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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57283
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur chirurgisch freizulegen und Stabilisierung der murinen mandibulären Speicheldrüse intravitalen Bildgebung mit aufrechten intravitalen Mikroskopie. Dieses Protokoll ist leicht anpassbar an anderen therapeutisches Drüsen von Kopf und Hals-Bereich der Mäuse und andere kleine Nagetiere.

Abstract

Die submandibulären Speicheldrüse (SMG) ist eines der drei großen Speicheldrüsen und ist von Interesse für viele verschiedene Bereiche der biologischen Forschung, einschließlich der Zelle Biologie, Zahnmedizin, Onkologie und Immunologie. Die SMG ist ein therapeutisches Drüse bestehend aus sekretorische Epithelzellen, Myofibroblasts endothelial Zellen, Nerven und extrazelluläre Matrix. Dynamische zelluläre Prozesse in der Ratte und Maus SMG haben zuvor abgebildet, meist mit Multi-Photonen Mikroskopsystemen invertiert. Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll für die chirurgische Vorbereitung und Stabilisierung der murinen SMG im narkotisierten Mäuse für in-Vivo Bildgebung mit aufrechten Multi-Photonen Mikroskopsysteme. Wir präsentieren repräsentative intravitalen Bildsätze endogener und adoptively übertragen fluoreszierende Zellen, einschließlich der Kennzeichnung von Blutgefäßen oder Speichel Kanäle und zweite harmonische Generation Fibrillären Kollagen zu visualisieren. Zusammenfassend lässt sich sagen ermöglicht unser Protokoll chirurgische Vorbereitung der Maus Speicheldrüsen in aufrechte Mikroskopiesysteme, die üblicherweise für intravitalen Bildgebung auf dem Gebiet der Immunologie verwendet werden.

Introduction

Speichel abgesondert durch therapeutisches Drüsen zu essen zu schmieren, schützen die Schleimhaut-Oberflächen des oralen Traktes und liefern Verdauungsenzyme sowie antimikrobielle Substanzen1,2. Neben kleinen Speicheldrüsen in der mündlichen Submukosa durchsetzt gibt es drei bilaterale Sätze von großen Drüsen als Parotis, sublinguale und submandibulären, entsprechend ihrer Lage1,2. Pyramidenförmige Epithelzellen in Kolben-förmigen Säcke (Azini) organisiert oder Lünetten, die myoepithelialen Zellen und einer Basalmembran umgeben sezernieren die serösen und Schleimhaut Komponenten der Speichel1. Die engen luminalen Raum der Azini Gullys in eingefügten Leitungen, die in gekerbten Leitungen zu verbinden, bis sie schließlich in einem einzigen ausführungsgang1teilnehmen. Die wichtigsten ausführungsgang von der SMG heißt Wharton Rohr (WD) und mündet in die sublingual Karunkel3,4. Das SMG epitheliale Fach stellt daher eine stark verzweigten Struktur mit vielfältigen terminal Endpunkte, ähnlich wie ein Bündel Trauben1,5,6. Die SMG Interstitium besteht aus Blut und lymphatische Behälter eingebettet in Bindegewebe7 , die parasympathischen Nerven8 und extrazelluläre Matrix5enthalten. Normale menschliche und Nagetier Speicheldrüsen enthalten auch T-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen9, sowie Plasmazellen, die Immunglobulin absondern (IgA) in den Speichel9,10. Die SMG ist aufgrund seiner vielfältigen Funktionen in Gesundheit und Krankheit ein Thema von Interesse für viele Bereiche der biologischen Forschung, einschließlich Zahnmedizin4, Immunologie11, Onkologie12, Physiologie8und Zellbiologie 3.

Bildgebung der dynamische zelluläre Prozesse und Wechselwirkungen ist ein mächtiges Werkzeug in der biologischen Forschung13,14. Die Entwicklung der Tiefenmassage Bildgebung und Innovationen Inmicroscopes basierend auf nichtlineare Optik (NLO), die Streuung und Absorption von mehreren Photonen durch die Probe verlassen, darf direkt zelluläre Prozessen in komplexen Gewebe13 untersuchen ,15. Absorption von mehreren Photonen umfasst die Lieferung von insgesamt Anregungsenergie von niederenergetischen Photonen, welche Grenzen Fluorophor Erregung auf der Brennebene und somit tieferes Gewebe eindringen mit reduzierten lichtbedingten und Lärm von außerhalb der Fokus Erregung13,15. Dieses Prinzip wird durch die zwei-Photonen-Mikroskopie (14:00) eingesetzt und ermöglicht die Abbildung von fluoreszierenden Proben in Tiefen von bis zu 1 mm15,16. Während handelsübliche 14:00, die Setups benutzerfreundlich und zuverlässig geworden sind, ist die größte Herausforderung für die intravitalen Bildgebung sorgfältig setzen und stabilisieren das Zielorgan der narkotisierten Mäuse, vor allem für die Darstellung von Time-Lapse-Serie. Mehrere Methoden für digitale Drift-Korrektur nach der Datenerfassung wurden veröffentlicht17,18 und wir vor kurzem entwickelt "VivoFollow", eine automatische Korrektur-System, die langsame Gewebe Drift in Echtzeit mit entgegenwirkt ein computerisierte Stufe19. Es ist jedoch nach wie vor kritisch für hochwertige Bildgebung zur Minimierung von Gewebe Bewegung, vor allem schnelle Bewegungen, die durch Atmung oder Herzschlag19. Vorbereitung und Stabilisierung Verfahren wurden für mehrere Organe, einschließlich Rückenmark20, Leber21Haut22, Lungen-23und Lymphknoten24veröffentlicht. Darüber hinaus Modelle für die Ratte Speicheldrüse Bildgebung weiter verfeinert für hochauflösende intravitalen Bildgebung der Murine SMG auf einem inversen Mikroskop Setup26, zugeschnitten und wurden entwickelten3,25 27 , 28.

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische und anpassungsfähige Protokoll für intravitalen Bildgebung der murinen SMG mit aufrechten nichtlineare Mikroskopie, die häufig zur intravitalen Bildgebung auf dem Gebiet der Immunologie dient. Zu diesem Zweck haben wir eine weithin eingesetzten Immobilisierung Bühne für popliteal Lymphknoten Vorbereitungen verwendet geändert.

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Protocol

Alle tierische Arbeit wurde für Tier-Experimente von der kantonalen Ausschuss genehmigt und nach Richtlinien des Bundes durchgeführt.

1. Betäuben der Maus

  1. Persönlichen Schutzausrüstung, einschließlich Kittel und Handschuhe zu tragen.
  2. Vermischen Sie Ketamin, Xylazin und Saline, eine arbeiten-Konzentration von 20 mg/mL und 1 mg/mL bzw.. Den Arbeit bestand intraperitoneale Injektion (i.p.) 8-10 µL/g der Maus. Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in den Käfig.
    Hinweis: Dieses Protokoll wurde für 6 bis 40 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen C57BL/6 Hintergrund getestet.
  3. Bereiten Sie die Acepromazine Lösung bei 2,5 mg/mL und injizieren Sie 30 µL i.p, 15 min nach der Injektion von Ketamin-Xylazin (75 µg/Maus) zu.
  4. Nach 5-15 min für ausreichende Anästhesie und Analgesie durch controlling für Reflexe, z.B., Rückzug Reflex der Pfote oder Hornhaut Reflex überprüfen.
  5. Steuerung für Reflexe ca. alle 30 Minuten während der gesamten Dauer des Experiments. Subkutan injizieren Ketamin/Xylazin 1,5 µL/g der Maus, alle 60 min. oder früher wenn Reflexe sind positiv.
    Hinweis: Inhalation Anästhesie wie Isofluran kann mit diesem Protokoll durch die Fixierung der Maus verwendet werden.

2. entfernen Sie das Fell aus dem operativen Bereich

  1. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierapparat rasieren eine Fläche, die ungefähr von 5 mm im Mund in Richtung der Vorderbeine, erstreckt sich über die Backen auf beiden Ohren kaudalen erweitert.
  2. Haarentfernungs-Creme auf den rasierten Bereich mit einem Wattestäbchen anwenden Sorgfältig und gründlich nach 3 min, z. B.durch Abwischen mit einem feuchten Gewebe zu entfernen.

3. Befestigen Sie die Maus auf der Bühne

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine benutzerdefinierte Stufe (Abbildung 1) ausgestattet mit zwei frei einstellbare Halter für Abdeckung rutscht (eines auf der Bühne mit einer Schraube befestigt, das andere es dauerhaft befestigt); Einstellbare Stereotaktische Ohr Bars; ein String, der mit einer Schraube festgezogen werden kann; eine frei einstellbare Metall Ring Heizung; und ein erhöhter Bereich bezeichnet, den Torso der Maus platzieren. Diese Etappe wird aus einem popliteal Lymphknoten Stadium, mit einem zusätzlichen Stereotaktische Halter und eine Unterstützung für den unteren Deckglas halten die exteriorized SMG geändert. Detaillierte Pläne oder Zitate von der Bühne sind auf Anfrage erhältlich.

  1. Bereiten Sie die Bühne, indem die Halterungen für die Heizung-Ring und der abnehmbare Deckglas Inhaber. Lösen Sie die Schrauben der Inhaber der Ohr-Bar und dem Inhaber der festen Deckglas. Kleben Sie ein Stück Gaze auf die mittleren Bereich der Bühne, als Einstreu für die Maus.
  2. Leim zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), eine 20 mm-Durchmesser-Deckglas an die Spitze der zylindrischen Metallhalterung befestigen (Dies wird die untere Abdeckung Glas sein). Kleben Sie eine 25 mm-Deckglas auf den Grund der flachen Metallhalterung (Dadurch werden die oberen Deckglas). Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser ca. 2-3 mm mit Metall Halterungen überlappen und der Rest des Glases frei von Fett und Kleber bleibt.
  3. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken auf die Gaze, senkrecht auf die gespannten Saite mit dem Kopf zwischen den Ohr-Balken zentriert.
  4. Fixieren Sie die oberen Extremitäten von der Maus auf die Bühne mit chirurgischen Klebeband.
  5. Danach hängen Sie die Zeichenfolge in der oberen vorderen Schneidezähne und ziehen Sie an, bis die Kiefer eine horizontale Position erreicht. Verwenden Sie eine abgewinkelte gebogenen Pinzette leicht Herausziehen der Zunge aus dem Mund, die Atmung erleichtert.
  6. Straff, aber nicht gewaltsam ziehen Sie die Rute und kleben Sie es auf die Bühne.
  7. Richten Sie die Ohr-Balken um einen Winkel von etwa 30° zwischen der Bar und dem Rand der Bühne zu erreichen. Um diesen Winkel zu gewährleisten, verwenden Sie ein Lineal Dreieck einen rechten und linken 30° Winkel auf ein Blatt Papier zeichnen, und legen Sie die transparente Bühne auf dem Papier Inhaber entsprechend ausrichten.
  8. Die Kiefer zwischen den Balken Ohr, indem Sie die Links und rechts Balken gleichzeitig verschieben, nach innen, bis die Kiefer unbewegten ist zu beheben, und Schrauben anziehen. Beobachten Sie Brust Bewegung vor, während und nach der Fixierung des Kiefers. Verringert oder abwesend Atmung zeigt an, dass die Bars am Hals, nicht den Kieferknochen; befestigt sind in diesem Fall wiederholen Sie die Befestigung sofort.
  9. Bieten Sie Heizung der Maus, z.B.indem man eine Wärmelampe in der Nähe und/oder ein Heizkissen unter die Bühne.

4. chirurgische Exposition von der Speicheldrüse mit einem Stereomikroskop

Hinweis: Die folgenden Schritte erfordern die Verwendung eines Stereomikroskops, feine Pinzette und chirurgische Scheren. Da die Prozedur terminal ist, ist es nicht notwendig, sterile operativen Bedingungen beizubehalten. Äthanol gereinigt Instrumente genügen.

  1. Suchen Sie die ungefähre Position des rechten SMG Lappen von der Suche nach eine leichte Wölbung in der Haut der Mund und die 5 mm Medial an der Kieferlinie kaudalen ca. 15 mm. Heben Sie eine kleine Hautfalte in der Mitte der Wölbung und schneiden Sie es erstellen und Öffnen von etwa 5 mm Länge.
  2. Sofort wenden Sie ein 4 mm hohen Ring aus Vakuum Fett auf der Haut rund um den Schnitt an. (Verwenden Sie eine Vakuum Fett gefüllte Spritze mit einer abgestumpften 25 G Injektionsnadel).
  3. Füllen Sie die Fett-Ring mit Kochsalzlösung um sicherzustellen, dass das Gewebe während des Betriebes feucht bleibt.
  4. Unter dem Stereomikroskop stören das Bindegewebe, die mithilfe des folgenden Verfahrens: eine feine Pinzette verwenden, um ein Stück des Bindegewebes, die direkt an die SMG befestigt fest zu halten, und eine zweite Zange das distale Bindegewebe ziehen bis es platzt. Sicherstellen Sie, dass einige Bindegewebe an der SMG bleibt; Dies ist wünschenswert, da es Handhabung ermöglicht. Berühren Sie die Drüse selbst mit der Zange nicht, da dies zu Blutungen führt.
  5. Wiederholen Sie diese Bewegung Bindegewebe zunächst auf die Drüse, dann auf der medialen Seite (zwischen der rechten und linken Lappen von der SMG) zu stören. Trennen Sie die sublinguale nicht von der mandibulären Drüse.
  6. Weiterhin das seitliche Bindegewebe gegen den Uhrzeigersinn um die SMG (medial kaudalen, nach distal, rostral) zu entfernen.
  7. Stellen Sie sicher, dass das Blut-Versorgungsmaterial, ableitenden Lymphbahnen und Speichel gelegt werden, die sich alle in einem Bündel am kranialen Standort der Drüse befinden, nicht zerrissen werden.
  8. Sobald das seitliche Bindegewebe gestört ist, verwenden Sie Zange um das Bindegewebe am kaudalen Ende von der SMG nach oben zu heben Sie kaudalen Ende der SMG ziehen. Stören das Bindegewebe unterhalb der SMG-Lappen, der kaudalen ab und in Richtung rostral Ende.
  9. Fortgesetzt, bis das Bindegewebe zu allen Sehenswürdigkeiten von der SMG entfernt wird (mit Ausnahme der rostral Website mit großen Fütterung/Entleerung Blutgefäße und die WD).

5. Befestigung der Drüsenkörpers

  1. Bestätigen Sie, dass die Fett-Ring hält die Kochsalzlösung mindestens 4 mm hoch und nicht undicht (siehe Punkt 4.2).
  2. Installieren Sie die untere Abdeckung Glas (siehe Punkt 3.2) durch die Metallschiene in der Höhe verstellbare Halterung anbringen. Sicherstellen Sie, dass der Deckglas-Halter sich an die oberste Position passt und nicht die Fett-Ring berührt, wenn auf der Bühne befestigt. Positionieren Sie die Halterung aus der kaudalen Richtung am mit der Maus einen Winkel von ca. 60° das Deckglas abdecken rund zwei Drittel (kaudalen und distalen Teile) von der freiliegenden Lappen. Das Deckglas zu senken, bis es nimmt Kontakt mit der Drüse.
  3. Füllen Sie die Fett-Ring auf das Deckglas, ein neue saline Reservoir zu bilden.
  4. Ziehen Sie vorsichtig die SMG Lappen auf das Deckglas mit Zangen, nur das Bindegewebe befestigt, um es zu berühren (die Orgel kann mit der unteren Seite nach oben gekippt werden).
  5. Sicherstellen Sie, dass die Fett-Ring eine sogar Höhe von mindestens 4 mm hat und nicht auslaufen. Bei Bedarf Nachfüllen der saline Reservoir mit einer 30 G Spritze mit Kochsalzlösung gefüllt.
  6. Sicherstellen Sie, dass der Deckglas Halter für das obere Deckglas in seine höchste Position. Verwenden Sie die Schraube Metallhalter mit dem 25 mm oberen Deckglas an den Halter zu befestigen. Verwenden Sie die Stellschrauben des Inhabers, um das Deckglas zu positionieren, so dass die SMG in der Mitte zentriert ist.
  7. Verwenden Sie die Schrauben der verstellbaren Halterung der obere Deckglas zu senken, bis sie direkt Kontakt mit die SMG. Beobachten Sie die Form und Färbung der Drüse während dieses Schritts. Wenn die Drüse Fläche größer erscheint, oder die Färbung (zum Beispiel von Rosa bis weiß), sofort ändert legte das Deckglas in eine höhere Position zu entlasten der SMG.
  8. Überprüfen Sie die saline Reservoir auf Dichtheit durch suchen und Luftblasen oder Tropfen Kochsalzlösung außerhalb der Behälter. Wenn eine Leck oder Luft Blase erkannt wird, entfernen Sie Deckel rutscht und alles Fett und starten Sie ab Schritt 2.
  9. Schraube schließen alle Befestigungsschrauben.

6. Festsetzung der Ring Heizung und Temperaturfühler

  1. Einfügen Sie einen Temperaturfühler in das Reservoir und positionieren Sie es in der Nähe der drüsenkörpers, dann kleben Sie die Sonde Draht auf die Bühne.
  2. Gelten Sie einen Fett-Ring für den oberen Deckglas mit der SMG in der Mitte (Durchmesser des Ringes Heizung sollte der Durchmesser des Ringes Fett entsprechen). Positionieren Sie den Heizung-Ring auf das Deckglas und Dichtung mit Fett. Kleben Sie den Schlauch von der Heizung-Ring auf die Bühne.

(7) Bildgebung

Hinweis: Wir verwenden eine aufrechte zwei-Photonen mikroskopsystem ausgestattet mit einem einstellbaren Ti:Sa Laser und einem fluoreszierenden Mikroskop mit Wasserlagerung 20 X oder X 25 Ziele. Echtzeit-Korrektur der Gewebe Drift während der Akquisition kann durch die Verwendung eines automatisierten Bühnen- und VivoFollow19implementiert werden. Dies verbessert die Stabilität der Bildaufnahme, aber ist nicht erforderlich.

  1. Schalten Sie die aufrechte Mikroskopie-System mit einer geeigneten Software zur Verfügung gestellt vom Mikroskop Hersteller. Stimmen Sie den Ti:Sa-Laser auf eine Wellenlänge von 780-900 nm Anregung.
  2. Die Heizung Schläuche an den Ring Heizung anschließen. Eine Peristaltische Pumpe zirkuliert heißes Wasser (durch Untertauchen Teil des Schlauches in einem Wasserbad von 80° C erhitzt) durch den Ring um die SMG zu wärmen.
  3. Schließen Sie den Temperaturfühler an ein digitales Thermometer. Passen Sie die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe, wenn die Temperatur nicht zwischen 35-39 ° C. Desto schneller arbeitet die Pumpe, desto wärmer das Objekt wird, und umgekehrt.
  4. Führen Sie vor Beginn der Bildaufnahme eine Sichtkontrolle der Blut-Strömungsgeschwindigkeiten. Überprüfen Sie sorgfältig die Leukozyten Passage durch die dünnen Kapillaren oder durch fluoreszierende Dextran-Injektion.
    Hinweis: Intravenös injizierten fluoreszierende Dextran wird sofort das gesamte Gefäßsystem SMG ausfüllen wenn Blutfluss physiologische ist. Dies ist fast immer der Fall in diesem Verfahren.
  5. Um Immunzellen zu folgen, ist bildgebenden Tiefe in der Regel zwischen 20-150 µm unterhalb der Oberfläche der SMG durch die 2Nd harmonische Erzeugung Signal identifiziert. Rekord Bild Stapel von 150 bis 300 µm Sichtfeld mit Pixel-Auflösung von ca. 512 x 512 oder höher, und Z-Tiefen von 20-60 µm mit Abstand von 2-4 µm zwischen den Bildern. Wiederholen Sie Stack Erwerb alle 20-30 s für eine Gesamtdauer von 20-60 min.
  6. Verwenden Sie digitale Thermometer, um die minimale und maximale Temperatur Ebenen nach Erwerb einer Bildsequenz steuern. Die Bildsequenz zu verwerfen, wenn das Minimum oder Maximum nicht im Bereich von 37 sind ± 2 ° C. Füllen Sie das Wasser für das Eintauchen des Ziels zwischen Bildsequenzen.
  7. Am Ende der bildgebenden Sitzung einschläfern Sie die Mäuse durch CO2 ersticken unter Narkose.
    Hinweis: Dies ist in Übereinstimmung mit Schweizer Bundesrichtlinien des Tierversuchs; Weitere Richtlinien für Euthanasie können an anderer Stelle anwenden.

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Representative Results

Dieses Protokoll ermöglicht die Abbildung von fast der gesamten dorsalen und ventralen Seite von der SMG. Das Sichtfeld umfasst in der Regel auch die sublinguale Speicheldrüse, die etwas von der SMG in zelluläre Zusammensetzung4abweicht. Beide Drüsen sind durch Fibrillären Kollagen eingekapselt und Lappen unterteilt. Die meisten 14:00 Systeme können durch die Messung der 2Nd harmonisches Signal ein markierungsfreie Bild von Fibrillären Kollagen produzieren, aber in der Regel fluoreszierende Moleküle für Visualisierung zellulärer und subzellulärer Strukturen erforderlich sind. Zum Beispiel ist allgegenwärtig transgene Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Kombination mit den 2Nd harmonisches Signal ausreichend, Azini, Leitungen und Blutgefäße in der SMG durch ihre morphologischen Merkmale zu identifizieren. Dieses Setup lässt sich beobachten, transgenen fluoreszierenden Marker mit Zelle Art Konkretisierung, bestimmte Zelle Teilmengen zu identifizieren. Abbildung 2 zeigt ein Netzwerk ofCOL1A1-GFP Reporter exprimierenden Fibroblasten-wie Zellen des Bindegewebes. Ebenfalls gezeigt werden Blutgefäße, gekennzeichnet durch intravenöse Injektion von einem Fluoreszenzfarbstoff mit hohem Molekulargewicht Dextran gekoppelt. Der luminalen Fach der Gallenwege kann auch (Abbildung 3) beschriftet werden, wenn der Farbstoff in die WD29Retrogradually injiziert wird.

Figure 1
Abbildung 1 : Bühne angepasst. (a und a *) zwei frei einstellbare Halterungen für Deckel rutscht; (b und b *) einstellbare Stereotaktische Ohr Bars; (c) ein String, der mit einer Schraube festgezogen werden kann; (d) eine frei einstellbare Metall Ring Heizung; (e) erhöhte Bereich bezeichnet, den Torso der Maus platzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Netzwerk COL1A1-GLP mit dem Ausdruck ihrer Zellen (grün) und Gefäßsystem Marker (rot). Gefäßsystem durch intravenöse Injektion von Texas Red-Dextran-Konjugat (MW 70 kDa) beschriftet. Fibrillären Kollagen zwischen zwei Lappen ist als die 2Nd harmonisches Signal (blau) dargestellt. Dargestellt ist eine einzige Z-Projektion von 15 gestapelten Bildern mit 47 µm Tiefe. Maßstabsleiste = 40 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Luminalen Rohr mit der Bezeichnung nach der Injektion WD. Blutgefäße, beschriftet mit 70 kDa-MW Texas Red-Dextran (rot), Kanal Lumen beschriftet mit Kaskade blau-Dextran (weiß; 10 kDa MW) über retrograde Injektion durch die WD und adoptively übertragenen GFP+ CD8+ T Zellen (grün) in der SMG. Gezeigt ist eine einzige Z-Projektion von 27 gestapelten Bilder mit 50 µm Tiefe. Maßstabsleiste = 40 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll bietet eine einfache Lösung für die in-Vivo Bildgebung der murinen mandibulären und sublingualen Speicheldrüsen mit aufrechten nichtlineare Mikroskopie verwendet oft auf dem Gebiet der Immunologie. Die Methode kann für die Darstellung der anderen therapeutisches Drüsen in der Kopf-Hals-Bereich angepasst werden. Zum Beispiel hat unser Labor Bildgebung die Tränendrüse in analoger Weise (nicht dargestellt) durchgeführt.

Entfernen das Bindegewebe um die SMG ist der kritischste Schritt dieses Protokolls, da zufällige Gewebeschäden auftreten kann. Schäden an den wichtigsten Blut-Versorgungsmaterial von der SMG erfordert sofortige Beendigung des Experiments, da das SMG Gewebe Hypoxie werden wird. Wenn die SMG Gewebe selbst beschädigt ist, stoppt die Blutung in der Regel natürlich durch Koagulation. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass die Verletzung sterile Entzündung löst und proinflammatorischen Zytokinen lösen30, die das experimentelle Auslesen beeinflussen könnten. Eine häufigere, aber weniger wichtige Komplikation während der Mikrochirurgie sind Undichtigkeiten in der saline Reservoir. Um das Auftreten von Leckagen zu minimieren, immer Fetten Sie ein, trockene, unbehaarte Haut. Patchen ein Leck ist in der Regel zwecklos: stattdessen all das Fett zu entfernen, die Haut mit einem trockenen Wattestäbchen reinigen und erneut von Grund auf neu.

Während der Aufnahme, ist eine Temperatur nahe der physiologischen Körpertemperatur (ca. 37 ° C für männliche und weibliche C567BL/6 Mäuse31) einzuhalten. Da sowohl Hypo- und Hyperthermie Blut fließen32,33ändern, kann nicht physiologische Funktion von der SMG unter diesen Bedingungen ausgegangen werden. Allerdings beobachten wir keinen Unterschied in der Durchblutung oder T-Zell-Motilität während kleine (± 2 ° C), Transient (< 5 min) Abweichungen von der optimalen Temperatur.

Minimierung der Gewebe Bewegung ist unerlässlich für gute Bildqualität. Verschiedene Arten von unerwünschten Gewebe Bewegung können auftreten, und typische Ursachen, die zur Fehlerbehebung unterliegen können. Erstens verursacht kontinuierliche Xyz-Drift in der Regel durch die SMG, langsam wieder in seine ursprüngliche Position durch angehängte Bindegewebe treiben. Dies geschieht, wenn die untere Abdeckung Glas zu hoch installiert wurde, oder das Bindegewebe um die SMG wurde nicht gründlich gestört. Zweitens kann die langsame und kontinuierliche Z-Drift auftreten, wenn die Temperatur instabil ist. In diesem Fall sorgfältig einstellen Sie die Heizung und warten Sie, bis die Temperatur stabil, ca. 15 min vor der Bildgebung. Zu guter Letzt tritt pulsierende Gewebe Bewegung die saline Kammer nicht dicht verschlossen ist. Druck baut sich auf und in der saline Kammer mit jedem Atemzyklus löst. In Kombination mit Lecks oder Luftblasen führt dies zu pulsierenden Strömungen, die direkt mit dem SMG Gewebe zu übersetzen. In diesem Fall ist beim Zusammenbau die Deckgläser und Kochsalzlösung Kammer die zuverlässigste Lösung.

Die maximale Tiefe imaging hängt die verwendete Wellenlänge von Erregung und die Fluorophore beschäftigt. Wie in praktisch allen intravitalen imaging-Setups, Rot-verschoben Farbstoffe oder fluoreszierende Proteine, die mit langen Wellenlängen (900-1.100 nm) angeregt werden können erlauben Sie tiefere Gewebe imaging als grüne Farbstoffe und kürzere Erregung Wellenlängen.

Die SMG hat als Modell Organ für Endo - und Exozytose und Umbau3,27,28, Infektion34, Autoimmunität11und Tumor Biologie12Membran verwendet. Weiter ermöglicht es viele Formen der Manipulation: Farbstoffe, pharmakologische Verbindungen und Antikörper können in der Drüse über die Blutbahn geliefert werden. Alternativ kann die SMG direkt über die Kanülierung der WD gezielt eingesetzt werden, die verwendet wurde, um Virus11, Dextrans3, DNA25, Farbstoffe29oder pharmakologische Wirkstoffe3liefern.

Der intravitalen Bildfeld weiterhin profitiert von einer immer größer werdenden Toolbox von genetischen und biochemischen fluoreszierend Kennzeichnung Techniken. Fortschritte in der Gentechnik bieten Mauslinien und Zell-Linien anspruchsvolle fluoreszierenden Marker. Jüngste Beispiele sind Kennzeichnung von bestimmten Zelle Teilmengen (CD11c+ Zellen35) oder dynamische Zellskelett Proteine (Lifeact36), Photoconvertible Marker für Zelle tracking- 37und Echtzeit-Reporter der Kern- Translokation (NFAT38) oder Calcium signaling39. Andere Anwendungen können fluoreszierende biochemische Sonden, die spezifische subzelluläre Kompartimente (z. B. DNA-bindende 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder lipophile Membran Farbstoffe) hervorheben. Moderne NLO-Mikroskopie bietet viele Lösungsmöglichkeiten um die experimentelle Fragen am besten beantworten. Zum Beispiel wurde gemultiplexten zwei-Photonen-Bildgebung entwickelt um maximale Erwerb Geschwindigkeit40stark zu erhöhen. Andere Techniken bieten markierungsfreie multiphoton Bildgebung, durch Erzeugung von zweite oder Dritte harmonische Signale15oder durch Messung charakteristische Resonanz-Schwingung der Moleküle (kohärente Anti-Stokes Raman Streuung)41. Wenn praktikable Verfahren für Gewebe Exposition und Stabilisierung zur Verfügung stehen, werden die Grenzen der experimentellen Design so, meist durch des Experimentators Ressourcen und Kreativität gesetzt.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Projekt Grant 31003A_135649, 31003A_153457 und 31003A_172994 (zu JVS) und Leopoldina Gemeinschaft LPDS 2011-16 (BS) finanziert. Diese Arbeit profitiert, optische Konfigurationen des "Microscopy Imaging Center" (MIC) der Universität Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 135 Intravital Bildgebung Maus-Modell multiphoton Mikroskopie Speicheldrüse Analyse der adaptiven Immunantwort Immunologie
Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie
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Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B.,… More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

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