por vários órgãos, incluindo medula espinhal2021de fígado, pele22, pulmão23e linfonodo24. Além disso, modelos para a imagem latente de glândulas salivares de ratos foram desenvolvidos3,25 e ainda mais refinado para intravital imagem de alta resolução do murino que SMG adaptado a um microscópio invertido configuração26, 27 , 28.
Aqui, apresentamos um protocolo prático e adaptável para intravital imagem da SMG murino utilizando microscopia não linear vertical, que é comumente usada para a imagem latente intravital no campo da imunologia. Para este fim, nós modificamos um palco de imobilização muito utilizado usado para preparações de linfonodo poplíteo.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comité Cantonal de Experimentação Animal e realizado de acordo com as diretrizes federais.
1. anestesiar o Mouse
- Utilize equipamento de protecção pessoal, incluindo luvas e jaleco.
- Misture cetamina, xilazina e soro fisiológico para um trabalho de concentração de 20 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Injetar o estoque de trabalho intraperitonealmente (i.p.) em 8-10 µ l/g de rato. Coloque o mouse volta para a jaula.
Nota: Este protocolo foi testado para 6 a 40-semanas os ratos masculinos e femininos com um fundo C57BL/6. - Preparar a solução de acepromazina a 2,5 mg/mL e 30 µ l i.p., 15 min após a injeção de xilazina-cetamina (75 µ g/mouse) de injetar.
- Depois de 5-15 min, verifique adequada anestesia e analgesia, controlando para reflexos, por exemplo, reflexo de retirada da pata ou reflexo corneal.
- Controle de reflexos aproximadamente cada 30 minutos durante toda a duração do experimento. Injectar por via subcutânea xilazina/cetamina em 1,5 µ l/g de rato, cada 60 min ou anterior se reflexos são positivos.
Nota: A anestesia por inalação como o isoflurano não pode ser usada com este protocolo, devido a fixação do mouse.
2. Retire a pele da área operacional
- Use um barbeador elétrico para depilar uma área que se expande cerca de 5mm de caudal da boca em direção as pernas dianteiras, estendendo-se sobre as maxilas para ambos os ouvidos.
- Aplique creme depilatório na área depilada com um cotonete. Com cuidado e completamente remova após 3 min, por exemplo, limpando com tecidos húmidos.
3. fixe o Mouse no palco
Nota: Este protocolo usa um palco personalizado (Figura 1), equipado com dois suportes livremente ajustáveis para lamínulas (um anexado ao palco com um parafuso, o outro fixado permanentemente); barras de orelha estereotáxica ajustável; uma sequência de caracteres, que pode ser apertada com um parafuso; um metal livremente ajustável aquecimento anel; e uma área levantada designada para colocar o torso do mouse. Nesta fase é modificada de uma fase de linfonodo poplíteo, com um titular estereotáxico adicionado e um suporte para o deslizamento da tampa inferior segurando a exteriorização SMG. Planos detalhados ou citações do palco estão disponíveis mediante pedido.
- Prepare o palco, removendo os suportes para o anel de aquecimento e o titular do deslizamento da tampa removível. Desaperte os parafusos de titulares de bar a orelha e o titular do deslizamento da tampa fixa. Grave um pedaço de gaze na área central do palco, servindo como fundamento para o mouse.
- Usar cola (consulte a Tabela de materiais) para anexar um vidro de tampa do diâmetro de 20 mm para o topo de um suporte de metal cilíndrico (este será o vidro tampa inferior). Cola um vidro de tampa de 25 mm para o fundo do porta metálica plana (este será o vidro de tampa superior). Certifique-se que os óculos de cobertura se sobrepõem a aproximadamente 2-3 mm, com suportes de metal e que o resto do vidro permanece livre de graxa e cola.
- Posicione o mouse na suas costas sobre a gaze, perpendicular a corda esticada, com a cabeça centrada entre as barras de orelha.
- Fixe as extremidades superiores do mouse para o palco com esparadrapo.
- Em seguida, ligar a sequência de caracteres para os incisivos superiores da frente e apertar até que o queixo se encontre em posição horizontal. Use uma pinça curva angulada para puxar ligeiramente a língua da boca, que facilita a respiração.
- Firmemente, mas não com força, puxar o rabo e fita-lo para o palco.
- Alinhe as barras de orelha para alcançar um ângulo de aproximadamente 30° entre o bar e a beira do palco. Para garantir este ângulo, use uma régua de triângulo para desenhar um ângulo de 30° de direita e esquerda em uma folha de papel e coloque o palco transparente no papel para alinhar os suportes em conformidade.
- Corrigir o queixo entre as barras de orelha movendo simultaneamente a barra esquerda e direita para dentro até que a mandíbula é fixa e aperte os parafusos. Observe o movimento do peito antes, durante e após a fixação da mandíbula. Reduzida ou ausente respiração indica que as barras são fixas no pescoço, não o osso da mandíbula; Neste caso, repita o procedimento de fixação imediatamente.
- Fornece o aquecimento para o mouse, por exemplo, colocando uma lâmpada de aquecimento nas proximidades e/ou uma almofada de aquecimento por baixo do palco.
4. exposição cirúrgica da glândula salivar usando um estereomicroscópio
Nota: As etapas a seguir requerem o uso de um microscópio estereoscópico, pinça fina e tesoura cirúrgica. Desde que o procedimento é terminal, não é necessário manter condições de funcionamento estéril. Instrumentos de etanol-limpo é suficiente.
- Localize a posição aproximada do lóbulo direito SMG à procura de uma ligeira protuberância na pele aproximadamente 15mm de caudal da boca e medial de 5 mm da linha da mandíbula. Levantar uma prega de pele pequena no centro da protuberância e cortá-lo a criar e abertura de aproximadamente 5 mm de comprimento.
- Aplique imediatamente um anel de 4 mm de altura de vácuo graxa sobre a pele ao redor do corte. (Use uma seringa cheia de graxa vácuo com agulha hipodérmica 25g cega).
- Encha o anel de gordura com solução salina para garantir que o tecido úmido durante a operação.
- Sob o microscópio estereoscópico, perturbar o tecido conjuntivo, usando o seguinte procedimento: usar uma pinça fina para Segure firmemente um pedaço de tecido conjuntivo anexado diretamente para a SMG e usar uma segunda pinça para puxar o tecido conjuntivo distal até que rompe. Certifique-se de que algum tecido conjuntivo permanece anexado para o SMG; Isto é desejável, uma vez que permite a manipulação. Não toque a glândula em si com a pinça, pois isto causará sangramento.
- Repita este movimento de perturbar o tecido conjuntivo primeiro em cima da glândula e, em seguida, no lado medial (entre o lobo direito e esquerdo da SMG). Não separe o sublingual da glândula submandibular.
- Continue a remover o tecido conjuntivo lateral no sentido anti-horário em torno do SMG (medial ao caudal, para distal, para rostral).
- Certifique-se de que o fornecimento de sangue, vasos linfáticos eferentes e ducto salivar, que estão localizados em um pacote no site craniano da glândula, não são rompidas.
- Uma vez que a lateral do tecido conjuntivo é interrompido, use pinça para puxar o tecido conjuntivo anexado à extremidade caudal do SMG para cima para levantar a extremidade caudal do SMG. Perturbar o tecido conjuntivo abaixo do lóbulo SMG, a partir do caudal e se movendo em direção a extremidade rostral.
- Continue até o tecido conjuntivo para todos os sites da SMG é removido (excluindo o site rostral com alimentação/drenagem vasos sanguíneos e o WD).
5. fixação da glândula
- Confirme se o anel de graxa segurando o soro fisiológico é pelo menos 4 mm alto e não vazar (consulte a etapa 4.2).
- Instalar a tampa inferior de vidro (ver passo 3.2), colocando a barra de metal seu suporte regulável em altura. Certifique-se que o titular de lamínula é ajustado para a posição máxima e não toca o anel de graxa quando anexado ao palco. Posicione o titular da direção caudal em um ângulo de aproximadamente 60° para o mouse, com lamínula cobrindo cerca de dois terços (partes distais e caudais) do exposto lobo. Abaixe o tampa de vidro até que ele entra em contato com a glândula.
- Complete o anel de graxa por cima do vidro de tampa para formar um novo reservatório de solução salino.
- Puxe cuidadosamente o lóbulo SMG em cima a lamínula com pinça, somente tocando o tecido conjuntivo anexado a ele (o órgão pode ser invertido com o site de baixo para cima).
- Certifique-se que o anel de graxa tem uma altura de até mesmo de pelo menos 4 mm e não vaza. Se necessário, reabastecer o reservatório salino usando um 30 G seringa preenchida com solução salina.
- Verifique se o suporte de vidro de tampa para o vidro de tampa superior está na posição máxima. Use o parafuso para fixar o suporte de metal com vidro de tampa superior a 25 mm para o titular. Use os parafusos ajustáveis do titular para posicionar o tampa de vidro para que o SMG é centralizado no meio.
- Utilize os parafusos de suporte ajustável para abaixar o vidro de tampa superior até que contacta directamente o SMG. Observe a forma e a coloração da glândula durante esta etapa. Se a área de superfície da glândula parece maior, ou a coloração muda (por exemplo, do rosa ao branco), imediatamente coloque o tampa de vidro para uma posição mais elevada para aliviar a pressão sobre o SMG.
- Verifique se o reservatório de solução salino para vazamentos à procura de bolhas de ar e/ou gotas de solução salina fora do reservatório. Se for detectada um vazamento ou ar bolha, remover lamínulas e todos Unte e reiniciar a partir do passo 2.
- Parafuso fecha todos os parafusos de fixação.
6. fixar o anel de aquecimento e sonda de temperatura
- Inserir uma sonda de temperatura no reservatório e posicioná-lo perto da glândula e, em seguida, o fio da sonda para a fase de fita.
- Aplica um anel de graxa para o deslizamento da tampa superior, com a SMG no centro (o diâmetro do anel de gordura deve corresponder ao diâmetro do anel de aquecimento). Posicione o anel de aquecimento em cima do deslizamento da tampa e lacre com graxa. Fita a tubagem do anel de aquecimento para o palco.
7. imagem latente
Nota: Nós usamos um sistema vertical de dois fotões de microscópio equipado com um Laser sintonizável de Ti:Sa e um microscópio fluorescente com objectivos de imersão água 20 X ou 25 X. Tempo real correção da deriva de tecido durante a aquisição pode ser implementada usando uma fase automatizada e VivoFollow19. Isto melhora a estabilidade de aquisição de imagem, mas não é necessário.
- Ligue o sistema de microscopia vertical usando um software apropriado fornecido pelo fabricante do microscópio. Ajuste o Laser Ti:Sa para um comprimento de onda de excitação do 780-900 nm.
- Conecte o tubo de aquecimento para o anel de aquecimento. Uma bomba peristáltica água circula água quente (aquecida submergindo parte do tubo em um banho de água a 80° C) através do anel para aquecer o SMG.
- Conecte a sonda de temperatura com um termómetro digital. Ajustar a velocidade da bomba peristáltica, se a temperatura for não entre 35-39 ° C. Quanto mais rápido a bomba funciona, mais quente o objeto fica e vice-versa.
- Antes de iniciar a aquisição de imagens, execute um controle visual das velocidades de fluxo do sangue. Verifique cuidadosamente a passagem dos leucócitos através dos capilares finos ou por injeção de dextrano fluorescente.
Nota: Dextran fluorescente injetado por via intravenosa imediatamente preencherá vasculatura SMG inteira quando o fluxo sanguíneo é fisiológico. Quase sempre é o caso neste procedimento. - Seguir as células imunes, profundidade de imagem é tipicamente entre 20-150 µm na superfície da SMG identificado pelo sinal harmônico geração 2nd . Pilhas de gravar imagem de 150-300 µm campo de visão com uma resolução de pixels de aproximadamente 512 x 512 ou superior e z-profundidade de 20-60 µm com espaçamento de 2-4 µm entre imagens. Repita a aquisição de pilha cada 20-30 s para uma duração total de 20-60 min.
- Use o termómetro digital para controlar os níveis de temperatura mínima e máxima após a aquisição da imagem de uma sequência. Descartar a sequência de imagens se o mínimo ou máximo não está na faixa de 37 ± 2 ° C. A pegar água para imersão de objetivo entre sequências de imagem.
- No final da sessão de imagens, eutanásia os ratos por asfixia de CO2 sob anestesia.
Nota: Isto é de acordo com orientações federais suíços de experimentação animal; outras orientações para eutanásia podem aplicar em outro lugar.
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Representative Results
Este protocolo permite imagens de quase todo o dorsal ou ventral lado da SMG. O campo de visão tipicamente inclui também a glândula salivar sublingual, que difere ligeiramente da SMG na composição celular4. Ambas as glândulas são encapsuladas por colágeno fibrillar e subdivididas em lóbulos. A maioria das 14:00 sistemas podem produzir uma imagem livre de rótulo de colágeno fibrillar medindo o sinal harmônico 2nd , mas geralmente moléculas fluorescentes são necessários para a visualização de estruturas celulares e subcelulares. Por exemplo, expressão transgênica onipresente da proteína verde fluorescente (GFP) em combinação com o sinal harmônico 2nd é suficiente para identificar acinar, ductos e vasos sanguíneos na SMG, por suas características morfológicas. Esta configuração pode ser usada para observar marcadores fluorescentes transgênicos com célula tipo determinado expressão para identificar subconjuntos de célula específica. A Figura 2 mostra uma rede ofCOL1A1-GFP repórter-expressando fibroblastos-células do tecido conjuntivo. Também são mostrados os vasos sanguíneos, rotulados por injeção intravenosa de um corante fluorescente acoplado ao dextrano de alto peso molecular. O compartimento luminal dos dutos também pode ser rotulado (Figura 3) quando o corante é injetado o WD29retrogradually.
Figura 1 : Personalizado palco. (e uma *) dois titulares livremente ajustáveis para lamínulas; barras de orelha estereotáxica ajustável (b e b *); (c) uma sequência de caracteres, que pode ser apertada com um parafuso; (d) um metal livremente ajustável aquecimento anel; (e) criou a área designada para colocar o torso do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Marcador de vasculatura (vermelho) e a rede de células expressando de COL1A1-GFP (verde). Vasculatura etiquetada por injecção intravenosa de conjugado de Texas Red-dextrano (MW 70 kDa). Fibrillar colágeno entre dois lóbulos é visualizado como o sinal harmônico de 2nd (azul). É mostrado uma única z-projeção de 15 imagens empilhadas com 47 µm de profundidade. Barra de escala = 40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Duto luminal rotulado após a injeção do WD. Vasos sanguíneos rotulados com 70 kDa-MW Texas Red-dextrano (vermelho), duto lúmen rotulado com cascata azul-dextrano (branco; kDa 10 MW) através da injeção retrógrada através da WD e enviaram transferido GFP+ CD8+ T células (verdes) na SMG. Mostrado é uma única z-projeção de 27 imagens empilhadas com 50 µm de profundidade. Barra de escala = 40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo oferece uma abordagem simples para a imagem latente na vivo de murino glândulas salivares submandibulares e sublingual usando microscopia não-linear vertical, muitas vezes usada no campo da imunologia. O método pode ser adaptado para o tratamento de imagens de outras glândulas exócrinas na região da cabeça e pescoço. Por exemplo, nosso laboratório tem realizado de imagem da glândula lacrimal de forma análoga (não mostrada).
Remover o tecido conectivo ao redor a SMG é a etapa mais crítica do presente protocolo, desde que o dano tecidual acidental pode ocorrer. Dano ao suprimento sanguíneo principal da SMG exige fim imediato da experiência, desde que o tecido SMG se tornará hipóxico. Se o próprio tecido do SMG é danificado, sangramento normalmente parar naturalmente por coagulação. No entanto, ele precisa ser considerado que a lesão provoca inflamação estéril e cytokines proinflammatory liberar30, que poderia influenciar a leitura experimental. Uma complicação mais comum, mas menos de crítica durante a microcirurgia são vazamentos no reservatório de solução salino. Para minimizar a ocorrência de vazamentos, sempre aplica graxa para a pele seca e sem pelos. Remendar um vazamento é geralmente inútil: em vez disso, remova toda a graxa, limpar a pele com um cotonete seco e reaplicar a partir do zero.
Durante a imagem latente, uma temperatura próxima a temperatura fisiológica do corpo deve ser mantida (aproximadamente 37 ° C para machos e fêmeas de ratos C567BL/631). Desde que ambos hipo e hipertermia alteram sangue fluxo32,33, função fisiológica da SMG não pode ser presumida naquelas condições. No entanto, observamos que não há diferença no fluxo de sangue ou células T motilidade durante pequenos (± 2 ° C), transitório (< 5min) desvios da temperatura ideal.
Minimizar o movimento do tecido é essencial para a boa qualidade de imagem. Diferentes tipos de movimento de tecido indesejado podem ocorrer e têm causas típicas que podem se submeter a solução de problemas. Em primeiro lugar, xyz-drift contínuo geralmente é causada pelo SMG lentamente à deriva volta para sua posição original através do tecido conjuntivo anexado. Isso acontece se o vidro de tampa inferior foi instalado muito alto, ou o tecido conectivo ao redor a SMG não foi completamente interrompido. Em segundo lugar, lenta e contínua z-drift pode ocorrer se a temperatura é instável. Neste caso cuidadosamente ajustar o aquecimento e aguardar a temperatura estável, aproximadamente 15 min antes de imagem. Finalmente, movimento pulsante de tecido ocorre quando a câmara salina não é hermeticamente fechada. A pressão acumula-se e libera na câmara salina com cada ciclo de respiração. Em combinação com vazamentos ou bolhas de ar, isto conduz aos fluxos de fluido pulsantes, que se traduz diretamente para o tecido SMG. Neste caso, remontagem de ambos os vidros de tampa e câmara salina é a solução mais confiável.
A máxima profundidade de imagem varia de acordo com o comprimento de onda de excitação usado e o fluorophores empregadas. Como em praticamente todas as configurações de imagem intravital, corantes avermelhado ou proteínas fluorescentes que podem ser excitadas com comprimentos de onda longos (900-1.100 nm) permitem tecido mais profundo da imagem latente do que corantes verdes e excitação mais curta comprimentos de onda.
O SMG tem sido usado como órgão de modelo para endo - e exocitose e a membrana remodelação de27,3,28, infecção34, auto-imunidade11e tumor biologia12. Além disso permite muitas formas de manipulação: corantes, compostos farmacológicos e anticorpos podem ser entregues para a glândula através do fluxo de sangue. Alternativamente, o SMG pode ser direcionada diretamente via a canulação da WD, que tem sido usado para entregar vírus11, dextranos3, DNA25, corantes29ou agentes farmacológicos3.
O campo de imagem intravital continua a lucrar com uma caixa de ferramentas crescente de genética e bioquímica fluorescente técnicas de rotulagem. Avanços na engenharia genética fornecem rato linhas e linhas celulares sofisticados marcadores fluorescentes. Exemplos recentes incluem a rotulagem de subconjuntos de célula específica (CD11c+ células35) ou proteínas do citoesqueleto dinâmicas (Lifeact36), marcadores de photoconvertible para celular rastreamento 37e repórteres em tempo real da energia nuclear translocação (NFAT38) ou cálcio39de sinalização. Outros aplicativos podem usar fluorescentes sondas bioquímicas, que destacam os compartimentos subcellular específicos (tais como o DNA de ligação 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou corantes lipofílicos membrana). Microscopia NLO moderna oferece muitas soluções possíveis para melhor responder às perguntas experimentais. Por exemplo, multiplexada dois fotões de imagens foi desenvolvida para aumentar fortemente a aquisição máxima velocidade40. Outras técnicas para oferecer imagens livre de rótulo do multiphoton, geradora de segunda ou terceira harmônica sinais15, ou pela medição de vibração de ressonância característico de moléculas (coerente anti-Stokes Raman dispersão)41. Assim, quando procedimentos praticáveis para exposição de tecido e estabilização estão disponíveis, os limites do design experimental na maior parte são definidos pelos recursos do experimentador e criatividade.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional Suíço (SNF) projeto concessão 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (para joint ventures) e Leopoldina companheirismo semi-submersíveis 2011-16 (a BS). Este trabalho beneficiado ópticas configurações do "Microscopia Imaging Center" (MIC) da Universidade de Berna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
References
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