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Immunology and Infection

똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

우리는 수술 노출 하 고 안정화 murine submandibular 침 샘 intravital 이미징 똑바로 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 머리와 목 지역 쥐 및 다른 작은 설치류의 다른 전 동맥에 쉽게 적응 합니다.

Abstract

Submandibular 침 샘 (SMG) 3 개의 주요 침 샘의 하나 이며 생물학 연구, 세포 생물학, 종양학, 치과, 면역학 등의 다양 한 분야에 대 한 관심의 이다. 서울시는 전 선 분 비 상피 세포, myofibroblasts, 내 피 세포, 신경, 세포 외 매트릭스의 구성 이다. 쥐와 쥐 SMG에서 동적 세포질 과정 몇 군데 이전 있다, 주로 사용 하 여 거꾸로 다중 광자 현미경 시스템. 여기, 우리는 수술 준비와 똑바로 다중 광자 현미경 시스템 이미징 비보에 마 취 쥐에서 murine SMG의 안정화에 대 한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 우리 생의 대표적인 intravital 이미지 세트를 제시 하 고 adoptively 형광 세포, 혈관 또는 침 덕트 및 원 콜라겐 시각화를 둘째로 고조파 생성의 라벨을 포함 하 여 전송. 합계에서는, 우리의 프로토콜 intravital 이미징 면역학 분야에서 일반적으로 사용 되는 직 립 현미경 시스템에서 마우스 침 샘의 수술 준비를 위해 수 있습니다.

Introduction

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타 액은 음식에 기름칠을, 구두 관의 점 막 표면 보호 항균 물질1,2뿐 아니라 소화 효소를 제공 하 고 전 분 비에 의해 은닉 된다. 구두 submucosa에 산재 된 작은 침 샘은 귀 밑, 설, 그리고 submandibular로 확인 하는 주요 동맥의 3 개의 양자 세트 그들의 위치1,2에 있습니다. 플라스 크 모양의 낭 (acini)으로 구성 된 피라미드 모양의 상피 세포, myoepithelial 세포 및 지하실 막에 의해 포위 된다 demilunes 분 비 타 액1의 장 액 및 점액 구성 요소 또는. 그들은 마침내 단일 배설 덕트1에 가입 때까지 전기 덕트에 결합 삽입 된 덕트로 acini 빼낸의 좁은 luminal 공간. 서울시의 주요 배설 덕트와 튼의 덕트 (WD) 이라고 하 고 설 caruncle3,4로 열립니다. SMG 상피 구획은 따라서 끝점과 매니폴드 터미널, 포도1,,56의 번들을 닮은 높은 arborized 구조를 나타냅니다. SMG interstitium 혈액과 림프 혈관 결합 조직7 8 부 교감 신경 신경 및 세포 외 매트릭스5에 포함 된 구성 됩니다. 일반 인간과 설치류 침 샘은 또한 T 세포, 대 식 세포, 및 수지상 세포9, 뿐만 아니라 플라즈마 세포 분 비 면역 글로불린 (IgA)는 타 액9,10에 포함 되어 있습니다. 건강과 질병에서의 다각적인 기능, SMG은 치과4, 면역학11, 종양학12, 생리학8, 세포 생물학 등 생물학 연구의 많은 분야에 대 한 관심의 대상이 3.

동적 세포질 프로세스와 상호 작용의 이미징 생물학 연구13,14에서 강력한 도구입니다. 깊은 조직 이미징 및 혁신 inmicroscopes 비선형 광학 (NLO)에 따라 산란 또는 샘플에서 여러 개의 광자의 흡수에 의존 하는 개발 복잡 한 조직13 에서에서 세포 프로세스를 직접 검사를 수 있다 15. 여러 개의 광자의 흡수 낮은 에너지 광자, 초점면에 어떤 경계 fluorophore 여기에 의해 총 여기 에너지의 납품의를 포함 하 고 따라서 초점에서 잡음 감소 photodamage와 깊은 조직 침투 수 있습니다. 여기13,15. 이 원리 2 광자 현미경 (2 분)에 의해 고용 하 고 최대 1 m m15,16의 깊이에 형광 표본의 이미징에 대 한 수 있습니다. 사용자 친화적이 고 믿을 수 있는 셋업 되 상용 2 오후 동안 intravital 이미징에 대 한 주요 도전 신중 하 게 노출 하 고 특히 시간 경과 시리즈의 이미지에 대 한 마 취 쥐의 대상 기관 안정입니다. 디지털 드리프트 보정 후 데이터 수집을 위한 여러 가지 방법을 게시17,18 그리고 우리는 최근에 "VivoFollow", 실시간으로 사용 하 여 느린 조직 드리프트를 중화 하는 자동된 보정 시스템 개발을 컴퓨터 단계19. 그러나, 그것은 여전히 고품질 이미징 조직 운동, 호흡 또는 하트 비트19기인 특히 빠른 움직임을 최소화 하기 위해 중요 합니다. 준비 및 안정화 절차 척수20, 간21, 피부22,23, 폐 및 림프 노드24를 포함 하 여 여러 장기에 대 한 출판 되었습니다. 또한, 쥐 침 샘 이미징 모델 개발된3,25 되었고 더 높은 해상도 intravital 이미징 murine SMG는 거꾸로 한 현미경 설치26, 에 맞게의 세련 된 27 , 28.

여기, 선물이 murine SMG의 intravital 이미징에 대 한 실용적이 고 적응력 프로토콜 intravital 이미징 면역학 분야에서 일반적으로 사용 되는 직 립 비선형 현미경을 사용 하 여. 이 위해, 우리는 오 금 림프절 준비에 사용 되는 널리 고용된 immobilization 무대 수정.

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Protocol

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모든 동물 일 동물 실험에 대 한 Cantonal 위원회에 의해 승인 되었습니다 있으며 연방 정부의 지침에 따라 실시.

1. 마우스 anesthetize

  1. 실험실 외 투, 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 하십시오.
  2. 케 타 민, xylazine, 및 20 mg/mL 및 1 mg/mL 작업 농도에 염 분을 각각 혼합. Intraperitoneally 작업 사진 주사 (i.p.) 마우스의 8-10 µ L/g에. 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다.
    참고:이 프로토콜 C57BL/6 배경 6에 40-주-오래 된 남성 및 여성 쥐에 대 한 테스트 되었습니다.
  3. 2.5 mg/mL에서 acepromazine 솔루션을 준비 하 고 30 µ L i.p., 15 분 (75 µ g/마우스) 케 타 민-xylazine 주입 후 주입.
  4. 5-15 분 후 반사, 예를 들면, 발 또는 각 막 반사의 철수 반사를 제어 하 여 적절 한 마 취와 진통에 대 한 확인 합니다.
  5. 제어 반사에 대 한 약 30 분 마다 실험의 전체 기간 동안. 피하 주사 마 취 제/xylazine 1.5 µ L/g 마우스, 모든 60 분 또는 이전 경우의 반사는 긍정적인.
    참고: 흡입 마 취와 isoflurane 같은 마우스의 고정 때문이 프로토콜을 사용할 수 없습니다.

2. 운영 영역에서 모피를 제거

  1. 전기 면도기를 사용 하 여 약 5 mm의 양쪽 귀 쪽으로 턱을 통해 스트레칭 앞 다리 쪽으로 입 꼬리에서 확장 영역을 면도.
  2. 제 모 크림 면봉으로 면도 영역에 적용 됩니다. 신중 하 고 철저 하 게 젖은 티슈로 닦아 하 여 예를 들어, 3 분 후 제거 합니다.

3. 스테이지에서 마우스 수정

참고:이 프로토콜 사용 하 여 사용자 지정된 단계 (그림 1) 커버 전표 (나사와 단계에 연결 된 하나, 다른 그것에 영구적으로 고정);에 대 한 두 명의 자유롭게 조정 가능한 홀더 장착 조정 가능한 정위 적 귀 바; 나사; 강화 될 수 있는 문자열 자유롭게 조정 가능한 금속 난방 반지; 그리고 마우스의 몸통을 배치에 지정 제기 지역. 이 단계는 추가 정위 적 보유자와 exteriorized SMG 들고 낮은 커버 슬립에 대 한 지원 오 금 림프절 단계에서 수정 됩니다. 상세한 계획 또는 따옴표는 무대의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.

  1. 이동식 커버 슬립 홀더 난방 반지 홀더를 제거 하 여 무대를 준비 합니다. 귀 바 홀더 및 고정된 커버 슬립 홀더의 나사를 풉니다. 마우스에 대 한 침구도 무대의 중심 영역에 거 즈의 조각 테이프.
  2. 접착제를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 원통형 금속 홀더 (올 낮은 커버 유리)의 상단에 20 m m 직경 커버 유리를 연결할. 편평한 금속 홀더 (올 상단 커버 유리)의 바닥에 25 m m 커버 유리 접착제. 커버 유리 금속 소지자와 약 2-3 mm 겹치는 고 유리의 나머지 그리스와 접착제의 무료 남아 확인 하십시오.
  3. 귀 바 사이 중심으로 머리와 거 즈, 수직으로 뻗어 문자열에 그것의 뒤에 마우스를 놓습니다.
  4. 외과 테이프와 함께 무대에 마우스의 위 사지를 수정 합니다.
  5. 다음, 상단 전면 앞 니에 문자열을 연결 하 고 턱에는 수평 위치를 도달할 때까지 조입니다. 각된 곡선된 집게를 사용 하 여 약간 호흡을 용이 하 게 입에서 혀를 꺼내.
  6. 단단히, 하지만 하지 강제로, 꼬리를 당겨 하 고 무대에 테이프.
  7. 귀 바 바와 스테이지 가장자리 간의 약 30 °의 각도 달성 하기 위해 맞춥니다. 이 각도 되도록 삼각형 눈금자를 사용 하 여 종이, 시트에 좌우 30 °의 각도 그릴 하 고 소유자에 따라 맞게 종이에 투명 한 무대를 놓습니다.
  8. 안쪽까지 턱 운동, 동시에 왼쪽 및 오른쪽 막대를 이동 하 여 귀 바 사이의 턱을 해결 하 고 나사를 조이십시오. 전에, 하는 동안, 그리고 턱을 고정 시킨 후 가슴 움직임을 관찰 합니다. 감소 또는 호흡에 결 석 바는 아니라 턱 뼈; 목에 고정 하는 것을 나타냅니다 이 경우에, 즉시 고정 절차를 반복 합니다.
  9. 근처 난방 램프 또는 무대 아래 난방 패드를 배치 하 여, 예를 들어, 마우스를 난방을 제공 합니다.

4. 수술 노출은 Stereomicroscope를 사용 하 여 침 샘의

참고: 다음 단계는 stereomicroscope와 미세 집게, 수술가 위 사용을 해야합니다. 이후 절차는 터미널, 살 균 동작 상태를 유지 하기 위해 필요는 없습니다. 에탄올 청소 기기 충분합니다.

  1. 피부 약 15 m m 입과 턱 선의 5 m m 중간의 꼬리에 약간의 돌출을 찾아서 오른쪽 SMG 엽의 대략적인 위치를 찾습니다. 돌출의 중앙에 작은 피부 겹을 들어올린 만들려고 그것과 약 5mm 길이의 오프닝 컷.
  2. 즉시 상처 주변 피부에 진공 그리스의 4 m m 고리를 적용 합니다. (무딘된 25 G 피하 주사 바늘으로 진공 기름 가득 주사기 사용).
  3. 유지 조직 습 한 작업 중에 염 분으로 기름 반지를 채우십시오.
  4. Stereomicroscope에서 다음 절차를 사용 하 여 결합 조직 방해: 한 미세 집게를 사용 하 여 단단히 잡기는 서울시에 직접 연결 하는 결합 조직의 조각 하 고 그것은 파열 때까지 원심 결합 조직을 두 번째 집게를 사용 하 여. 일부 결합 조직 유지; 서울시에 연결 된 이것은 처리 수 있기 때문에 바람직하다입니다. 이 출혈을 일으킬 것입니다 때문에, 집게와 선 자체를 만지지 마십시오.
  5. 선, 위에 다음 (SMG의 오른쪽과 왼쪽 엽) 사이 중간 측에 먼저 결합 조직 방해의이 동작을 반복 합니다. 삶의 submandibular 동맥에서 분리 하지 마십시오.
  6. (꼬리, 원심 rostral 하 하 하 중간) SMG 주위 반대 측면 결합 조직 제거를 계속 합니다.
  7. 혈액 공급, 원심 lymphatics 고 침 덕트 모두에 있는 동맥의 두개골 사이트에서 번들, 파열 되지 것을 확인 하십시오.
  8. 측면 결합 조직 중단 되 면 집게를 사용 하 여 당겨 위쪽으로 리프트는 SMG의 꼬리 끝에 서울시의 꼬리 끝에 연결 하는 결합 조직. SMG 엽 아래 결합 조직 방해는 꼬리에서 시작 하 고 rostral 끝 쪽으로 이동.
  9. (주요 먹이/배출 혈관와 WD rostral 사이트 제외)는 서울시의 모든 사이트에 결합 조직 제거 될 때까지 계속 합니다.

5. 고정 선

  1. 식 염 수를 들고 그리스 링 4mm 이상 높은 그리고 새 (단계 4.2 참조) 확인 합니다.
  2. 설치 (단계 3.2 참조) 낮은 커버 유리 금속 막대의 높이 조절 가능한 홀더를 연결 하 여. 커버 슬립 홀더 최상의 위치로 조정 되 고 그리스 링 무대에 연결 될 때 터치 하지 않습니다 확인 합니다. 커버 슬립 덮고 대략 3 분의 2 (꼬리와 말 초 부분) 노출된 엽의와 마우스, 약 60 °의 각도에서 꼬리 방향에서 홀더를 배치 합니다. 그것까지 커버 유리를 낮은 선 접촉 하 게.
  3. 새로운 염 저수지를 커버 글라스 위에 그리스 반지를 완료 합니다.
  4. 조심 스럽게 내 커버 슬립 위에 SMG 엽 집게만 만지고 그것에 연결 하는 결합 조직 (기관 위쪽으로 향하게 하는 아래 사이트와 뒤집힌 수 있습니다).
  5. 그리스 링 4mm 이상도 높이, 누설 하지 않습니다 확인 하십시오. 필요한 경우 리필 30 G을 사용 하 여 염 분 저수지 주사기 염 분으로 가득 합니다.
  6. 커버 유리 홀더 상단 커버 유리에 대 한 최상의 위치에 있는지 확인 합니다. 나사를 사용 하 여 소유자를 25 m m 상단 커버 유리 금속 홀더를 연결. 소유자의 조절 나사를 사용 하 여 중간에 SMG를 중심으로 커버 유리를 위치.
  7. 조정 가능한 홀더 나사를 사용 하 여 직접 서울시를 연결 하는 그것 때까지 상단 커버 유리를 낮은. 모양 및이 단계는 동맥의 색을 관찰 합니다. 체 표면적 나타납니다, 또는 착 색 (예를 들어 흰색 분홍색)에서 즉시 변경 하는 경우 서울시에 압력을 완화에 더 높은 위치에 커버 유리를 넣어.
  8. 공기 방울 나 방울 저수지 밖 염 분의 보고 누수에 대 한 식 염 수 저수지를 확인 합니다. 누설 또는 공기 거품을 감지 하는 경우 제거 모두 커버 실수할 하 고는 모든 그리스 및 2 단계에서 다시 시작.
  9. 나사 고정 나사를 모두 종료 하십시오.

6. 고정 난방 반지 및 온도 프로브

  1. 저수지에 온도 프로브를 삽입 하 고 선, 가까운 위치 다음 단계로 프로브 와이어 테이프.
  2. (그리스 링의 직경 난방 반지의 직경에 해당) 센터에서 서울시와 상단 커버 슬립을 그리스 링을 적용 합니다. 커버 슬립 위에 난방 반지를 놓고 그리스와 함께 인감. 무대에 난방의 배관 테이프.

7입니다. 영상

참고: 우리는 직 립 2 광자 현미경 시스템 가변 Ti:Sa 레이저와 물 침수 또는 25 X 20 X 목표와 형광 현미경을 사용 합니다. 중 조직 드리프트의 실시간으로 보정 된 자동화 된 단계 및 VivoFollow19를 사용 하 여 구현할 수 있습니다. 이미지 수집의 안정성을 향상 시키지만 필요 하지 않습니다.

  1. 현미경 제조업체에서 제공 하는 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 똑바로 현미경 시스템을 켭니다. 780-900 nm 여기 파장에 Ti:Sa 레이저 조정.
  2. 난방 배관 난방 반지에 연결 합니다. 연동 펌프는 SMG를 따뜻하게 반지를 통해 뜨거운 물 (80 ° C 물 목욕에서 튜브의 부분을 물속에 의해가 열)를 순환.
  3. 디지털 온도계를 온도 프로브를 연결 합니다. 온도가 사이 35-39 ° c.의 경우 연동 펌프의 속도 조정 빨리 펌프 작동, 온 열 장치 개체가 되 면 반대로.
  4. 이미지 수집을 시작 하기 전에 혈액 흐름 속도의 시각적 컨트롤을 수행 합니다. 신중 하 게 백혈구 통로 형광 dextran 주입 또는 얇은 모 세관을 통해 확인 합니다.
    참고: 정 맥으로 주입 된 형광 dextran 채울 것입니다 즉시 전체 서울시 맥 관 구조에 밖으로 혈액 흐름은 생리 할 때. 이것은 거의 항상이 절차의 경우입니다.
  5. 따라 면역 세포, 이미징 깊이 일반적으로 20-150 µ m 2 고조파 생성 신호를 구분 하는 SMG의 표면 아래. 픽셀 해상도 약 512 x 512 이상, 150-300 µ m 시야의 기록 이미지 스택 그리고 z 이미지 사이 2-4 µ m의 간격을 가진 20-60 µ m의 깊이. 20-60 분의 총 시간에 대 한 스택 수집 모든 20-30 s를 반복 합니다.
  6. 디지털 온도계를 사용 하 여 하나의 이미지 시퀀스의 취득 후 최소 및 최대 온도 레벨을 제어. 최소 또는 최대 37 ±의 범위에 있지 않은 경우 이미지 시퀀스를 삭제 2 ° c. 이미지 시퀀스 간의 목표의 침수 물 리필.
  7. 이미징 세션의 끝에, 쥐를 마 취 CO2 질 식에 의해 안락사.
    참고: 이것은 동물 실험;의 스위스 연방 정부의 지침에 따라 안락사에 대 한 다른 지침 다른 곳에서 적용할 수 있습니다.

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Representative Results

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이 프로토콜에는 거의 전체 등 또는 복 부 측면의 SMG의 영상 수 있습니다. 보기의 필드 일반적으로 또한 세포질 구성4서울시에서 약간 다릅니다 설 침 샘을 포함 한다. 두 샘 원 콜라겐에 의해 캡슐화 되며 돌출부를 세분화. 대부분 오후 2 시스템 2 고조파 신호를 측정 하 여 원 콜라겐의 레이블 없는 이미지를 생성할 수 있습니다 하지만 일반적으로 형광 분자 세포 및 subcellular 구조의 시각화를 위한 필요. 예를 들어, 2 고조파 신호 함께에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 유비 쿼터 스 유전자 변형 식 그들의 형태학 상 특징에 의해 acini, 덕트, 그리고 SMG에 혈관을 식별 하기 위해 충분 하다. 특정 셀의 하위 집합을 식별 하기 위해 셀 유형 특정 식과 유전자 변형 형광 마커를 관찰 하는 것이 설치를 사용할 수 있습니다. 그림 2 는 네트워크 ofCOL1A1 GFP 기자 표현 구와 같은 세포 결합 조직. 또한 높은 분자량 dextran을 결합 하는 형광 염료의 정 맥 주입에 의해 표시 된 혈관은입니다. 관의 luminal 구획 수 또한 표시 됩니다 (그림 3) 때 염료 주입 retrogradually WD29.

Figure 1
그림 1 : 사용자 지정 단계. (a와 a *) 두 명의 자유롭게 조정 가능한 홀더 커버 전표; (b와 b *) 조절 정위 적 귀 바; (나사;와 강화 수 c)는 문자열 (d) 자유롭게 조정 가능한 금속 난방 반지; (e) 발생 영역 마우스의 몸통을 배치 하도록 지정 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 맥 관 구조 마커 (빨간색)와 네트워크 COL1A1 GFP 표현 셀 (그린). 텍사스 레드-dextran 공액 (MW 70 kDa)의 정 맥 주입에 의해 표시 된 맥 관 구조. 두 개의 돌출부 사이 원 콜라겐 2 고조파 신호 (파란색)으로 시각 이다. 표시 된 단일 z-47 µ m 깊이 가진 15 스택된 이미지의 투영 이다. 눈금 막대 = 40 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Luminal 덕트 WD 주입 후 표시. 70 kDa MW 텍사스 레드-dextran (빨강), 덕트의 루멘으로 표시 하는 혈관 세포 (녹색)는 서울시에서 캐스케이드 블루-dextran (화이트; 10 kDa MW)+ T WD adoptively 전송된 GFP+ CD8 통해 역행 주입을 통해으로 표시. 표시는 단일 z-50 µ m 깊이 가진 27 스택된 이미지의 투영. 눈금 막대 = 40 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜 murine submandibular 고 설 침 샘을 면역학의 분야에서 자주 사용 하는 직 립 비 선형 현미경 검사 법을 사용 하 여의 비보에 이미징에 대 한 간단한 접근을 제공 합니다. 메서드는 머리와 목 지역에 다른 전 샘의 이미징에 대 한 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 실험실 (표시 되지 않음)는 유사한 방식으로 눈물 샘의 이미지를 수행 하고있다.

SMG 주위 결합 조직 제거 하는 것은 실수로 조직 손상이 발생할 수 있으므로이 프로토콜의 가장 중요 한 단계입니다. 서울시의 주요 혈액 공급 손상 이후 서울시 조직 hypoxic 될 것 이다 실험의 즉각적인 종료를 필요로 합니다. 서울시 조직 자체를 손상 하는 경우 일반적으로 출혈이 자연스럽 게에 응고에 의해 중지 됩니다. 그러나, 그것은 부상을 유발 균 염증 및 proinflammatory cytokines 출시30, 실험적인 판독에 영향을 미칠 수 있는 고려 될 필요가 있다. 더 일반적인, 하지만 덜 중요 한 합병증은 미세 동안 염 분 저수지에 누출 있습니다. 누출의 발생을 최소화 하기 위해 항상 건조 하 고, 털이 없는 피부에 그리스를 적용 합니다. 보통 무의미 하다 누출 패치: 대신, 기름을 모두 제거, 마른 면봉으로 피부를 청소 하 고, 처음부터 다시 적용.

이미징, 동안 생리 적인 체온에 가까운 온도 (약 37 ° C 남성과 여성의 C567BL/6 마우스31) 유지 되어야 합니다. Hypo-및 고 열 혈액 흐름32,33변경, 이후 SMG의 생리 기능 그 조건 하에서 추측 될 수 없습니다. 그러나, 우리는 혈 또는 작은 (± 2 ° C) 동안 T 세포 운동 성, 과도 차이가 관찰 (< 5 분)에서 최적의 온도 편차.

조직 움직임을 최소화 하는 것은 좋은 이미지 품질에 대 한 필수적입니다. 원치 않는 조직 운동의 다른 종류 발생할 수 있으며 일반적인 원인 문제 해결 받을 수 있다. 첫째, 지속적인 xyz 드리프트 일반적으로 기인한 다 SMG 천천히 연결 된 결합 조직을 통해 그것의 원래 위치에 다시 표류. 이 경우 낮은 커버 유리 너무 높게 설치 된 또는 SMG 주위 결합 조직 했다 철저 하 게 방해 하지 발생 합니다. 둘째, 느리고 지속적인 z 드리프트 온도 경우 발생할 수 있습니다. 이 경우에 신중 하 게 난방을 조정 하 고 온도를 안정, 이미징 하기 전에 약 15 분을 기다립니다. 마지막으로, pulsating 조직 모션 염 챔버 단단히 밀봉 하지 때 발생 합니다. 압력 쌓아 고 모든 호흡 주기 염 챔버에 해제 합니다. 서울시 조직에 직접 번역 pulsating 유체 흐름을 누수 나 기포와 함께에서이 끈다. 이 경우에, 커버 안 경과 염 챔버의 리어셈블리 가장 신뢰할 수 있는 솔루션입니다.

최대 깊이 이미징 사용 여기 파장 고용 fluorophores에 따라 다릅니다. 거의 모든 intravital 영상 설정, 이동 하는 붉은 염료 또는 긴 파장 (900-1100 nm) 흥분 수 형광 단백질 파장 녹색 염료와 짧은 여기 보다 이미징 깊은 조직에 대 한 수 있습니다.

서울시 엔도-exocytosis 및 막 개장3,,2728, 감염34, 면역11및 종양 생물학12모델 기관으로 사용 되었습니다. 그것은 더 많은 형태의 조작 허용: 염료, 약리 화합물 및 항 체 동맥 혈 류를 통해 배달 될 수 있습니다. 또는, 바이러스11, dextrans3, DNA25, 염료29또는 약리 에이전트3제공 하는 데 사용 되었습니다 WD의 cannulation 통해 직접 서울시를 대상 수 있습니다.

Intravital 이미징 분야 유전 그리고 생 화 확 적인 형광 기술 라벨의 적-성장 도구 상자에서 이익을 하 고 있습니다. 유전 공학의 발전에에서는 정교한 형광 마커 마우스 라인과 셀 라인을 제공합니다. 최근 예로 특정 셀 하위 집합의 라벨 (CD11c+ 세포35) 또는 동적 cytoskeletal 단백질 (Lifeact36), 37, 그리고 핵의 실시간 기자를 추적 셀 photoconvertible 마커 전 (NFAT38) 또는 칼슘39신호. 다른 응용 프로그램 (예: DNA 바인딩 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 질 성 막 염료) 특정 subcellular 구획을 강조 형광 생 화 확 적인 프로브를 사용할 수 있습니다. 현대 NLO 현미경 가장 실험적인 질문에 답변을 많은 가능한 솔루션을 제공 합니다. 예를 들어, 멀티플렉스 2 광자 영상 강하게 최대 수집 속도40증가 개발 되었습니다. Multiphoton 라벨 무료 이미징, 생성 두 번째 또는 세 번째 고조파 신호15또는 분자의 특성 공명 진동 측정을 제공 하는 다른 기술 (일관 된 반 스톡 스 라만 산란)41. 따라서, 조직 노출 및 안정화에 대 한 실용적인 절차를 사용할 수 있는 경우의 실험적인 디자인의 한계는 주로 실험의 자원과 창의성에 의해 설정 됩니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언.

Acknowledgments

이 작품은 스위스 국가 재단 (SNF) 프로젝트 그랜트 31003A_135649, 31003A_153457 및 31003A_172994 (JVS), 하와 Leopoldina 친목 LPDS 2011-16 (BS)에 의해 투자 되었다. 이 작품 "현미경 이미징 센터의" (마이크) 베른 대학교의 광학 설정에서 benefitted.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

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References

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똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비
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Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

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