Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Voorbereiding van lymfkliertest submandibulaire speekselklier rechtop Intravital microscopie

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven een protocol om operatief bloot en stabiliseren de lymfkliertest submandibulaire speekselklier voor intravital geschikt zijn met behulp van rechtop intravital microscopie. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen aan andere exocrine klieren van het hoofd en nek regio van muizen en andere kleine knaagdieren.

Abstract

De submandibulaire speekselklier (SMG) is één van de drie grote speekselklieren en is van belang voor veel verschillende velden van het biologisch onderzoek, met inbegrip van celbiologie, oncologie, tandheelkunde en immunologie. De SMG is een exocrine klier bestaat uit secretoire epitheliale cellen, myofibroblasts, endotheliale cellen, zenuwen en extracellulaire matrix. Dynamische cellulaire processen in de rat en muis SMG hebben eerder al beeld, meestal met behulp van omgekeerde multi foton microscoop systemen. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de chirurgische voorbereiding en stabilisatie van de lymfkliertest SMG in narcose muizen voor in vivo imaging met rechtop multi foton microscoop systemen. Wij presenteren representatieve intravital afbeelding sets van endogene en adoptively overgedragen fluorescerende cellen, met inbegrip van de etikettering van bloedvaten of speeksel buizen en tweede-harmonische generatie aan het visualiseren van fibrillar collageen. Kortom voorziet ons protocol chirurgische voorbereiding van muis speekselklieren in rechtop microscopie systemen, die vaak worden gebruikt voor intravital beeldvorming op het gebied van de immunologie.

Introduction

Speeksel is afgescheiden door klieren exocrine voedsel smeren, beschermen de mucosal oppervlakken van de mondelinge tractus en leveren van spijsverteringsenzymen evenals antimicrobiële stoffen1,2. Naast kleine speekselklieren afgewisseld in de mondelinge submucosa, zijn er drie bilaterale sets van grote klieren parotide, sublinguaal en submandibulaire, genoemd volgens hun locatie1,2. Piramide-vormige epitheliale cellen, georganiseerd in de kolf-vormige zakjes (acini) of demilunes die zijn omgeven door myoepithelial cellen en het membraan van een kelder, de sereuze en slijm componenten van speeksel1afscheiden. De smalle luminal ruimte van de acini-riolering in tussenliggende leidingen, die in gegroefde leidingen verenigen totdat ze tenslotte tot een enkele uitscheidingsmechanisme koker1 voegen. De belangrijkste uitscheidingsmechanisme buis van het SMG heet Wharton de koker (WD) en wordt geopend in de sublinguale caruncle3,4. De SMG epitheliale compartiment vertegenwoordigt daarom een zeer arborized structuur met spruitstuk terminal eindpunten, die lijkt op een bundel van druiven1,5,6. De SMG interstitium bestaat uit bloed- en lymfestelsel schepen ingesloten in bindweefsel7 met parasympathische zenuwen8 en5van de extracellulaire matrix. Normale menselijke en knaagdier speekselklieren bevatten ook T cellen, macrofagen en dendritische cellen9, evenals plasmacellen die afscheiden van immunoglobuline een (IgA) in het speeksel9,10. Als gevolg van haar veelzijdige functies bij gezondheid en ziekte is de SMG een onderwerp van belang voor veel toepassingsgebieden biologisch onderzoek, met inbegrip van de tandheelkunde4, immunologie11oncologie12, fysiologie8en celbiologie 3.

Beeldvorming van dynamische cellulaire processen en interacties is een krachtig hulpmiddel in biologisch onderzoek13,14. De ontwikkeling van diepe weefsel beeldvorming en innovaties inmicroscopes op basis van niet-lineaire optica (NLO), die vertrouwen op verstrooiing of absorptie van meerdere fotonen door het monster, mag heeft direct onderzoek cellulaire processen in complexe weefsels13 ,15. Absorptie van meerdere fotonen omvat de levering van de totale excitatie-energie door lage-energie fotonen, welke excitatie van de fluorophore grenzen aan het brandvlak en dus kunt dieper weefsel penetratie met verminderde photodamage en lawaai buiten de focus excitatie13,15. Dit beginsel is werkzaam bij twee-foton microscopie (2 PM) en zorgt voor de beeldvorming van fluorescerende modellen in de diepten van maximaal 1 mm15,16. Terwijl verkrijgbare 2 PM opstellingen zijn geworden, gebruiksvriendelijk en betrouwbaar, is de grote uitdaging voor intravital imaging zorgvuldig bloot en stabiliseren van het orgaan van de doelstelling van narcose muizen, vooral voor de beeldvorming van tijdreeksen komen te vervallen. Verschillende methoden voor digitale drift correctie na data-acquisitie hebben gepubliceerd17,18 en wij onlangs ontwikkelde "VivoFollow", een systeem van geautomatiseerde correctie, dat zacht weefsel drift in real-time met behulp van tegengaat een geautomatiseerde etappe19. Het is echter nog steeds van cruciaal belang voor hoge kwaliteit imaging om te minimaliseren van weefsel beweging, vooral snelle bewegingen veroorzaakt door ademhaling of hartslag19. Voorbereiding en stabilisatie procedures zijn gepubliceerd voor meerdere organen, met inbegrip van ruggenmerg20, lever21huid22, Long23en lymfeklier24. Bovendien, modellen voor rat speekselklier imaging zijn ontwikkelde3,25 en verder verfijnd voor hoge resolutie intravital beeldvorming van de RattenUitrustingen die SMG afgestemd op een omgekeerde Microscoop setup26, 27 , 28.

Hier presenteren we een praktische en flexibele protocol voor intravital beeldvorming van de lymfkliertest SMG met behulp van rechtop niet-lineaire microscopie, die meestal voor intravital beeldvorming op het gebied van de immunologie gebruikt wordt. Te dien einde bewerkt we een grote schaal werknemers immobilisatie stadium gebruikt voor popliteale lymfeklier preparaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke werk is goedgekeurd door de kantonnale Comité voor dier experimenten en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de federale.

1. anesthetize van de muis

  1. Draag persoonlijke beschermende uitrusting, met inbegrip van laboratoriumjas en handschoenen.
  2. Meng ketamine, xylazine en zout tot een concentratie van de werken van 20 mg/mL en 1 mg/mL, respectievelijk. Injecteer de werkende voorraad intraperitoneally (i.p.) bij 8-10 µL/g van muis. Plaats de muis terug in de kooi.
    Opmerking: Dit protocol is getest voor 6 - tot 40-week-oude mannelijke en vrouwelijke muizen met een achtergrond van C57BL/6.
  3. Bereid de oplossing acepromazine bij 2,5 mg/mL en injecteren 30 µL i.p., 15 min na de injectie van ketamine-xylazine (75 µg/muis).
  4. Na 5-15 min, controleren op voldoende verdoving en analgesie door te controleren voor de reflexen, bijvoorbeeld, terugtrekking reflex van de poot of hoornvlies reflex.
  5. Besturingselement voor reflexen ongeveer elke 30 min tijdens de gehele duur van het experiment. Subcutaan injecteren ketamine/xylazine op 1.5 µL/g van muis, iedere 60 min of eerder als reflexen zijn positief.
    Opmerking: Inademing verdoving zoals Isofluraan kan niet worden gebruikt met dit protocol, als gevolg van de vastlegging van de muis.

2. Verwijder de bont uit het operationele gebied

  1. Gebruik een elektrisch scheerapparaat te scheren een gebied dat wordt uitgevouwen ongeveer van 5 mm caudal van de mond naar de voorpoten, die zich uitstrekt over de kaken naar beide oren.
  2. Haar verwijdering room van toepassing op de geschoren gebied met een wattenstaafje. Zorgvuldig en grondig verwijderen na 3 min, bijvoorbeelddoor af te vegen met natte weefsels.

3. het vaststellen van de muis op het podium

Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van een aangepaste fase (Figuur 1) uitgerust met twee vrij instelbare houders voor cover slips (een aangesloten op het podium met een schroef, de andere vaste permanent op het); stereotactische instelbare balken; een tekenreeks, die kan worden aangescherpt met een schroef; een vrij instelbare metaal verwarming ring; en een verhoogde gebied aangewezen plaatsen van de romp van de muis. Deze etappe is gewijzigd vanaf een popliteale lymfeklier stadium, met een toegevoegde stereotactische houder en een steun voor de lagere dekking slip houden de exteriorized SMG. Gedetailleerde plannen of offertes van de etappe zijn beschikbaar op aanvraag.

  1. De fase voor te bereiden door het verwijderen van de houders voor de ring van de verwarming en de verwisselbare cover slip-houder. Draai de schroeven van de houders van de oor-bar en de vaste cover slip-houder. Tape een stuk gaas naar het midden gebied van het werkgebied, fungeren als strooisel voor de muis.
  2. Gebruik van lijm (Zie Tabel van materialen) aan Bevestig een 20 mm diameter cover glas aan de bovenkant van een cilindrische metalen houder (dit zal het lagere dekking glas). Lijm een glas cover 25 mm aan de onderkant van de platte metalen houder (dit zal het bovenste glas van de cover). Ervoor zorgen dat de glazen deksel ongeveer 2-3 mm met metalen houders overlappen en dat de rest van het glas blijft dan vrij van vet en lijm.
  3. Plaats de muis op zijn rug op het gaas, loodrecht op de uitgerekte tekenreeks, met het hoofd in het midden tussen de balken van het oor.
  4. De bovenste extremiteiten van de muis op het podium met chirurgische tape vast te stellen.
  5. Vervolgens haak de tekenreeks in de bovenste voorste snijtanden en draai tot de kaak een horizontale positie bereikt. Gebruik een schuine gebogen pincet iets terugtrekken van de tong uit de mond, dat vergemakkelijkt de ademhaling.
  6. Strak, maar niet krachtig, trekken de staart en tape naar het werkgebied.
  7. Hiermee lijnt u de balken van het oor om een hoek van ongeveer 30° tussen de bar en de rand van het werkgebied. Om ervoor te zorgen deze hoek, een driehoek liniaal gebruiken om te tekenen van een rechter- en linkerrand 30° hoek op een vel papier en plaats de doorzichtige fase op het papier te passen de houders daarvan in kennis.
  8. Los van de kaak tussen de balken van het oor door tegelijkertijd bewegen de balk links en rechts naar binnen totdat de kaak immotile is en draai schroeven. Observeren borst verkeer vóór, tijdens en na de vaststelling van de kaak. Verminderd of afwezig ademhaling geeft aan dat de balken worden opgelost bij de hals, niet het kaak-bot; in dit geval, herhaal de fixing procedure onmiddellijk.
  9. Verwarming geven met de muis, bijvoorbeelddoor het plaatsen van een lamp van de verwarming in de buurt en/of een verwarming pad onder het podium.

4. chirurgische blootstelling van de speekselklier met een stereomicroscoop

Opmerking: De volgende stappen vereisen het gebruik van een stereomicroscoop, fijne pincet en chirurgische scharen. Aangezien de procedure terminal, is het niet nodig om te handhaven van de steriele bedrijfsomstandigheden. Ethanol-gereinigd instrumenten volstaan.

  1. Zoek de benaderende positie van de juiste SMG kwab door op zoek naar een lichte verdikking in de huid, ongeveer 15 mm caudal van de mond en de 5 mm mediaal van de kaaklijn. Het heffen van een kleine huid vouw in het midden van de Ardennen en snijd het maken en openen van ongeveer 5 mm lengte.
  2. Breng onmiddellijk een 4 mm hoge ring van vacuüm vet op de huid rondom de cut. (Gebruik een vacuüm, vetgevuld spuit met een afgestompte 25 G hypodermische naald).
  3. Vul de vet-ring met zoutoplossing om ervoor te zorgen dat het weefsel vochtig blijft tijdens de operatie.
  4. Onder de stereomicroscoop, verstoren het bindweefsel met de volgende procedure: gebruik een fijne pincet om stevig vasthouden een stuk van bindweefsel die rechtstreeks zijn verbonden met de SMG, en gebruik een tweede Tang te trekken van de distale bindweefsel totdat het breuken. Zorgen dat sommige bindweefsel gekoppeld aan de SMG blijft; Dit is wenselijk omdat hierdoor behandeling. Raak de klier zelf met de Tang, niet omdat dit leiden bloeden tot zal.
  5. Herhaal deze beweging van het bindweefsel eerst verstoren, op de top van de klier, dan aan de mediale zijde (tussen de rechter en linker kwab van de SMG). U mag niet scheiden de sublinguale uit de submandibulaire klier.
  6. Verdergaat met het verwijderen van de laterale bindweefsel tegen de klok in rond de SMG (mediale aan caudal, naar distale, naar rostraal).
  7. Zorg ervoor dat de bloedtoevoer, efferent lymfatische, en speeksel buis, die allemaal in een bundel bij de Cranio-site van de klier liggen, zijn niet gescheurd.
  8. Zodra de laterale bindweefsel wordt verstoord, gebruik pincet te trekken het bindweefsel die verbonden is met de caudal eindpunt van de SMG omhoog te heffen caudal ultimo de SMG. Verstoren van het bindweefsel onder de SMG kwab, vanaf de caudal en richting van de rostraal einde.
  9. Totdat het bindweefsel op alle sites van de SMG is verwijderd (met uitzondering van de rostraal site met grote bloedvaten voeden/aftappen en de WD).

5. vaststelling van de klier

  1. Bevestigen dat de ring van de vet houden van de zoutoplossing ten minste 4 mm hoog en niet lekt is (zie stap 4.2).
  2. De lagere dekking glas (zie stap 3.2) installeren door de metalen staaf te hechten aan de in hoogte verstelbare houder. Ervoor zorgen dat de houder van de cover slip is aangepast aan de encryptie positie en niet de vet-ring raakt wanneer aangesloten op het podium. Plaats de houder uit de caudal richting onder een hoek van ongeveer 60° met de muis, met de cover slip die betrekking hebben op ongeveer tweederde (caudal en distale delen) van de blootgestelde kwab. Verlagen van het glas van de cover totdat het contact maakt met de klier.
  3. Voltooi de vet-ring op de top van het glas van de cover te vormen van een nieuwe zout reservoir.
  4. Trek voorzichtig de SMG kwab bovenop de cover slip met een tang, alleen het bindweefsel die eraan verbonden zijn aan te raken (het orgaan kan worden omgedraaid met de site van de onderkant naar boven).
  5. Zorgen ervoor dat de vet-ring een zelfs hoogte van ten minste 4 mm heeft en doet niet lekken. Eventueel bijvullen het zout reservoir met behulp van een 30 G syringe gevuld met zoutoplossing.
  6. Zorg ervoor dat de dekking glas-houder voor de bovenste cover glas in zijn ons standpunt. Gebruik de schroef de metalen houder met de 25 mm bovenste cover glas hechten aan de houder. Gebruik de verstelbare schroeven van de houder om de positie van het cover-glas zodat de SMG wordt gecentreerd in het midden.
  7. Gebruik de schroeven van instelbare houder te verlagen van het bovenste glas cover totdat het rechtstreeks contact op met de SMG. Let op de vorm en de kleur van de klier tijdens deze stap. Als de klier oppervlakte wordt groter weergegeven, of de kleur (bijvoorbeeld van roze tot wit), onmiddellijk wijzigt zet de dekking glas naar een hogere positie voor het verlichten van de druk op de SMG.
  8. Controleer het zout reservoir voor lekken door op zoek naar luchtbellen en of druppels van de zoutoplossing buiten het reservoir. Als een zeepbel lek of door de lucht wordt gedetecteerd, verwijdert u zowel cover slips en alle vet en opnieuw vanaf stap 2.
  9. Schroef sluiten alle fixatieschroeven.

6. vaststelling van de verwarming Ring en temperatuursonde

  1. Steek een temperatuursonde in het reservoir en positie het dicht bij de klier en tape van de draad van de sonde naar het werkgebied.
  2. Een ring van vet toepassen op de top cover slip, met de SMG in het midden (de diameter van de ring van vet moet overeenkomen met de diameter van de ring verwarming). Plaats de ring Verwarming op de top van de cover slip en verzegelen met vet. Tape de buizen van de verwarming ring naar het werkgebied.

7. imaging

Opmerking: Wij gebruiken een rechtop twee-foton microscoop systeem uitgerust met een Laser Ti:Sa afstembare en een fluorescente microscoop met water-onderdompeling 20 X of 25 X doelstellingen. Real-time correctie van weefsel drift tijdens overname kan worden geïmplementeerd met behulp van een geautomatiseerde fase en VivoFollow19. Dit verbetert de stabiliteit van Beeldacquisitie, maar is niet vereist.

  1. Hiermee zet u de rechtop microscopie system met behulp van een geschikte software geleverd door de fabrikant van de Microscoop. Het afstemmen van de Laser van de Ti:Sa bij een golflengte van 780-900 nm excitatie.
  2. Sluit de slang verwarming aan de ring Verwarming. Een peristaltische waterpomp circuleert warm water (verwarmd door dompelen deel van de slang in een waterbad van 80° C) door de ring te warmen de SMG.
  3. De temperatuursonde verbinden met een digitale thermometer. Pas de snelheid van de peristaltische pomp als de temperatuur niet tussen 35-39 ° C. Hoe sneller de pomp werkt, hoe warmer het object krijgt, en vice versa.
  4. Voordat u begint Beeldacquisitie, voer een visuele controle van de stroomsnelheden van het bloed. Controleer zorgvuldig leukocyte passage door de dunne haarvaten of door fluorescerende dextran injectie.
    Opmerking: Intraveneus ingespoten fluorescerende dextran zal onmiddellijk invullen de hele SMG therapieën doorbloeding is fysiologisch. Dit is vrijwel altijd het geval is in deze procedure.
  5. Volg immuuncellen en is imaging diepte gewoonlijk tussen 20-150 µm onder het oppervlak van het SMG geïdentificeerd door het signaal van de harmonische generatie 2nd . Record afbeeldingsstapels van 150-300 µm gezichtsveld met pixelresolutie van ongeveer 512 x 512 of hoger, en z-dieptes van 20-60 µm met afstand van 2-4 µm tussen afbeeldingen. Herhaal stapel overname elke 20-30-s voor een totale duur van 20-60 min.
  6. Gebruik de digitale thermometer om de minimale en maximale temperatuurniveaus na verwerving van één Afbeeldingsvolgorde. De beeldenreeks negeren als het minimum of het maximum niet in het bereik van 37 ± 2 ° C. Het bijvullen van het water voor onderdompeling van doelstelling tussen afbeeldingsreeksen.
  7. Aan het einde van de imaging-sessie, euthanaseren de muizen door CO2 verstikking onder verdoving.
    Nota: Dit is in overeenstemming met Zwitserse federale richtsnoeren van dierproeven; andere richtsnoeren voor euthanasie kunnen elders toepassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol staat beeldvorming van bijna de gehele dorsale of ventrale zijde van de SMG. Het gezichtsveld bevat meestal ook de sublinguale speekselklier, die enigszins van het SMG in cellulaire samenstelling4 verschilt. Beide klieren zijn ingekapseld door fibrillar collageen en verdeeld in lobben. Meeste 2 PM systemen kunnen een label-vrij beeld van fibrillar collageen produceren door het meten van de harmonische 2nd -signaal, maar meestal fluorescerende moleculen voor visualisatie van cellulaire en subcellular structuren nodig zijn. Bijvoorbeeld, is alomtegenwoordige transgene uitdrukking van groen fluorescent proteïne (GFP) in combinatie met de 2nd harmonische signaal voldoende om te identificeren acini, buizen en bloedvaten in de SMG door hun morfologische kenmerken. Deze setup kan worden gebruikt voor het observeren van transgene fluorescente markeringen met cel type-specifieke expressie te identificeren specifieke cel subsets. Figuur 2 toont een netwerk ofCOL1A1-GFP verslaggever-uiten fibroblast-achtige cellen van het bindweefsel. Vertoond zijn bloedvaten, gelabeld door intraveneuze injectie van een fluorescente kleurstof gekoppeld aan ultrahoog moleculair gewicht dextran. Het luminal compartiment van de leidingen kan ook worden aangeduid (Figuur 3) wanneer de kleurstof retrogradually wordt geïnjecteerd in de WD29.

Figure 1
Figuur 1 : Aangepast fase. (a en a *) twee vrij instelbare houders voor cover enten; (b en b *) stereotactische instelbare balken; (c) een tekenreeks, die kan worden aangescherpt met een schroef; (d) een vrij instelbare metaal verwarming ring; (e) verhoogde gebied aangewezen plaatsen van de romp van de muis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Therapieën marker (rood) en netwerk van COL1A1-GFP waarin cellen (groen). Therapieën aangeduid door intraveneuze injectie van Texas Red-dextran geconjugeerde (MW 70 kDa). Fibrillar collageen tussen twee kwabben is gevisualiseerd als het 2nd harmonische signaal (blauw). Een enkele z-projectie van 15 gestapelde beelden met diepte van 47 µm wordt getoond. Schaal bar = 40 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Luminal duct label na injectie van WD. Bloedvaten aangeduid met 70 kDa-MW Texas Red-dextran (rood), koker lumen aangeduid met trapsgewijze blauw-dextran (wit; 10 kDa MW) via retrograde injectie door de WD en adoptively overgedragen GFP+ CD8+ T cellen (groen) in de SMG. Getoond is een enkele z-projectie van 27 gestapelde afbeeldingen met 50 µm diepte. Schaal bar = 40 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol biedt een eenvoudige benadering voor in vivo imaging van lymfkliertest submandibulaire en sublinguale speekselklieren met behulp van rechtop niet-lineaire microscopie vaak gebruikt op het gebied van de immunologie. De methode kan worden aangepast voor de beeldvorming van andere exocrine klieren in het hoofd en de nek regio. Bijvoorbeeld, heeft ons lab beeldvorming van de traanklier uitgevoerd op een soortgelijke wijze (niet afgebeeld).

Het verwijderen van het bindweefsel rond de SMG is de meest kritische stap van dit protocol, aangezien onopzettelijke weefselbeschadiging kan optreden. Schade aan de voornaamste bloedtoevoer van het SMG vereist onmiddellijke beëindiging van het experiment, omdat het weefsel SMG hypoxische zal worden. Als de SMG weefsel zelf beschadigd is, meestal bloeden stopt natuurlijk door coagulatie. Het moet echter worden nagegaan dat de schade steriele ontsteking veroorzaakt en proinflammatoire cytokines vrij30, die invloed kunnen zijn op de experimentele uitlezing. Een meer gemeenschappelijke, maar minder kritische complicatie tijdens de microchirurgie zijn lekken in het zoute reservoir. Om te minimaliseren van het voorkomen van lekken, toepassing altijd vet op droge, kale huid. Het patchen van een lek is meestal zinloos: in plaats daarvan, verwijdert u alle van het vet, de huid met een droge wattenstaafje schoon en opnieuw vanaf nul.

Tijdens het imaging, moet een temperatuur dichtbij de fysiologische lichaamstemperatuur worden gehouden (ongeveer 37 ° C voor mannelijke en vrouwelijke C567BL/6 muizen31). Aangezien zowel hypo- en hyperthermie bloed stroom32,33 veranderen, fysiologische functie van het SMG kan niet worden aangenomen dat onder deze omstandigheden. Wij merkte echter geen verschil in de bloedstroom of de beweeglijkheid van de T cel tijdens kleine (± 2 ° C), van voorbijgaande aard (< 5 min) afwijkingen van de optimale temperatuur.

Minimaliseren van weefsel beweging is essentieel voor goede kwaliteit van de beeldvorming. Verschillende soorten ongewenste weefsel beweging kunnen optreden, en typische oorzaken die kunnen ondergaan bij het oplossen van problemen hebben. Ten eerste, continu xyz-drift wordt meestal veroorzaakt door de SMG langzaam terug in de oorspronkelijke positie via bijgevoegde bindweefsel drijven. Dit gebeurt als de lagere dekking glas te hoog werd geïnstalleerd, of het bindweefsel rond de SMG was niet grondig verstoord. Ten tweede, langzaam en continu z verwaaiing kan optreden als de temperatuur instabiel is. In dit geval zorgvuldig aanpassen van de verwarming en wacht tot de temperatuur stabiel, ongeveer 15 minuten vóór imaging. Ten slotte, pulserende beweging van het weefsel gebeurt wanneer de zoute kamer is niet strak verzegeld. Druk opbouwt en releases in de zoute zaal met elke ademhaling cyclus. In combinatie met lekken of luchtbellen leidt dit tot pulserende vloeibare stromen, die rechtstreeks naar het weefsel SMG vertalen. In dit geval is opnieuw samenstellen van zowel de cover bril en zoute kamer de meest betrouwbare oplossing.

De maximale diepte imaging hangt af van de golflengte van de excitatie gebruikt en de fluorophores werkzaam. Zoals in vrijwel alle intravital imaging opstellingen, rood-verschoven kleurstoffen of fluorescente proteïnen die kunnen worden opgewekt met lange golflengten (900-1100 nm) voorzien in diepere weefsels imaging dan groene kleurstoffen en kortere excitatie golflengten.

De SMG is gebruikt als model orgel voor endo - exocytose en membraan remodelleren3,27,28, infectie34, autoimmuniteit11en tumor biologie12. Hierdoor verder vele vormen van manipulatie: kleurstoffen, farmacologische stoffen en antilichamen kunnen worden afgeleverd bij de klier via de bloedstroom. Als alternatief kan de SMG worden gericht rechtstreeks via de cannulation van de WD, die is gebruikt voor het leveren van virus11, dextrans3, DNA25, kleurstoffen29of farmacologische agenten3.

Het intravital imaging veld blijft om te profiteren van een steeds groter wordende gereedschapskist van genetische en biochemische TL labeling technieken. Vooruitgang in de gentechnologie voorzien van muis lijnen en cellijnen verfijnde fluorescente markeringen. Recente voorbeelden zijn etikettering van specifieke cel deelverzamelingen (CD11c+ cellen35) of dynamische cytoskeletal eiwitten (Lifeact36), photoconvertible markers voor cel bijhouden van 37en real-time verslaggevers van nucleaire translocatie (NFAT38) of calcium signalering van39. Fluorescerende biochemische sondes, die wijzen op specifieke subcellular compartimenten (zoals de DNA-bindende 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of de lipofiele membraan kleurstoffen) kan door andere toepassingen worden gebruikt. Moderne NLO microscopie biedt veel mogelijke oplossingen best de experimentele om vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld, is multiplexed twee-foton imaging ontwikkeld om maximale overname snelheid40sterk te verhogen. Andere technieken bieden label-vrije multiphoton imaging, genereren tweede of derde harmonische signalen15, of door het meten van de karakteristieke resonantie trilling van de moleculen (coherent anti-Stokes Raman verstrooiing)41. Dus, wanneer mogelijk procedures voor weefsel blootstelling en stabilisatie beschikbaar zijn, de grenzen van de proefopzet worden meestal ingesteld door de middelen en de creativiteit van de experimentator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Zwitserse nationale Stichting (SNF) project subsidie 31003A_135649, 31003A_153457 en 31003A_172994 (voor JVS) en Leopoldina fellowship LPDS 2011-16 (aan BS). Dit werk profiteerden van optische opstellingen van het "microscopie Imaging Center" (MIC) van de Universiteit van Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45, (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117, (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53, (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133, (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44, (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108, (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189, (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10, (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2, (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28, (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297, (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108, (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216, (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10, (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46, (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38, (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13, (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5, (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7, (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25, (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34, (9), 642-650 (2003).
Voorbereiding van lymfkliertest submandibulaire speekselklier rechtop Intravital microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter