Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Utarbeidelse av Murine Submandibular Salivary kjortelen for stående Intravital mikroskopi

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en protokoll for å kirurgisk avsløre og stabilisere det murine submandibular salivary kjortelen intravital bildevisning oppreist intravital mikroskopi. Denne protokollen er lett tilpasses andre exocrine kjertler av hodet og nakken regionen av mus og annet liten Red.

Abstract

Det submandibular salivary kjortelen (SMG) er en av tre store spyttkjertler, og er av interesse for mange ulike felt av biologisk forskning, inkludert cellebiologi, onkologi, odontologi og immunologi. SMG er en exocrine kjertel består av sekretoriske epitelceller, myofibroblasts, endotelceller, nerver og ekstracellulær matrix. Dynamisk cellulære prosesser i rotte og mus SMG har tidligere blitt avbildet, hovedsakelig ved hjelp av invertert multi Foton mikroskop systemer. Her beskriver vi en enkel protokoll kirurgiske og stabilisering av murine SMG i bedøvet mus for i vivo bildebehandling med oppreist multi Foton mikroskop systemer. Vi presenterer representant intravital image sett av endogene og overført adoptively fluorescerende cellene, inkludert merkingen av blodkar eller salivary kanaler og andre harmonisk generasjon å visualisere fibrillar kollagen. I sum tillater våre protokollen kirurgisk utarbeidelse av musen spyttkjertler i oppreist mikroskopi systemer, som er brukt for intravital imaging i immunologi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Spytt er skilt ut av exocrine kjertler å smøre mat, beskytte mucosal overflater i muntlig tarmkanalen, og å levere fordøyelsesenzymer samt antimikrobielle stoffer1,2. I tillegg til mindre spyttkjertler ispedd i den muntlige submucosa, finnes det tre bilaterale sett store kjertler som Parodisk, sublinguale og submandibular, i henhold til deres plassering1,2. Pyramideformede epitelceller, organisert i kolbe-formet sacs (acini) eller demilunes som er omgitt av myoepithelial celler og en kjeller membran, skiller serous og slimete komponentene i spytt1. Smale luminal løpet av de acini ut i under Sommer kanaler, som samle inn striated kanaler før de endelig blir med i en enkelt excretory rør1. Den viktigste excretory duct av SMG kalles Wharton's duct (WD) og åpner i sublinguale caruncle3,4. SMG epithelial batterirommet representerer derfor en svært arborized med mangfoldige terminal endepunkt, ligner en bunt av druer1,5,6. Den SMG interstitium består av blod og lymphatic fartøyer i bindevev7 inneholder parasympatiske nerver8 og ekstracellulær matrix5. Normale menneskelige og gnager spyttkjertler også inneholde T celler, makrofager og dendrittiske celler9, så vel som plasma celler det avsondre immunglobulin en (IgA) i spytt9,10. På grunn av mangefasettert funksjoner i helse og sykdom er SMG et tema av interesse for mange felt av biologisk forskning, inkludert odontologi4, immunologi11, onkologi12, fysiologi8og cellebiologi 3.

Avbildning av dynamisk cellulære prosesser og -samhandlinger er et kraftig verktøy i biologiske13,14. Utviklingen av dype vev bildebehandling og innovasjoner inmicroscopes basert på ikke-lineær optikk (NLO), som bruker spredning eller absorpsjon av flere fotoner av utvalget, har tillatt direkte undersøke mobilnettet prosesser i komplekse vev13 ,15. Absorpsjon av flere fotoner innebærer levering av totale eksitasjon energi ved lav energi fotoner, hvilke rammen fluorophore eksitasjon til fokalplanet og dermed lar dypere vev gjennomtrenging med redusert photodamage og støy fra ut av fokus eksitasjon13,15. Dette prinsippet er ansatt av to-fotonet mikroskopi (2 PM) og tillater bildebehandling av fluorescerende i dypet av opptil 1 mm15,16. Mens kommersielt tilgjengelig 2 PM oppsett har blitt brukervennlig og pålitelig, er den store utfordringen for intravital avbildning nøye avsløre og stabilisere målet orgelet bedøvet mus, spesielt for avbilding av tid forfalle serien. Flere metoder for digital drift korreksjon etter datainnsamling har blitt publisert17,18 og vi nylig utviklet "VivoFollow", en automatisert rettelsen system, som motvirker langsom vev drift i sanntid ved hjelp av en datastyrt scenen19. Imidlertid er det fortsatt avgjørende for høykvalitets tenkelig for å minimere vev bevegelse, spesielt raske bevegelser forårsaket av pusting eller hjerteslag19. Forberedelse og stabilisering er publisert for flere organer, inkludert ryggmarg20, lever21, hud22, lunge23og lymfeknute24. Videre modeller for rotte salivary kjortelen imaging er utviklet3,25 og videre raffinert ved høy oppløsning intravital avbildning av murint SMG tilpasset en invertert mikroskop installasjonsprogrammet26, 27 , 28.

Her presenterer vi en praktisk og tilpasningsdyktig protokoll for intravital avbildning av murine SMG bruke oppreist lineære mikroskopi, som er vanlig for intravital imaging i immunologi. Dette endret vi en viden ansatt immobilisering scenen brukes for femoral lymfeknute preparater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyr arbeid er godkjent av den Cantonal komiteen for dyr eksperimentering og følge føderale retningslinjer.

1. bedøve musen

  1. Bruk personlig verneutstyr, inkludert Laboratoriefrakk og hansker.
  2. Bland Ketamin, xylazine og saltvann til en fungerende konsentrasjon på 20 mg/mL og 1 mg/mL, henholdsvis. Injisere arbeider aksjen intraperitoneally (IP) på 8-10 µL/g av musen. Plass musen tilbake i buret.
    Merk: Denne protokollen er testet for 6 - 40-uke-gamle mannlige og kvinnelige mus med C57BL/6 bakgrunn.
  3. Forberede acepromazine løsningen på 2,5 mg/mL og injisere 30 µL IP, 15 min etter ketamin-xylazine injeksjon (75 µg/mus).
  4. Etter 5-15 min, kan du se etter tilstrekkelig anestesi og analgesi ved å kontrollere for reflekser, f.eks, uttak refleks pote eller hornhinnen refleks.
  5. Kontroll for reflekser omtrent enhver 30 min gjennom hele varigheten av forsøket. Subcutaneously injisere ketamin/xylazine på 1,5 µL/g av musen, hver 60 minutter eller tidligere hvis reflekser er positive.
    Merk: Innånding anestesi som isoflurane kan ikke brukes med denne protokollen, på grunn av fiksering av musen.

2. Fjern pels fra driftsområdet

  1. Bruk en elektrisk barberhøvel til å barbere et område som utvider omtrent fra 5 mm caudal av munnen mot forbena, strekke over kjever mot begge ørene.
  2. Gjelde barberte området med en bomullspinne hår fjerning krem. Nøye og grundig fjerne etter 3 min, f.eksved å tørke med våt vev.

3. fastsette musen på scenen

Merk: Denne protokollen bruker en tilpasset scene (figur 1) utstyrt med to fritt justerbar holdere for cover slips (en knyttet til scenen med en skrue, den andre fast permanent på det); justerbare stereotactic barer; en streng, kan strammes med en skrue; et fritt justerbar metall oppvarming ring; og en hevet området angitt plassere torso av musen. Dette stadiet er endret fra en femoral lymfeknute scenen, med en ekstra stereotactic holder og en støtte for lavere cover slip holder exteriorized SMG. Detaljerte planer eller sitater av scenen er tilgjengelig på forespørsel.

  1. Forberede scenen ved å fjerne innehaverne for oppvarming ringen og flyttbare cover slip holder. Løsne skruer på øret bar innehaverne og fast dekke slip holder. Tape et stykke gasbind til det midterste området i scenen, som sengetøy for musen.
  2. Bruker (se Tabell for materiale) legge en 20 mm diameter cover glass til toppen av en sylindriske metall holder (dette vil være lavere cover glass). Fest en 25 mm cover glass til bunnen av flat metall holderen (dette vil bli øvre dekk glass). Kontroller at dekselet glass overlapper ca 2-3 mm med metall holdere og at resten av glasset er fett eller lim.
  3. Plass musen på ryggen på gasbind, vinkelrett strukket strengen med hodet sentrert mellom øret barer.
  4. Fikse det øvre ekstremitetene museklikk på scenen med kirurgisk tape.
  5. Deretter koble strengen til øvre foran fortenner og stram til kjeven når en horisontal stilling. Bruk en vinklet, buet tang litt trekke ut tungen fra munnen, som muliggjør puste.
  6. Tett, men ikke forcefully, trekke halen og tape den til scenen.
  7. Juster øret barer for å oppnå en vinkel på ca 30° mellom baren og kanten av scenen. For å sikre denne vinkelen, bruke en trekant linjalen til å tegne en høyre og venstre 30° vinkel på et papirark, og plasser gjennomsiktig scenen på papiret justere innehaverne tilsvarende.
  8. Fastsette kjeven mellom øret stolper som samtidig flytter feltet venstre og høyre innover til kjeven er immotile, og stram skruene. Observere bryst bevegelse før, under og etter bestemmer kjeven. Redusert eller fraværende puste angir at linjene er fast i halsen, ikke kjevebeinet; i dette tilfellet gjenta fikse umiddelbart.
  9. Gi oppvarming til musen, f.eksved å plassere en varme lampe i nærheten og/eller en varmeputen under scenen.

4. kirurgisk eksponering av det Salivary kjortelen ved hjelp av en Stereomicroscope

Merk: De følgende trinnene krever bruk av en stereomicroscope, fin tang og kirurgisk saks. Siden prosedyren er terminal, er det ikke nødvendig for å opprettholde sterilt driftsforhold. Etanol-renset instrumenter nok.

  1. Finn den omtrentlige posisjonen til høyre SMG flik etter en liten kul i huden ca 15 mm caudal munnen og 5 mm medialt i kjeven. Løfte en liten hudfold i midten av bule og skjær det å opprette og åpning av ca 5 mm lengde.
  2. Umiddelbart bruke en 4 mm høy ring av vakuum fett på huden rundt kuttet. (Bruk vakuum fett-fylt sprøyte med en avstumpet 25 G sprøyte nål).
  3. Fylle fett ringen med saltvann å sikre vevet forblir fuktig under operasjonen.
  4. Under stereomicroscope, forstyrre connective vev å følge denne fremgangsmåten: Bruk en fin tang for å holde fast et stykke bindevev direkte tilknyttet SMG, og bruk en andre tang til å trekke det distale bindevevet før det brudd. Påse at noen bindevev knyttet til SMG; Dette er ønskelig siden håndtering. Ikke berør kjertelen med tang, siden dette vil føre til blødning.
  5. Gjenta denne bevegelsen av forstyrre bindevev først på kjertel, så på medial side (mellom de høyre og venstre flik av SMG). Ikke skille sublingvaltabletter fra submandibular kjertel.
  6. Fortsette å fjerne lateral bindevevet mot klokken rundt SMG (mediale til caudal, til distale, til rostral).
  7. Kontroller at blod forsyning, efferent lymphatics og salivary ledningskanal, som ligger alle i en pakke på skallen område av kjertel, ikke er utløst.
  8. Når det laterale bindevevet avbrytes, bruk tang til å trekke connective vev knyttet til caudal slutten av SMG oppover å løfte caudal slutten av SMG. Forstyrre bindevevet under SMG lobe, starter fra den caudal og flytte mot rostral slutten.
  9. Fortsett til bindevevet alle områder av SMG fjernes (unntatt rostral området med store fôring/drenering blodkar og WD).

5. fikse kjertel

  1. Bekrefte at fett ringen holder saltkildene er minst 4 mm høy og ikke lekker (se trinn 4.2).
  2. Installere lavere dekselet glass (se trinn 3.2) ved å knytte metallstangen til høyden eieren. Kontroller at innehaveren av cover slip justeres til den største posisjonen og ikke touch fett ringen knyttet til scenen. Plasser abonnenten caudal retning i en vinkel på ca 60° til musen, med cover slip dekker omtrent to tredjedeler (caudal og distale deler) av den utsatte lobe. Senk dekselet glasset til den kommer i kontakt med kjertel.
  3. Fullføre fett ringen på dekselet glasset for å danne en ny saltvann reservoaret.
  4. Trekk forsiktig i SMG lobe på cover slip med tang, bare berøre connective vev knyttet til den (orgel kan vendes på bunnen siden vendt oppover).
  5. Kontroller at fett ringen har en selv høyden på minst 4 mm og ikke lekker. Eventuelt påfyll saltvann reservoaret bruker en 30 G sprøyte fylt med saltvann.
  6. Kontroller at dekselet glass holderen for øvre dekk glasset er i sin største posisjon. Bruke skruen som fester metall holderen med 25 mm øvre dekk glasset til abonnenten. Bruk justerbar skruer på innehaveren for å plassere dekket glasset slik at SMG er sentrert i midten.
  7. Bruk skruer på justerbar holder til lavere topp dekket glasset til det direkte kontakt SMG. Observere form og farge av kjertel i dette trinnet. Hvis kjertel arealet vises større, eller farge endres (for eksempel fra rosa hvit), umiddelbart sette dekket glasset til en høyere plassering å avlaste presset på SMG.
  8. Sjekk saltvann reservoaret lekkasjer etter luftbobler og eller drops saltoppløsning utenfor reservoaret. Hvis det oppdages en lekkasje eller luft boble, fjerne både cover slips og alle fett og starte på nytt fra trinn 2.
  9. Skruen stengt alle fiksering skruer.

6. fastsettelse oppvarming ringen og temperatur Probe

  1. En temperatur sonde inn i reservoaret og plasser den nær kjertel, så tape sonde ledningen til scenen.
  2. Bruke en fett-ring topp cover slip, med SMG i midten (diameteren på fett ringen skal tilsvare diameteren på oppvarming ringen). Plasser oppvarming ringen på cover slip og forsegle med fett. Tape slangen oppvarming ringen til scenen.

7. imaging

Merk: Vi bruker en oppreist to-fotonet mikroskop systemet utstyrt med en tunable Ti:Sa Laser og fluorescerende mikroskop med vann nedsenking 20 X eller 25 X mål. Sanntid korrigering av vev drift under oppkjøpet kan implementeres ved å bruke en automatisert scenen og VivoFollow19. Dette forbedrer stabiliteten til bildeopptak, men kreves ikke.

  1. Slå på oppreist mikroskopi systemet benytter en passende programvare levert av mikroskopet produsenten. Still Ti:Sa Laser til en 780-900 nm eksitasjon bølgelengde.
  2. Koble oppvarming slangen til oppvarming ringen. En peristaltiske vannpumpe sirkulerer varmt vann (oppvarmet av submerging del av slangen i et vannbad 80° C) gjennom ringen å varme SMG.
  3. Koble temperaturmåleren til et digitalt termometer. Juster hastigheten på peristaltiske pumpen hvis temperaturen er ikke mellom 35-39 ° C. Raskere pumpen fungerer, det varmere objektet blir, og omvendt.
  4. Før du starter bildeopptak, utføre en visuell kontroll av blod strømning hastigheter. Nøye sjekke leukocytter passasje gjennom tynne kapillærene eller fluorescerende dekstran injeksjon.
    Merk: Intravenøst injisert fluorescerende dekstran umiddelbart fyller ut er hele SMG blodkar Når blodstrømmen er fysiologiske. Dette er nesten alltid tilfelle i denne fremgangsmåten.
  5. For å følge immunceller, er tenkelig dybden vanligvis mellom 20-150 µm under overflaten av SMG identifisert av 2nd harmonisk generasjon signalet. Registrere bildestakker av 150-300 µm synsfelt med pikslers oppløsning på omtrent 512 x 512 eller høyere, og z-dypet av 20-60 µm med avstand på 2-4 µm mellom bilder. Gjenta stabel oppkjøpet hver 20-30 s for en total varighet på 20-60 minutter.
  6. Bruke den digitale termometeret for å kontrollere minimum og maksimum temperatur nivåer etter oppkjøpet av en bildesekvens. Forkaste bildet sekvensen hvis minimum eller maksimum ikke er i størrelsesorden 37 ± 2 ° C. Fylle vann til nedsenking av målet mellom bildesekvenser.
  7. På slutten av tenkelig økten, euthanize musene av CO2 kvelning under narkose.
    Merk: Dette er i henhold til sveitsiske føderale retningslinjer dyr eksperimentering; andre retningslinjer for euthanasia kan gjelde andre steder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen tillater avbilding av nesten hele dorsal eller ventral side av SMG. Synsfelt vanligvis inkluderer også det sublinguale salivary kjortelen, som er litt forskjellig fra SMG i mobilnettet komposisjon4. Begge kjertler er innkapslet av fibrillar kollagen og inndelt i fliker. De fleste 2 PM systemer kan produsere et etikett-gratis bilde av fibrillar kollagen ved å måle 2nd harmonisk signalet, men vanligvis fluorescerende molekyler er nødvendig for visualisering av mobilnettet og subcellular. For eksempel er allestedsnærværende transgene uttrykket grønne fluorescerende protein (GFP) i kombinasjon med 2nd harmonisk signalet tilstrekkelig til å identifisere acini, rør og blodkar i SMG ved sine morfologiske funksjoner. Dette oppsettet kan brukes til å observere transgene fluorescerende markører med celle type bestemte uttrykk for å identifisere bestemte celle undergrupper. Figur 2 viser et nettverk ofCOL1A1-GFP reporter-uttrykke fibroblast som celler i bindevev. Også vist er blodkar, merket av intravenøs injeksjon av en fluorescerende farge koblet til høy molekylvekt dekstran. Luminal rommet av kanaler kan også merkes (Figur 3) når fargestoff injiseres retrogradually i WD29.

Figure 1
Figur 1 : Tilpasset scenen. (en og en *) to fritt justerbar holdere for cover slips; (b og b *) stereotactic justerbare barer; (c) en streng, kan strammes med en skrue; (d) en fritt justerbar metall oppvarming ring; (e) opp område definert plassere torso av musen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Blodkar markør (rød) og nettverk av COL1A1-GFP uttrykke celler (grønn). Blodkar merket av intravenøs injeksjon av Texas rød-dekstran konjugert (MW 70 kDa). Fibrillar kollagen mellom to lobes er visualisert 2nd harmonisk signal (blå). Vist er en enkelt z-projeksjon av 15 stablet bilder med 47 µm dybde. Skala bar = 40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Luminal rør merket etter WD injeksjon. Blodkar merket med 70 kDa MW Texas rød-dekstran (rød), duct lumen merket med gjennomgripende blå-dekstran (white, 10 kDa MW) via retrograd injeksjon gjennom WD og adoptively overførte GFP+ CD8+ T celler (grønn) i SMG. Vist er en enkelt z-projeksjon av 27 stablet bilder med 50 µm dybde. Skala bar = 40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen gir en enkel tilnærming ved i vivo avbildning av murine submandibular og sublinguale spyttkjertler bruke oppreist ulineær mikroskopi ofte brukt i immunologi. Metoden kan tilpasses for avbilding av andre exocrine kjertler i hodet og nakken. For eksempel, har vår lab utført bildebehandling av lacrimal kjertel på en tilsvarende måte (ikke vist).

Fjerne connective vev rundt SMG er det mest kritiske trinnet av denne protokollen, siden utilsiktet vev skader kan oppstå. Skade viktigste blodtilførselen av SMG nødvendiggjør umiddelbar oppsigelse av eksperimentet, siden SMG vev blir hypoxic. Hvis SMG vevet seg er skadet, blødning vanligvis stopper naturlig av koagulering. Imidlertid må det vurderes at skaden utløser sterilt betennelse og proinflammatory cytokiner slippe30, som kan påvirke den eksperimentelle avlesning. En vanligere, men mindre kritiske problemer under mikrokirurgi er lekkasjer i saltvann reservoaret. For å redusere forekomsten av lekkasjer, alltid bruke fett tørr, hairless hud. Patching en lekkasje er vanligvis intetsigende: i stedet fjerne alle fett, rens huden med en tørr bomullspinne, og på nytt fra bunnen.

Under bildebehandling, må en temperatur nær fysiologiske kroppstemperaturen opprettholdes (ca 37 ° C for mannlige og kvinnelige C567BL/6 mus31). Siden både hypo- og hypertermi endrer blodet flyt32,33, gitt fysiologiske funksjon av SMG ikke under disse betingelsene. Men vi observerte ingen forskjell i blodstrømmen eller T celle motilitet i små (± 2 ° C), forbigående (< 5 min) avvik fra optimal temperatur.

Minimere vev bevegelse er avgjørende for god tenkelig. Ulike typer uønskede vev bevegelse kan skje, og har vanlige årsaker som kan gjennomgå feilsøking. Først skyldes kontinuerlig xyz-drift vanligvis SMG drivende sakte tilbake til utgangsstillingen gjennom tilknyttede bindevev. Dette skjer hvis lavere dekket glasset ble installert for høy eller connective vev rundt SMG ikke grundig forstyrret. For det andre, langsom og kontinuerlig z-drift kan oppstå hvis temperaturen er ustabil. I dette tilfellet nøye justere oppvarming og vent til temperaturen å være stabil, ca 15 min før bildebehandling. Til slutt, pulserende vev bevegelse oppstår når saltvann kammeret ikke er tett lukket. Trykket bygger opp og utgivelser i saltvann kammer med hvert åndedrag syklus. I kombinasjon med lekkasjer eller luftbobler fører dette til pulserende væsken flyter, som oversette direkte til SMG vev. I dette tilfellet er gjenoppbygging av både cover briller og saltvann kammeret den mest pålitelige løsningen.

Maksimalt imaging dybde avhenger av eksitasjon bølgelengden brukes og fluorophores ansatt. I nesten alle intravital tenkelig oppsett, rød-skiftet fargestoffer eller fluorescerende proteiner som kan være glade med lange bølgelengder (900-1100 nm) gir dypere vev imaging enn grønne fargestoffer og kortere eksitasjon bølgelengder.

SMG er brukt som modell organ for endo - og exocytosis og membran remodeling3,27,28, infeksjon34, autoimmunitet11og svulst biologi12. Det videre tillater mange former for manipulasjon: fargestoffer og farmakologiske forbindelser antistoffer kan leveres til kjertel via blodet. Alternativt kan SMG rettes direkte via cannulation av WD, som har blitt brukt til å levere virus11, dextrans3, DNA25, fargestoffer29eller farmakologiske agenter3.

Feltet intravital tenkelig fortsetter å tjene en stadig voksende verktøykasse for genetiske og biokjemiske fluorescerende merking teknikker. Fremskritt innen genetisk engineering gir musen linjer og linjer med sofistikert fluorescerende indikatorer. Nyere eksempler merking av bestemt celle delsett (CD11c+ celler35) eller dynamiske cellen cytoskjelett proteiner (Lifeact36), photoconvertible markører for celle 37, og sanntids journalister av kjernefysiske translokasjon (NFAT38) eller kalsium signalering39. Andre programmer kan bruke fluorescerende biokjemiske sonder, som fremheve bestemte subcellular rom (som DNA bindende 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller lipofile membran fargestoffer). Moderne NLO mikroskopi tilbyr mange mulige løsninger for å best svar på eksperimentelle spørsmål. For eksempel er multiplex to-fotonet imaging utviklet for å øke sterkt maksimal oppkjøpet hastighet40. Andre teknikker tilbyr etikett-fri multiphoton avbildning, enten ved å generere andre eller tredje harmonisk signaler15, eller ved å måle karakteristiske resonans vibrasjon molekyler (sammenhengende anti-Stokes Raman spredning)41. Dermed når praktisk prosedyrer for vev eksponering og stabilisering er tilgjengelig, er grensene for eksperimentell design stort sett satt av eksperimentators ressurser og kreativitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Swiss National Foundation (SNF) prosjektet grant 31003A_135649, 31003A_153457 og 31003A_172994 (til JVS) og Leopoldina fellesskap LPDS 2011-16 (til BS). Dette arbeidet benefitted fra optisk oppsett av "Mikroskopi Imaging Center" (MIC) av universitetet i Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45, (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117, (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53, (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133, (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44, (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108, (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189, (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10, (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2, (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28, (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297, (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108, (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216, (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10, (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46, (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38, (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13, (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5, (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7, (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25, (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34, (9), 642-650 (2003).
Utarbeidelse av Murine Submandibular Salivary kjortelen for stående Intravital mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter