Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Préparation du murin des glandes salivaires sous-maxillaires pour la microscopie intravitale verticale

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57283
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

Les auteurs décrivent un protocole pour chirurgicalement exposer et stabiliser les glandes salivaires sous-maxillaires murine intravitale imagerie microscopie intravitale verticale. Ce protocole est facilement adaptable à d’autres glandes exocrines de la tête et la région du cou de la souris et autres petits rongeurs.

Abstract

La glande salivaires sous-maxillaire (SMG) est l’une des trois principales glandes salivaires et présente un intérêt pour nombreux domaines de la recherche biologique, immunologie, oncologie, médecine dentaire et la biologie cellulaire. Le SMG est une glande exocrine, constituée de cellules épithéliales sécrétrices, myofibroblastes, cellules endothéliales, nerfs et la matrice extracellulaire. Des processus dynamiques cellulaires chez le rat et la souris SMG ont précédemment été imagés, utilisant surtout inversé systèmes de microscopie multiphotonique. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation chirurgicale et la stabilisation de la SMG murin souris anesthésiés pour l’imagerie in vivo avec des systèmes de microscope multiphotonique vertical. Nous présentons ensembles image intravitale représentative d’endogène et transféré Moutschen cellules fluorescentes, y compris l’étiquetage des vaisseaux sanguins ou des conduits salivaires et génération de seconde harmonique de visualiser de collagène fibrillaire. En somme, notre protocole permet une préparation chirurgicale des glandes salivaires de la souris dans les systèmes de microscopie verticale, qui sont couramment utilisés pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie.

Introduction

Salive est sécrétée par les glandes exocrines pour lubrifier les aliments, protéger les muqueuses des voies orale et pour fournir des enzymes digestives ainsi que des substances antimicrobiennes1,2. En plus des glandes salivaires intercalés dans la sous-muqueuse buccale, il y a trois ensembles bilatérales des glandes principales identifiées comme parotide, sublingual et sous-maxillaires, selon leur emplacement1,2. Cellules épithéliales en forme de pyramide, organisés dans des sacs en forme de fiole (acini) ou demilunes qui sont entourées de cellules myoépithéliales et une membrane basale, sécrètent les composants séreuses et muqueuses de salive1. L’espace étroit luminale des acini se déverse dans des conduits intercalés, qui s’unissent dans des conduits striés jusqu'à ce qu’ils rejoignent finalement dans un seul conduit excréteur1. Le conduit excréteur principal de la SMG est appelé canal de Wharton (WD) et s’ouvre sur la caroncule sublinguale3,4. Le compartiment épithélial SMG représente donc une structure très arborisée avec des points de terminaison terminales collecteurs, ressemblant à un paquet de raisins1,5,6. L’interstitium SMG est composé des vaisseaux sanguin et lymphatique, intégrés dans le tissu conjonctif7 contenant des nerfs parasympathiques8 et5de la matrice extracellulaire. Glandes salivaires normales humains et rongeurs contiennent également des cellules T, macrophages et cellules dendritiques9, ainsi que les plasmocytes sécrétant des immunoglobulines A (IgA) dans la salive9,10. En raison de ses fonctions aux multiples facettes de la santé et la maladie, la SMG est un sujet d’intérêt pour plusieurs domaines de la recherche biologique, y compris la dentisterie4, immunologie11, oncologie12,8de la physiologie et biologie cellulaire 3.

Imagerie des processus cellulaires dynamiques et interactions est un outil puissant dans la recherche biologique13,14. Le développement des tissus profonds d’imagerie et d’innovations inmicroscopes basées sur l’optique non linéaire (NLO), qui reposent sur la diffusion ou l’absorption de photons multiples par l’échantillon, a permis d’examiner directement les processus cellulaires en tissus complexes13 ,15. Absorption des photons multiple implique la livraison de l’énergie d’excitation totale de photons de faible énergie, quelle excitation de fluorophore limites au plan focal et permet donc une pénétration plus profonde des tissus avec le photovieillissement réduite et le bruit extérieur de mise au point excitation13,15. Ce principe est employé par microscopie biphotonique (14:00) et permet l’imagerie des spécimens fluorescentes dans les profondeurs de jusqu'à 1 mm15,16. Tandis que disponible dans le commerce 14:00 configurations sont devenus faciles à utiliser et fiable, le défi majeur pour l’imagerie intravitale est soigneusement exposer et stabiliser l’organe cible des souris anesthésiés, surtout pour l’imagerie de la série de laps de temps. Plusieurs méthodes pour la correction de dérive numérique après acquisition de données ont été publiées le17,18 et nous avons récemment mis au point « VivoFollow », un système de correction automatique, qui neutralise les tissus lente dérive en temps réel en utilisant un informatisé étape19. Toutefois, il est toujours essentiel pour haute qualité d’imagerie pour minimiser le mouvement tissulaire, en particulier les mouvements rapides causés par la respiration ou de battements cardiaques19. Procédures de préparation et de stabilisation ont été publiés pour plusieurs organes, dont la moelle épinière20foie21, peau22, poumon23et ganglion24. En outre, les modèles pour l’imagerie des glandes salivaires de rat ont été développés3,25 et peaufinées pour intravitale imagerie à haute résolution de la murine que SMG adapté à un microscope inversé installation26, 27 , 28.

Nous présentons ici un protocole pratique et adaptable pour l’imagerie de la SMG murine intravitale à l’aide de la microscopie non linéaire verticale, qui est couramment utilisée pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie. À cette fin, nous avons modifié une scène largement indépendants immobilisation utilisée pour les préparations de ganglions poplités.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tout travail animal a été approuvé par le Comité Cantonal pour l’expérimentation animale et réalisé selon les lignes directrices fédérales.

1. anesthésier la souris

  1. Porter des équipements de protection individuelle, y compris les gants et blouse de laboratoire.
  2. Mélanger la kétamine, xylazine et une solution saline à une concentration de travail de 20 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement. Injecter le stock de travail par voie intrapéritonéale (i.p.) à 8-10 µL/g de souris. Replacez la souris dans la cage.
    Remarque : Ce protocole a été testé pour les souris mâles et femelles âgés de 6 à 40 semaines avec un fond de C57BL/6.
  3. Préparer la solution d’acépromazine à 2,5 mg/mL et injecter 30 µL i.p., 15 min après l’injection de kétamine-xylazine (75 µg/souris).
  4. Après 5 à 15 min, vérifier adéquate anesthésie et analgésie en contrôlant les réflexes, par exemple, réflexe de retrait de la patte ou le réflexe cornéen.
  5. Contrôle des réflexes environ toutes les 30 minutes pendant toute la durée de l’expérience. Injecter par voie sous-cutanée kétamine/xylazine 1,5 µL/g de souris, chaque 60 min ou le plus tôt si les réflexes sont positifs.
    Remarque : L’anesthésie par Inhalation comme l’isoflurane inutilisable avec ce protocole, en raison de la fixation de la souris.

2. Retirez la fourrure de la zone d’exploitation

  1. Utilisez un rasoir électrique pour raser une zone qui s’étend approximativement de 5 mm de caudale de la bouche vers les pattes de devant, qui s’étend sur les mâchoires vers les deux oreilles.
  2. Appliquer crème dépilatoire sur la zone rasée avec un coton-tige. Soigneusement et minutieusement retirer après 3 min, par exemple, en l’essuyant avec tissus humides.

3. fixer la souris sur la scène

Remarque : Ce protocole utilise une étape personnalisée (Figure 1) équipée avec deux supports librement réglables pour lamelles (un attaché à la scène avec une vis, l’autre fixé en permanence sur elle) ; « « « « barres d’oreilles stéréotaxique réglable ; une chaîne qui peut être serrée par une vis ; un métal librement réglable chauffage anneau ; et une zone surélevée désignée pour placer le torse de la souris. Cette étape est modifiée d’un stade de ganglions poplités, avec un titulaire stéréotaxique supplémentaire et un support pour la lamelle inférieure tenant le SMG extériorisé. Des plans détaillés ou des citations de la scène sont disponibles sur demande.

  1. Préparer la scène en enlevant les titulaires pour le cycle de chauffage et le titulaire de la lamelle couvre-objet amovible. Desserrer les vis d’oreille bar détenteurs et le titulaire de la lamelle couvre-objet fixe. Fixez un morceau de gaze à la zone centrale de la scène, servant comme litière pour la souris.
  2. Utiliser de la colle (voir Table des matières) pour fixer un couvercle en verre 20 mm de diamètre au sommet d’un support métallique cylindrique (ce sera le couvercle en verre inférieur). Coller un 25 mm couvercle en verre pour le fond du support plâtes (ce sera le couvercle en verre supérieur). Veiller à ce que les verres de couverture se chevauchent d’environ 2-3 mm avec supports métalliques et que le reste du verre reste libre de graisse et de colle.
  3. Placez la souris sur le dos sur la gaze, perpendiculaire à la corde tendue, avec la tête centrée entre les barres de l’oreille.
  4. Fixer les extrémités supérieures de la souris sur la scène avec ruban chirurgical.
  5. Ensuite, accrochez la chaîne dans les incisives supérieures avant et serrer jusqu'à ce que la mâchoire atteint une position horizontale. Utilisez une pince courbe inclinée pour tirez légèrement sur la langue de la bouche, ce qui facilite la respiration.
  6. Fermement, mais pas avec force, tirer la queue et le coller à la scène.
  7. Alignez les barres d’oreilles pour atteindre un angle d’environ 30° entre la barre et le bord de la scène. Pour assurer cet angle, utilisez une règle de triangle pour tracer un angle droit et gauche de 30° sur une feuille de papier et placer la scène transparente sur le papier pour aligner les détenteurs en conséquence.
  8. Fixer la mâchoire entre les barres d’oreilles en déplaçant simultanément la barre de gauche et de droite vers l’intérieur jusqu'à ce que la mâchoire est immobiles, puis serrer les vis. Observer les mouvements thoraciques avant, pendant et après la correction de la mâchoire. Réduction ou absence de respiration indique que les barres sont fixées au niveau du cou, pas les os de la mâchoire ; dans ce cas, répétez la procédure de fixation immédiatement.
  9. Assurer le chauffage à la souris, par exemple, en plaçant une lampe chauffante est proche ou un coussin chauffant sous la scène.

4. exposition chirurgicale de la glande salivaire à l’aide d’un stéréomicroscope

Remarque : Les étapes suivantes nécessitent l’utilisation d’un stéréomicroscope et fine pince ciseaux chirurgicaux. Étant donné que la procédure est en phase terminale, il n’est pas nécessaire de maintenir des conditions de fonctionnement stériles. Les instruments nettoyés éthanol suffisant.

  1. Localiser la position approximative du lobe droit SMG en recherchant un léger renflement dans la peau d’environ 15 mm de caudale de la bouche et médiale de 5 mm de la ligne de la mâchoire. Soulevez un pli de peau petit au centre des Ardennes et couper pour créer et ouverture d’environ 5 mm de longueur.
  2. Appliquer immédiatement un anneau de 4 mm de hauteur d’aspiration graisse sur la peau qui entoure la coupe. (Utilisez une seringue remplie de graisse sous vide avec une seringue hypodermique 25 G atténuée).
  3. Remplir l’anneau de la graisse avec une solution saline pour s’assurer que le tissu reste humide pendant l’opération.
  4. Sous le stéréomicroscope, perturber le tissu conjonctif en utilisant la procédure suivante : utiliser une pince fine pour tenir un morceau de tissu conjonctif directement attaché à la SMG et utilisez une deuxième pince pour tirer le tissu conjonctif distal jusqu'à ce qu’il se rompt. Veiller à ce que certains tissus conjonctifs reste attaché à la SMG ; C’est souhaitable car il permet la manipulation. Ne pas toucher la glande elle-même avec la pince, car cela va provoquer des saignements.
  5. Répétez ce mouvement de perturber le tissu conjonctif tout d’abord sur le dessus de la glande, puis sur la partie médiane (entre le lobe droit et gauche de la SMG). Ne pas dissocier la sublinguale de la glande sous-maxillaire.
  6. Continuer à retirer le tissu conjonctif latéral vers la gauche autour de la SMG (médial à caudales, en distal, à rostrale).
  7. Veiller à ce que l’approvisionnement en sang, vaisseaux lymphatiques efférents et conduit salivaire, qui sont tous situés dans un forfait sur le site crânien de la glande, ne sont pas s’est rompus.
  8. Une fois que le tissu conjonctif latéral est perturbé, utiliser pince à tirer sur le tissu conjonctif, attaché à l’extrémité caudale de la SMG vers le haut pour soulever l’extrémité caudale de la SMG. Perturber le tissu conjonctif sous le lobe SMG, à partir de la caudale et se dirige vers l’extrémité rostrale.
  9. Continuez jusqu'à ce que le tissu conjonctif à tous les sites de la SMG est supprimé (à l’exclusion du site rostral avec gros vaisseaux sanguins alimentation/vidange et le WD).

5. fixation de la glande

  1. Confirmer que la bague de graisse tenant la solution saline est au moins 4 mm de haut et pas une fuite (Voir l’étape 4.2).
  2. Installation du couvercle inférieur en verre (Voir l’étape 3.2) en attachant la barre métallique à son support réglable en hauteur. S’assurer que le titulaire de la lamelle couvre-objet est ajusté à la position maximum et ne touche pas l’anneau de graisse lorsqu’il est attaché à la scène. Positionner le support de la direction caudale à un angle d’environ 60° à la souris, avec la lamelle couvre-objet couvrant environ les deux tiers (parties caudales et distales) du lobe exposé. Abaisser le couvercle en verre jusqu'à ce qu’il entre en contact avec le gland.
  3. Terminer l’anneau de graisse sur le dessus du couvercle en verre pour former un nouveau réservoir de solution salin.
  4. Tirez doucement le lobe SMG sur le dessus de la lamelle couvre-objet avec une pince, seulement toucher le tissu conjonctif attaché à elle (l’orgue peut être retournée avec le site de bas vers le haut).
  5. Assurez-vous que l’anneau de la graisse a une même hauteur d’au moins 4 mm et ne fuit pas. Si nécessaire, remplir le réservoir de salin à l’aide d’un 30 G seringue remplie de solution saline.
  6. S’assurer que le titulaire de la lamelle couvre-objet pour le verre de couverture supérieur est dans sa position de plus grande. La vis permet de visser le support métallique avec le verre de couverture supérieure de 25 mm sur le titulaire. Utilisez les vis réglables du titulaire pour positionner le couvercle en verre de sorte que le SMG est centré dans le milieu.
  7. Utilisez les vis de support réglable pour abaisser le couvercle en verre haut, jusqu'à ce qu’elle touche directement la SMG. Observer la forme et la coloration de la glande au cours de cette étape. Si la surface de la glande apparaît plus grande, ou la coloration change (par exemple du rose au blanc), immédiatement mettre le couvercle en verre à un poste plus élevé pour soulager la pression sur la SMG.
  8. Vérifier le réservoir salin des fuites en recherchant les bulles d’air et ou des gouttes de solution saline à l’extérieur du réservoir. Si une bulle d’air ou de la fuite est détectée, retirer les lamelles et tout graisser et recommencer à l’étape 2.
  9. Vis de fermer toutes les vis de fixation.

6. fixation de l’anneau de chauffage et la sonde de température

  1. Insérer une sonde de température dans le réservoir et positionnez-le à proximité de la glande, puis le fil de la sonde sur la scène de la bande.
  2. Appliquer un anneau de graisse à la lamelle supérieure, avec le SMG dans le Centre (le diamètre de l’anneau de graisse doit correspondre au diamètre de l’anneau de chauffage). Placez l’anneau de chauffage sur le dessus de la lamelle couvre-objet et sceller avec de la graisse. Scotchez le tube de l’anneau de chauffage pour la scène.

7. imagerie

Remarque : Nous utilisons un système de microscope biphotonique vertical équipé d’un Laser accordable de Ti:Sa et d’un microscope à fluorescence avec objectifs immersion dans l’eau 20 X ou 25 X. Correction en temps réel de tissus dérive pendant l’acquisition peut être implémentée en utilisant une étape automatisée et VivoFollow19. Cela améliore la stabilité de l’acquisition d’images, mais il n’est pas nécessaire.

  1. Allumez le système de microscopie verticale à l’aide d’un logiciel approprié fourni par le fabricant de microscope. Régler le Laser Ti:Sa à une longueur d’onde d’excitation de nm 780-900.
  2. Raccordez le tuyau de chauffage à l’anneau de chauffage. Une pompe péristaltique circule l’eau chaude (chauffée en immergeant la partie du tube dans un bain d’eau de 80° C) dans l’anneau pour réchauffer la SMG.
  3. Connecter la sonde de température d’un thermomètre numérique. Régler la vitesse de la pompe péristaltique, si la température n’est pas entre 35-39 ° C. Plus vite la pompe fonctionne, obtient de l’objet le plus chaud et vice versa.
  4. Avant de commencer l’acquisition d’images, effectuer un contrôle visuel de la vitesse d’écoulement de sang. Vérifiez attentivement le passage de leucocytes dans les capillaires minces ou par injection de dextran fluorescent.
    NOTE : Dextran fluorescent injectée par voie intraveineuse immédiatement remplissent la vascularisation SMG ensemble lorsque le débit sanguin est physiologique. C’est pratiquement toujours le cas dans cette procédure.
  5. Pour suivre les cellules immunitaires, profondeur d’imagerie se situe habituellement entre 20-150 µm sous la surface de la SMG identifié par le signal de 2ème génération d’harmoniques. Piles d’image record de 150-300 µm de champ avec une résolution de pixels environ 512 x 512 ou supérieur et z-profondeurs de 20 à 60 µm avec un espacement de 2 à 4 µm entre les images. Répétez pile acquisition chaque 20-30 s pour une durée totale de 20 à 60 min.
  6. Le thermomètre numérique permettent de contrôler les niveaux de températures minimales et maximales après acquisition de la séquence d’une seule image. Jeter la séquence d’images, si la valeur minimale ou maximale n’est pas de l’ordre de 37 ° c ± 2 ° C. Remplissage de l’eau pour une immersion d’objectif entre les séquences d’images.
  7. À la fin de la séance d’imagerie, euthanasier les souris par asphyxie2 CO sous anesthésie.
    NOTE : Ceci est en accord avec les lignes directrices fédérales suisses de l’expérimentation animale ; autres lignes directrices d’euthanasie peuvent s’appliquer ailleurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ce protocole permet l’imagerie de presque l’ensemble côté dorsal ou ventral de la SMG. Généralement, le champ de vision inclut également la glande salivaire sublinguale, qui diffère légèrement de la SMG en composition cellulaire4. Les deux glandes sont encapsulées par collagène fibrillaire et divisés en lobes. La plupart 14:00 systèmes peuvent produire une image exempte d’étiquette de collagène fibrillaire en mesurant le signal harmonique 2nd , mais généralement les molécules fluorescentes sont nécessaires pour la visualisation des structures cellulaires et subcellulaires. Par exemple, omniprésente transgénique expression de la protéine fluorescente verte (GFP) en combinaison avec le signal harmonique 2nd est suffisante pour identifier des acini, conduits et les vaisseaux sanguins dans le SMG par leurs caractéristiques morphologiques. Cette configuration permet d’observer des marqueurs fluorescents transgéniques avec expression spécifique de type de cellule pour identifier les sous-ensembles spécifiques de cellules. La figure 2 illustre un réseau ofCOL1A1-GFP exprimant le journaliste fibroblastes cellules du tissu conjonctif. Également montré sont les vaisseaux sanguins, marqués par une injection intraveineuse d’un colorant fluorescent couplé au dextran de haut poids moléculaire. Le compartiment luminal des conduits peut aussi être étiqueté (Figure 3) lorsque le colorant est injecté le WD29retrogradually.

Figure 1
Figure 1 : Customized stade. (a et a *) deux supports librement réglables pour lamelles ; barres d’oreille stéréotaxique réglable (b et b *) ; (c) une chaîne qui peut être serrée par une vis ; (d) un métal librement réglable chauffage anneau ; (e) a soulevé la zone désignée pour placer le torse de la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Marqueur de vascularisation (rouge) et le réseau de cellules exprimant COL1A1-GFP (vert). Système vasculaire, marqué par une injection intraveineuse de conjugué de Texas Red-dextran (MW 70 kDa). Collagène fibrillaire entre deux lobes est visualisé comme signal harmonique 2nd (bleu). Montré est une z-projection unique de 15 images superposées avec 47 µm de profondeur. Echelle = 40 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Luminale conduit marqué après injection de WD. Marqué avec 70 kDa MW Texas Red-dextran (rouge), lumen conduit les vaisseaux sanguins étiquetés avec cascade bleu-dextran (blanc ; 10 kDa MW) par injection rétrograde à travers les WD et GFP Moutschen transféré+ CD8+ T (verts) de cellules dans le SMG. Illustré est une z-projection unique de 27 images superposées avec 50 µm de profondeur. Echelle = 40 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce protocole propose une approche simple pour l’imagerie in vivo des glandes salivaires sous-maxillaires et sublinguales murines microscopie non linéaire verticale souvent utilisés dans le domaine de l’immunologie. La méthode peut être adaptée pour l’imagerie des autres glandes exocrines dans la région de la tête et du cou. Par exemple, notre laboratoire a réaliser l’imagerie de la glande lacrymale de manière analogue (non illustrée).

Enlever le tissu conjonctif autour de la SMG est l’étape la plus critique du présent protocole, étant donné que les lésions tissulaires accidentel peuvent se produire. Dommage pour l’approvisionnement en sang principal de la SMG nécessite la cessation immédiate de l’expérience, car le tissu SMG devient hypoxique. Si le tissu SMG lui-même est endommagé, saignements généralement s’arrête naturellement par coagulation. Cependant, il faut considérer que la blessure déclenche une inflammation stérile et cytokines proinflammatoires libérer30, qui pourraient influencer la lecture expérimentale. Une complication plus fréquente, mais moins de critique au cours de la microchirurgie sont des fuites dans le réservoir de solution salin. Afin de minimiser la survenue de fuites, toujours appliquez de la graisse à la peau sèche et sans poils. Correction d’une fuite est habituellement inutile : au lieu de cela, retirez tout de la graisse, nettoyer la peau avec un coton-tige sec, puis remettez à partir de zéro.

Au cours de l’imagerie, une température proche de la température physiologique du corps doit être maintenue (environ 37 ° C pour le mâle et femelle C567BL/6 souris31). Étant donné que les hypo et hyperthermie altèrent sang écoulement32,33, on ne peut présumer une fonction physiologique de la SMG dans ces conditions. Cependant, nous avons n’observé aucune différence dans la circulation sanguine ou la motilité des lymphocytes T au cours de la petite (± 2 ° C), transitoire (< 5 min) les écarts de température optimale.

Minimiser le mouvement du tissu est essentiel pour la bonne qualité d’imagerie. Différents types de mouvement de tissu indésirable peuvent se produire et ont des causes typiques qui peuvent subir de dépannage. Tout d’abord, continu xyz-dérive est habituellement causée par la SMG dérive lentement dans sa position initiale par le biais du tissu conjonctif ci-joint. Cela se produit si le couvercle inférieur en verre a été installé trop élevée, sinon le tissu conjonctif autour de la SMG n’a été pas complètement perturbé. Deuxièmement, z-dérive lente et continue peut se produire si la température est instable. Dans ce cas soigneusement régler le chauffage et attendre que la température soit stable, environ 15 min avant l’imagerie. Enfin, pulsation tissulaire mouvement se produit lorsque la chambre saline n’est pas hermétiquement scellée. La pression s’accumule et libère dans la chambre saline avec chaque cycle respiratoire. En combinaison avec des fuites ou des bulles d’air, cela conduit à pulsations Ecoulements de fluides, qui se traduisent directement par le tissu de la SMG. Dans ce cas, le remontage du couvercle verres et chambre saline est la solution la plus fiable.

Le maximum d’imagerie profondeur dépend de la longueur d’onde d’excitation utilisée et les fluorophores utilisés. Comme dans pratiquement toutes les configurations d’imagerie intravitale, décalée vers le rouge des colorants ou des protéines fluorescentes qui peuvent être excitées avec grandes longueurs d’onde (900-1 100 nm) permettent des tissus plus profonds imagerie que colorants verts et excitation plus courte longueurs d’onde.

Le SMG a été utilisé comme organe de modèle pour les endo - et exocytose et membrane transformant3,27,28, infection34, auto-immunité11et de biologie tumorale12. En outre, il autorise de nombreuses formes de manipulation : colorants, composés pharmacologiques et les anticorps peuvent être livrés à la glande par l’intermédiaire de la circulation sanguine. Alternativement, le GSI peut être ciblé directement via la canulation de DEO, qui a été utilisé pour livrer des virus11, dextrans3, ADN25, colorants29ou agents pharmacologiques3.

Le champ d’imagerie intravital continue à bénéficier d’une boîte à outils sans cesse croissant de fluorescent génétique et biochimique, techniques d’étiquetage. Avancées en génie génétique fournissent des lignées de souris et de lignées cellulaires avec des marqueurs fluorescents sophistiqués. Exemples récents : étiquetage des sous-ensembles spécifiques de cellules (CD11c+ cellules35) ou les protéines du cytosquelette dynamiques (Lifeact36), et des marqueurs pour la cellule de suivi 37et des journalistes en temps réel des armes nucléaires translocation (NFAT38) ou calcium39de signalisation. Autres applications peuvent utiliser des sondes fluorescentes biochimiques, qui font ressortir les compartiments subcellulaires spécifiques (par exemple l’ADN liant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ainsi que les teintures de membrane lipophiles). La microscopie NLO moderne offre beaucoup de solutions possibles afin de mieux répondre aux questions expérimentales. Par exemple, l’imagerie biphotonique multiplexé a été développé pour augmenter fortement acquisition maximale vitesse40. Autres techniques offrent l’imagerie multiphoton exempte d’étiquette, génératrices de seconde ou de troisième harmonique de signaux15, soit par mesure de vibration de résonance caractéristique des molécules (cohérente anti-Stokes Raman scattering)41. Ainsi, lorsqu’il existent des procédures possible l’exposition des tissus et la stabilisation, les limites de conception expérimentale sont définies principalement par les ressources et la créativité de l’expérimentateur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par la Fondation National Suisse (FNS) projet grant 31003A_135649, 31003A_153457 et 31003A_172994 (pour JVS) et Leopoldina bourse 2011 DFP-16 (BS). Ce travail a bénéficié des configurations optiques du « Microscopie Imaging Center » (MIC) de l’Université de Berne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).

Tags

Immunologie et Infection numéro 135 Intravital imagerie souris modèle la microscopie multiphoton glandes salivaires l’analyse des réponses immunitaires adaptatives immunologie
Préparation du murin des glandes salivaires sous-maxillaires pour la microscopie intravitale verticale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B.,… More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter