Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Подготовка мышиных подчелюстной слюнной железы вертикально прижизненной микроскопии

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем протокол к хирургическим путем предоставления и стабилизировать мышиных подчелюстной слюнной железы для прижизненной визуализации с помощью вертикально прижизненной микроскопии. Этот протокол является легко адаптируется к другим экзокринных желез головы и шеи региона мышей и других мелких грызунов.

Abstract

Подчелюстной слюнной железы (SMG) является одним из трех основных слюнных желез и представляет интерес для многих различных областях биологических исследований, включая клеточной биологии, онкология, стоматологии и иммунологии. SMG-это экзокринной железы состоит из секреторных клеток эпителия, миофибробласты, эндотелиальные клетки, нервы и внеклеточного матрикса. Динамических клеточных процессов в крысы и мыши SMG ранее были образы, главным образом с использованием инвертированный микроскоп мульти Фотон систем. Здесь мы опишем простой протокол для хирургической подготовки и стабилизации мышиных SMG наркотизированных мышей для изображений в vivo с вертикально мульти Фотон Микроскоп систем. Мы представляем наборы представитель прижизненные изображения эндогенных и восприимчивую переведены люминесцентные клеток, включая маркировки кровеносных сосудов или Слюнных протоков и второй гармоники поколения визуализировать фибриллярного коллагена. В целом наши протокол позволяет для хирургической подготовки мыши слюнных желез в вертикальном микроскопии системах, которые обычно используются для прижизненной визуализации в области иммунологии.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Слюна выделяется экзокринных желез для смазывания пищи, защиты слизистой поверхности устным тракт и доставить пищеварительные ферменты, а также противомикробные вещества1,2. Помимо незначительных слюнных желез перемежаются в устной подслизистой есть три двусторонние набора основных желез, определены как околоушной, сублингвальном и подчелюстные, согласно их местоположение1,2. Пирамидальная эпителиальных клеток, организовал в колбе образный мешки (ацинусов) или demilunes, которые окружены миоэпителиальных клеток и базальной мембраны, выделяют серозной и слизистой оболочки компонентов слюны1. Узкие Люминал пространство Ацинусы стекает в вставными воздуховодов, которые объединяются в полосатый воздуховодов до тех пор, пока они наконец объединить в единый воздуховода выделительную1. Основные выделительной протока SMG называется Wharton протока (WD) и открывает в сублингвального Мясца3,4. Эпителиальный отсеке SMG поэтому представляет структуру высоко arborized с коллектора терминала конечными точками, напоминающие пучок виноград1,5,6. SMG интерстиция состоит из кровеносных и лимфатических сосудов, встроенных в соединительной ткани7 , содержащий парасимпатические нервы8 и5внеклеточного матрикса. Нормальные человеческие и грызунов слюнных желез также содержат T клетки, макрофаги и дендритные клетки9, а также клетки плазмы, которые выделяют иммуноглобулина (IgA) в слюне9,10. Благодаря своей многогранной функции в здоровье и болезни SMG является предметом интереса для многих областях биологических исследований, включая стоматологии4, иммунология11, онкология12, физиологии8и клеточной биологии 3.

Визуализации динамических клеточных процессов и взаимодействий является мощным инструментом в биологических исследований13,14. Разработка глубоких тканей изображений и инновации inmicroscopes на основе нелинейной оптики (НЛО), которые полагаются на рассеяния или поглощение нескольких фотонов в образце, позволила непосредственно изучить клеточных процессов в сложных тканей13 ,15. Поглощения фотонов несколько включает поставку энергии общего возбуждения, низкой энергии фотонов, который ограничивает Флюорофор возбуждения в фокальной плоскости и таким образом позволяет более глубокого проникновения в ткани с сокращением фотоповреждения и шум из фокус возбуждения13,15. Этот принцип работает в двух Фотон микроскопии (2 PM) и позволяет для изображения флуоресцентных образцов в глубинах до 1 мм15,16. Во время коммерчески доступных 2 PM, установок стали удобным и надежным серьезной проблемой для прижизненной визуализации является тщательно подвергать и стабилизировать органа-мишени наркотизированных мышей, особенно для изображений серии промежуток времени. Несколько методов для коррекции цифровых дрейф после сбора данных были опубликованы18 17,и мы недавно разработали «VivoFollow», систему автоматической коррекции, которая противодействует медленно ткани дрейф в реальном времени с помощью Компьютеризированная этап19. Однако все еще важно для высокого качества изображений для сведения к минимуму движения ткани, особенно быстрые движения, вызванные дыхание и сердцебиение19. Подготовка и стабилизации процедуры были опубликованы несколько органов, включая спинного20, печени21, кожи22,23легких и лимфатических узлов24. Кроме того модели для визуализации слюнной железы крыс были развитыми3,25 и доработаны для прижизненной визуализации высокого разрешения Мурина, которую SMG с учетом инвертированным микроскопом установки26, 27 , 28.

Здесь мы представляем практической и гибкой протокол для прижизненной визуализации мышиных SMG с помощью вертикально нелинейных микроскопии, который обычно используется для прижизненной визуализации в области иммунологии. С этой целью мы изменили широко занятых иммобилизации стадии используется для подготовки подколенной лимфатических узлов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все животные работы утверждены Комитетом кантональных для экспериментов животных и проведены согласно федеральных руководящих принципов.

1. анестезировать мыши

  1. Носите средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат и перчатки.
  2. Mix кетамин, Ксилазина и физиологического раствора к рабочей концентрации 20 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно. Инъекционные работы фондового внутрибрюшинно (и.п.) на 8-10 мкл/g мыши. Поместите курсор мыши обратно в клетке.
    Примечание: Этот протокол был протестирован для 6 до 40-week-old мышей мужского и женского пола с фоном C57BL/6.
  3. Готовят раствор acepromazine на 2,5 мг/мл и вставляют 30 мкл и.п., 15 мин после инъекции кетамин Ксилазина (75 мкг/мышь).
  4. После 5-15 мин проверьте адекватной анестезии и обезболивании, контролируя рефлексы, например, снятие рефлекс лапы или роговицы рефлекс.
  5. Контроль для рефлексы примерно каждые 30 мин в течение всей продолжительности эксперимента. Подкожно вводить кетамин/ксилазина на 1,5 мкл/g мыши, каждые 60 мин или раньше, если рефлексы являются положительными.
    Примечание: Ингаляционной анестезии как изофлюрановая не может использоваться с настоящим Протоколом, вследствие фиксации мыши.

2. Удалите мех из области работы

  1. Использование электрической бритвой бриться области, которая расширяется примерно от 5 мм хвостовой полости рта к передней ноги, растяжения над челюсти на оба уха.
  2. Применять крем удаления волос побрился район с ватным тампоном. Внимательно и тщательно удалите после 3 минут, например, протереть влажной ткани.

3. исправить мыши на сцене

Примечание: Этот протокол использует настроенный этап (рис. 1) оснащены двумя свободно регулируемые держатели для покрытия накладных (один прилагается на сцену с помощью винта, а другой стационарно на него); регулируемые стереотаксической уха баров; Строка, которая может быть затянуты с винтом; свободно регулируемый металла, Отопление кольцо; и поднял отведенном для место туловища мыши. Этот этап изменяется от стадии подколенной лимфатических узлов, с добавлен стереотаксической держателя и поддержка Нижняя крышка скольжения, держа экстериоризируется SMG. По запросу предоставляются подробные планы или котировки этапа.

  1. Подготовьте сцену, удалив Держатели для кольца Отопление и Держатель съемная крышка выскальзования. Отвинтите винты Держатели бар уха и держателя фиксированной крышка выскальзования. Ленты кусок Марли, в районе центр сцены, выступающей в качестве подстилки для мыши.
  2. Использовать клей (см. Таблицу материалы), прикрепить стекла крышка диаметром 20 мм в верхней части цилиндрическая металлический держатель (это будет Нижняя крышка стекла). Клей бокал покрытия 25 мм в нижней части плоский металлический держатель (это будет верхняя крышка стекла). Убедитесь, что крышка очки перекрываются примерно 2-3 мм с металлическими держателями и что остальная часть стекла остается свободной от жира и клей.
  3. Поместите курсор мыши на его обратно на марлю, перпендикулярно к строке натянутая, с головой, по центру между уха баров.
  4. Исправьте верхних конечностей мыши на сцену с хирургическая лента.
  5. Далее крюк строку в верхних передних резцов и затянуть до тех пор, пока челюсть достигает горизонтальное положение. Использование угловой Изогнутый пинцет слегка вытащить язык из полости рта, которая облегчает дыхание.
  6. Плотно, но не сильно тянуть хвост и ленту его на сцену.
  7. Выравнивание панели уха для достижения угол около 30° между баром и края сцены. Чтобы этот угол, использовать треугольник правитель нарисовать на листе бумаги под углом в 30° вправо и влево и место прозрачный этап на бумаге, чтобы выровнять владельцев соответственно.
  8. Исправьте челюсти между брусьями уха, одновременно перемещая панели левой и правой внутрь до тех пор, пока челюсть сперматозоидов и затяните винты. Наблюдать за груди движения до, во время и после фиксации в челюсть. Снижение или отсутствие дыхания показывает, что панели крепятся на шею, не кость челюсти; в этом случае повторите крепления немедленно.
  9. Обогрева с мышью, например, путем размещения Отопление лампа поблизости или грелку под сцену.

4. Хирургическое воздействие слюнной железы с помощью стереомикроскопом

Примечание: Следующие шаги требуют использования стереомикроскопом, тонкой щипцы и хирургические ножницы. Поскольку процедура терминала, нет необходимости поддерживать стерильных условий эксплуатации. Этанол очищены инструментов достаточно.

  1. Найдите приблизительное положение правой доли SMG, глядя на небольшое выпуклость в кожу около 15 мм хвостовой рот и 5 мм медиальной линии челюсти. Поднять маленький кожную складку в центре выпуклость и сократить его для создания и открытия примерно 5 мм длины.
  2. Немедленно применить 4 мм высокий кольцо вакуумные масла на кожу вокруг разреза. (Используйте вакуума заполнена смазкой шприц с иглой подкожных притупляются 25 G).
  3. Заполните смазкой кольцо с солевых чтобы убедиться, что ткани остается влажной во время операции.
  4. Под стереомикроскопом, нарушить соединительной ткани, используя следующую процедуру: используйте один прекрасный щипцы твердо держать часть соединительной ткани, непосредственно подключенные к ГОБ и второй щипцы для тянуть дистальной соединительной ткани, до тех пор, пока он лопается. Убедитесь, что некоторые соединительной ткани остается прикрепленным к ГОБ; Это желательно, поскольку она позволяет обработку. Не прикасайтесь самой железы пинцетом, так как это вызовет кровоточивость.
  5. Повторите это движение нарушения соединительной ткани сначала поверх железа, а затем на медиальной стороне (между правой и левой доли SMG). Не отделить сублингвального от подчелюстной железы.
  6. Продолжить удаление боковой соединительной ткани, против часовой стрелки вокруг SMG (медиальнее каудально, чтобы дистальнее ростральной).
  7. Убедитесь, что кровоснабжение, эфферентных лимфатических и Слюнных протоков, которые все расположены в пачке на объекте черепной железы, не разрыв.
  8. После боковой соединительной ткани нарушается, используйте пинцет, чтобы вытащить соединительной ткани, приложенный к хвостовой конец SMG вверх, чтобы снять хвостовой конец SMG. Нарушить соединительной ткани ниже доли SMG, начиная от хвостового и движется в направлении конца Ростральных.
  9. Продолжайте, пока соединительной ткани ко всем сайтам SMG удаляется (за исключением ростральной сайт с крупных кровеносных сосудов, подачи/слива и WD).

5. Фиксация железы

  1. Убедитесь, что кольцо смазка, проведения физиологического раствора по крайней мере 4 мм, высокий и не утечка (см. шаг 4.2).
  2. Установка нижней крышки стекла (см. шаг 3.2) путем присоединения к ее высота регулируемый держатель металлический бар. Убедитесь, что держатель крышки выскальзования корректируется upmost позицию и не прикасайтесь кольцо смазка при подключении к сцене. Расположите держатель из хвостового направления на угол около 60° к мыши, покрытие скольжения охватывающих примерно две трети (хвостовой и дистальной части) подвергаются доли. Нижняя крышка стекла пока он делает контакт с сальником.
  3. Полное кольцо смазкой верхней крышки стекла для формирования новой солевой водохранилище.
  4. Осторожно потяните лепесток SMG верхней крышки выскальзования с щипцами, только прикосновения соединительной ткани, прилагается к нему (орган может быть отражено с сайта снизу вверх).
  5. Убедитесь, что кольцо смазка имеет даже высоту по крайней мере 4 мм и не приводили к утечке. При необходимости, пополнения, физиологический водохранилище, используя 30 G шприц заполнены с saline.
  6. Убедитесь, что крышка стекла держатель для верхней крышки стекла в своем upmost положении. Используйте винт придает металлический держатель с 25 мм стекла верхняя крышка держателя. Используйте регулируемые винта держателя для размещения покровным стеклом так что SMG центрируется в середине.
  7. Используйте винты регулируемый держатель для снижения верхняя крышка стекла, до тех пор, пока он напрямую контактирует SMG. Соблюдайте форму и окраску железы во время этого шага. Если поверхность железы появляется больше, или окраска меняется (например, от розового до белого), немедленно поставить Стекло покровное на более высокую позицию, чтобы ослабить давление на SMG.
  8. Проверьте в солевой резервуар для утечки, ищет пузырьки воздуха, и или капли солевого раствора вне резервуара. При обнаружении утечки или воздушный пузырь, удалите крышку скользит и все жир и перезапустить из шага 2.
  9. Винт закрыл все винты фиксации.

6. Крепежные кольца Отопление и датчик температуры

  1. Вставьте датчик температуры в водохранилище и расположите его рядом с железой, а затем ленточный провод датчика на сцену.
  2. Применить кольцо смазкой к верхней крышки скольжения, с SMG в центре (диаметр кольца смазка должна соответствовать диаметр кольца Отопление). Установите кольцо Отопление на верхней части крышки выскальзования и печать с жиром. Лента трубы Отопление кольца на сцену.

7. обработка изображений

Примечание: Мы используем вертикальном двух Фотон Микроскоп систему, оборудованную Перестраиваемый лазер сапфировый и флуоресцентный микроскоп с погружения в воду 20 X или 25 X целей. Реальном времени коррекции смещения тканей во время приобретения может осуществляться с помощью автоматизированных стадии и VivoFollow19. Это улучшает стабильность захвата изображений, но не является обязательным.

  1. Включите систему вертикально микроскопии с помощью соответствующего программного обеспечения, предоставленного изготовителем микроскопа. Настройка сапфировый лазер с длиной волны возбуждения 780-900 нм.
  2. Подключите Отопление трубы Отопление кольцо. Перистальтический насос циркулирует через кольцо, чтобы согреть SMG горячей водой (с подогревом, погружаемой части трубопровода в ванне воды 80° C).
  3. Подключение датчика температуры к цифровой термометр. Отрегулируйте скорость перистальтического насоса, если температура не между 35-39 ° C. Чем быстрее работает насос, чем теплее объект получает и наоборот.
  4. Перед началом загрузки изображений, выполните визуальный контроль скорости потока крови. Тщательно проверьте лейкоцита проход через тонкие капилляры или путем инъекции флуоресцентные декстрана.
    Примечание: Внутривенно вводят флуоресцентные декстрана будет немедленно заполнить всю сосудистую SMG когда поток крови физиологических. Это практически всегда случай в этой процедуре.
  5. Следовать иммунные клетки, изображения глубина обычно находится между 20-150 мкм ниже поверхности SMG, выявленные сигнала гармонических поколения 2nd . Стеки изображений рекордно 150-300 мкм поля зрения с пикселей примерно 512 x 512 или выше и z глубины 20-60 мкм с шагом 2-4 мкм между изображениями. Повторяйте каждые 20-30 s стека приобретение для общей продолжительностью 20-60 мин.
  6. Используйте цифровой термометр для контроля уровня минимальной и максимальной температуры после приобретения одного изображения последовательности. Сбросить последовательность изображений, если минимум или максимум не находятся в диапазоне от 37 ± 2 ° C. Наполните водой для погружения цели между последовательностями изображений.
  7. В конце сессии изображений усыпить мышей CO2 удушение под наркозом.
    Примечание: Это в соответствии с швейцарских федеральных руководящих принципов экспериментов на животных; другие руководящие принципы для эвтаназии могут применяться в других местах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол позволяет изображений почти всей дорсальной и вентральной стороне SMG. Поле зрения обычно также включает в себя сублингвального слюнной железы, которая немного отличается от SMG в клеточный состав4. Обе железы инкапсулируется фибриллярного коллагена и разделить лопастями. Большинство 2 PM систем может производить лейбл свободный образ фибриллярного коллагена, измеряя 2nd гармонического сигнала, но обычно флуоресцентных молекул необходимы для визуализации клеточных и внутриклеточных структур. К примеру вездесущие трансгенных выражение зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) в сочетании с 2nd гармонического сигнала достаточно для выявления ацинусов, воздуховодов и кровеносные сосуды в SMG по их морфологические особенности. Эта настройка может использоваться для наблюдения за трансгенных флуоресцентные маркеры с ячейки типа конкретное выражение для определения подмножества определенных ячеек. На рисунке 2 показана сеть ofCOL1A1-GFP репортер выражая фибробластоподобных клеток соединительной ткани. Также изображены кровеносных сосудов, обозначены внутривенные инъекции флуоресцентные краски в сочетании с высокомолекулярного декстрана. Отсеке Люминал протоков также могут быть помечены (рис. 3), когда краситель вводят retrogradually в WD29.

Figure 1
Рисунок 1 : Настроить этап. (и *) два свободно регулируемые держатели для покрытия накладных; (b и b *) регулируемые стереотаксической уха баров; (c) в строку, которая может быть затянуты с винтом; (d свободно регулируемый металла, Отопление кольцо; (e) поднял отведенном для место туловища мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Сеть COL1A1-GFP выражая клеток (зеленый) и сосудистую маркер (красный). Сосудистую обозначены внутривенным введением Техас красно декстран конъюгата (70 МВт кДа). Фибриллярного коллагена между двумя лопастями визуализируется как 2-й гармоники сигнала (синий). Показан один z проекция 15 сложены изображения с глубиной 47 мкм. Шкалы бар = 40 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Люминал протока, помечены после инъекции WD. Кровеносные сосуды, помечены 70 кДа МВт Техас красно декстрана (красный), просвет протока помечены Каскад сине декстрана (белый; 10 кДа МВт) через Ретроградная инъекции через WD и восприимчивую передаваемых GFP+ CD8+ T клетки (зеленый) в ГОБ. Показано это один z проекция 27 сложены изображения с глубиной 50 мкм. Шкалы бар = 40 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол предоставляет простой подход для обработки изображений в vivo мышиных сублингвального и подчелюстных слюнных желез, с помощью вертикально-нелинейная микроскопии, часто используется в области иммунологии. Метод может быть адаптирована для отображения других экзокринных желез в регионе головы и шеи. Например наша лаборатория выступала изображений слезной железы аналогичным образом (не показан).

Удаление соединительной ткани вокруг ГОБ является наиболее важным этапом этого протокола, так как может произойти повреждение случайного тканей. Повреждение основной кровоснабжение SMG требует немедленное прекращение эксперимента, так как ткани SMG станет гипоксических. Если поврежден самой ткани SMG, кровотечение обычно останавливается естественно коагуляции. Однако его необходимо рассматривать что травмы вызывает стерильные воспаление и провоспалительных цитокинов выпустить30, которые могут повлиять на экспериментальной индикация. Чаще, но меньше критической осложнений во время микрохирургии являются утечки в солевой водохранилище. Чтобы свести к минимуму возникновение утечки, всегда Нанесите смазку сухой, лысый кожи. Исправления утечки обычно бесполезно: вместо этого, удалите все смазки, протереть кожу сухим ватным тампоном и повторно с нуля.

Во время визуализации, должна поддерживаться температура рядом физиологических тела температуры (приблизительно 37 ° C для мужчин и женщин C567BL/6 мышей31). Поскольку как гипо - и гипертермия изменить крови поток32,33, в этих условиях нельзя предположить физиологические функции ГОБ. Однако, мы наблюдали никакой разницы в поток крови или Т-клеток подвижности во время малого (± 2 ° C), переходные (< 5 мин) отклонения от оптимальной температуры.

Сведение к минимуму движения ткани имеет важное значение для хорошего качества изображений. Различные виды нежелательных ткани движения может произойти и имеют типичные причины, которые могут пройти устранение неполадок. Во-первых непрерывной xyz дрейф обычно вызвано SMG медленно дрейфующие обратно в исходное положение через прилагаемый соединительной ткани. Это происходит, если нижняя крышка стекла была установлена слишком высокая, или соединительной ткани вокруг SMG тщательно не нарушалась. Во-вторых медленной и постоянной z дрейф может возникнуть, если температура неустойчива. В этом случае тщательно регулировать нагрев и ждать температуры стабильной, примерно в 15 мин до изображений. Наконец пульсирующие движения ткани происходит, когда солевой камере не опечатаны плотно. Давление создает и выпускает в солевой камере с каждым циклом дыхания. В сочетании с утечки или воздушных пузырей это приводит к пульсирующей жидкости потоков, которые напрямую перевести SMG ткани. В этом случае сборка крышки очки и солевой камере является наиболее надежным решением.

Максимальная изображений глубина зависит от длины волны возбуждения используется и флуорофоров занятых. Как и практически все прижизненные изображения установок красный смещается красителей или флуоресцентных белков, которые могут быть возбуждены с длиной волны (900-1100 Нм) позволяют более глубокие ткани, чем зеленые красители и короче возбуждения изображений волн.

SMG используется в качестве модели органа для эндо - и экзоцитоз и мембраны, Ремоделирование,3,27,28, инфекции34, аутоиммунные заболевания11и опухоли биологии12. Она далее позволяет много форм манипуляции: красители, фармакологические соединений и антитела могут быть доставлены в железы через поток крови. Кроме того SMG могут быть направлены непосредственно через катетеризации WD, который был использован для доставки вирус11, декстраны3, ДНК25, красители29или фармакологических агентов3.

Прижизненные изображения области продолжает прибыль от постоянно растущий инструментарий генетических и биохимических люминесцентные маркировки методы. Достижения в области генной инженерии обеспечивают мыши линии и линии клетки с сложные флуоресцентных маркеров. Недавние примеры маркировки определенных ячеек подмножеств (CD11c+ клетки35) или динамические Белки цитоскелета (36Lifeact), photoconvertible маркеры для отслеживания 37и в реальном времени Репортеры ядерных клеток Транслокация (NFAT38) или кальция, сигнализации39. Другие приложения могут использовать флуоресцентных зондов биохимических, которые освещают конкретные субцеллюлярные отсеков (например дна связывая 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) или липофильных мембраны красители). Современные НЛО микроскопии предлагает множество возможных решений лучше всего ответить на экспериментальный вопросы. Например сильно увеличить максимальный приобретение скорость40был разработан мультиплексированных двух фотонных изображений. Другие методы предлагают лейбл бесплатно multiphoton изображений, создания второй или третьей гармонических сигналов15, или путем измерения характерные резонансной вибрации молекул (последовательной Антистоксовый комбинационного рассеяния)41. Таким образом когда доступны практически процедуры для экспозиции ткани и стабилизации, пределы экспериментальный дизайн основном устанавливаются экспериментатора ресурсов и творчества.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась швейцарского национального фонда (СНФ) проект Грант 31003A_135649, 31003A_153457 и 31003A_172994 (для СП) и Леопольдина стипендии 2011 ЛПДС-16 (BS). Эта работа, выиграли от оптических установок «микроскопия Imaging центр» (MIC) Бернского университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45, (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117, (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53, (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133, (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44, (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108, (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189, (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10, (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2, (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28, (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297, (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108, (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216, (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10, (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46, (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38, (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13, (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5, (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7, (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25, (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34, (9), 642-650 (2003).
Подготовка мышиных подчелюстной слюнной железы вертикально прижизненной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter