Summary
תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.
Abstract
עיצור מכתשי, מקרופאגים הם מקרופאגים סופני הבדיל, ריאות-תושב ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים מכתשי הייחודיות שלהם חיים ארוכים, שלהם תפקיד חשוב פיתוח ריאות ו פונקציה, וכן מותאם לשפות אחרות ריאות התגובות שלהם זיהום ודלקת. נכון להיום, אין שיטה אחידה זיהוי, בידוד של טיפול של מקרופאגים מכתשי מן בני אדם ועכברים קיימת. השיטה יש צורך במחקרים על אלה תאים חיסוניים מולדת חשוב במסגרות שונות ניסיוני. השיטה המתוארת כאן, אשר יכולים לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה, היא גישה מפושטת קציר מקרופאגים מכתשי נוזל שטיפה bronchoalveolar או רקמת הריאה, שמירה על אותם בתוך חוץ גופית. מאחר מקרופאגים מכתשי מתרחשים בעיקר בתור תאים חסיד של alveoli, המיקוד של שיטה זו הוא על הם מוציאים אותם לפני הקציר וזיהוי. הריאה הוא איבר מאוד vascularized, סוגי תאים שונים של תאים מיאלואידים ומקור הלימפה המאכלסים, אינטראקציה, והם מושפעים microenvironment הריאה. באמצעות הסט של סמני פני השטח המתואר כאן, חוקרים יכולים בקלות באופן חד משמעי להבדיל מקרופאגים מכתשי לבין אחרים לויקוציטים, לטהר אותם ליישומים במורד הזרם. שיטת תרבות פיתח בזאת תומך אנושיים והן העכבר מקרופאגים מכתשי לצמיחה בתוך חוץ גופית ו תואמת ללימודי תאית ומולקולרית.
Introduction
Microenvironment ריאות הוא מערכת אקולוגית מורכבת באופן ייחודי עם צינור אוויר משוכללים, להערכת. האוויר הנשאף נוסע דרך קנה הנשימה ודרך אינספור ענפי הסמפונות bronchioles לפני שהגיע alveoli, שבו מתרחשת ההחלפה גז דם-אייר. עקב אינטראקציה ישירה עם האווירה, השטח הנשימה מחייבת הגנה מפני השפעות מזיקות של חלקיקים מוטס מזהמים. מספר המחסומים פיזי, כימי, אוטואימונית להגן על הריאות. ראוי לציין, פריסה של phagocytes על פני הנשימה מגישה מערכת ההגנה קו ראשון חשוב. מכתשי מקרופאגים (AMs) הן סוג אחד של phagocytes ריאות תושב, הם מהווים את הרוב המכריע של הבריכה מקרופאג ריאות. כפי שמרמז שמם, AMs המותאמות לשפה בעיקר לומן מכתשי, להתרחש כמו תאים sessile כל הזמן לטעום את האווירה הסביבתית ולתקשר עם האפיתל מכתשי1. מצב יציב בריאות יותר מ 95% של phagocytes בחלל מכתשי הם AMs2, של מי הרכב עשוי לשנות עקב דלקת, זיהום או חשיפה כרונית לחומרים מזהמים.
AMs להשתתף במגוון רחב של פונקציות שעשויות להיות מקומי אל הריאות ו/או חשיבות מערכתית. לדוגמה, AMs חיוניים להתפתחות ולתפקוד מיטבי של הריאות; מעקב המערכת החיסונית; סיווג של פסולת הסלולר, פתוגנים פולשים, בשאיפה חלקיקים3,4,5,6,7. דלדול יישוב של AMs ידוע לפגום סיווג של הנשימה וירוסים, חיידקים4,8. מלבד להיותם phagocytes ולוחמים השורה הראשונה של הומאוסטזיס ריאתי, AMs ידועים לתפקד כתא תאים אנטיגן הצליחו יותר במשיכת T חסינות9, potentiating את היעילות של החיסון תוך-אפי10 ו המשפיעים על מחלת חיסון עצמי בעל הגבלת הריאות אחרי11,השתלת ריאות12. ליקוי בתפקוד AM נקשר proteinosis מכתשי ריאתי (PAP), מצב הנובע מוטציה גנטית, ממאירות או זיהום זה פוגע סיווג פיתחה ריאתי13,14. עכשיו הוא להיות חקר השתלת של AMs כמו גישה טיפולית לטיפול של PAP 15,16.
AMs ידועים מקורם במהלך מופרה, מתעקש הריאות לאורך החיים מבלי להיות מוחלף על ידי במחזור לויקוציטים2,17. אמנם, מחזור AM לגילוי homeostatic בריאות, רמות משתנות של מחזור AM דווחו בתנאים מסוימים קליני כולל זיהום על ידי וירוס שפעת4, הקרנה myeloablative18, חשיפה אנדוטוקסין 19, לגיל20. AMs האמינו לחדש עצמי באמצעות התפשטות בדרגה נמוכה17,21, אך מחקרים אחרונים טוענים כי ומונוציטים יכולים להצמיח אוכלוסיה של הריאה קרישה תוך-כלית מקרופאגים22,23 תחת תנאים ניסיוני, אבל הפונקציונליות של מקרופאגים ריאתי שהומר לאחרונה אלה טרם יוגדר על מחלות ריאה. יתר על כן, הבנת את סף הגירוי בהקשר של הפעלת AM היא אזור שעשוי להיות מעניין, כפי הריאה מנסה לשמור על איזון בין אותות דלקתיים המכונות immunoregulatory.
התיקונים הפיזיולוגיות או פיפטות להוביל לאובדן של ויסות מערכת החיסון חשובים להערכה במסגרות קליניות שונות (למשל, זיהומים בדרכי הנשימה, מחלות ריאה דלקתיות, מחלות ריאה שהותירה). למרות זאת, AMs מזוהים יותר ויותר מחוונים או אפילו גורמים של בריאות ריאתי11,24. כיום, ישנם פרוטוקולים מאוחד לא זמינה עבור קציר, אפיון, ו/או AMs לשמירה על בני אדם, במודלים מאתר פרה. היעדר קונצנזוס על סימנים מקדימים AM ו פנוטיפים ולאחר היעדרות של מתודולוגיה מפורט היה המחסום העיקרי בפיענוח תפקידים בבוקר על ריאות בריאות ומחלה. להלן כללי התנהגות מציע לנו זיהוי ודאי, בידוד, במבחנה אסטרטגיה תרבות מאוד לקדם את ההבנה של התנהגות AM, להקל על מחקרים האבחון והטיפול, ממוקדות AM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה (IACUC), את המוסדיים סקירה לוח (IRB) בבית החולים סנט גוז'ף המרכז הרפואי.
1. בידוד של AMs של נוזל Bronchoalveolar מאתר שטיפה (BAL)
- להרדים על העכבר C57BL/6 בת שבוע 8 עם קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (12.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) קוקטייל באמצעות הזרקה בקרום הבטן. המשך כאשר העכבר משיגה הרדמה כירורגית עם אובדן רפלקסים והרפיה של השרירים.
- הנח את העכבר על משטח חיתוך עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה. הוטרינר אופטלמולוגיות משחה למרוח את העיניים כדי למנוע התייבשות, לנגב את המשטח הגחון כל של העכבר עם רפידות ההכנה סטרילית אלכוהול רווי אלכוהול איזופרופיל 70% לחטא.
- הר העכבר כל ארבע רגליים מרוסנת.
- בעדינות פתח את חלל הבטן בעזרת כלי ניתוח מיקרו. חייבים להקפיד לפתוח כמה שטח ככל האפשר מבלי לפגוע בכל האיברים מהבטן או יצירת רקמות לראשיכם.
- בעדינות פתח בחלל בית-החזה על ידי לאט אם הצלעות דרך חלל החזה. באופן אידיאלי, הצלעות אפשר להוציא מצד לצד. קיצוני חייבים להקפיד שלא לפצוע את קרום הריאות של הריאות בעת פתיחת בחלל בית-החזה.
- אתר הכלילי התחתון ולאחר בחתך לדמם את העכבר. השתמש סופג כותנה רפידות לספוג את הדם.
- להזריק 10 מ ל תמיסת מלח קרה כקרח פוספט buffered (PBS) לתוך החדר הימני (באמצעות מזרק 10 מ"ל ואת המחט 25 גרם) ריקון כדוריות הדם במחזור. לספוג את זרימת הדם עם ריפוד סופג כותנה. ברגע לגמרי perfused, הריאות יופיעו blanched והם מוכנים ואז שטיפה.
- בעדינות לחתוך את העור, שריר בצוואר כדי לחשוף את דרכי הנשימה. בזהירות לסלק את השרירים סמוכים, הסחוסים, רקמות שומן ללא פגיעה קנה הנשימה.
- עושים חתך קטן (< 2 מ מ) על קנה הנשימה האחורי הגרון. החתך צריך להיות מספיק כדי להכניס צנתר אל תוך קנה הנשימה עדיין מחובר הגרון. נחדיר קטטר 22 גרם 1 אינץ בלי מחט לתוך קנה הנשימה אל הריאות. מאובטחים הצנתר בתפר קלועה משי (4-0; המוזרק) עם קשר מרובע.
הערה: הצנתר צריך להיות מעוטרים בהתבסס על גודל העכבר. קטטרים מאוד קצרים או ארוכים נוטים לדלוף ו/או לקרוע את דרכי הנשימה במהלך שטיפה. קטטר אורך צריך להיות כזה כי כאשר מוכנס שרידי עצה טוב בתוך קנה הנשימה, לא להגיע הסמפונות העיקריים. - לצרף מזרק 1-mL מלא קפואים BAL מאגר (Ca2 + ו מ ג2 + PBS חינם + 1 מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה, EDTA) את הקטטר, לאט לאט להחדיר את המאגר לריאות. זה מנפח הריאות. לשמור את המזרק מחובר הקטטר למשך חמש שניות, ואז האחות נוזל שטיפה על ידי משיכה עדינה הבוכנה. זה השטחת קצה הריאות. לאסוף את הנוזל 15 מ"ל צינור חרוטי המוטלות על קרח.
- חזור על שלב 1.10 9 פעמים יותר, בריכה נוזל שטיפה. לא יעלה על 1 מ"ל מאגר פלאש, זה עשוי לחרוג ריאות, להוביל את הקרע.
- המתת חסד את העכבר עם CO2 יתר על-ידי פרוטוקול IACUC אושרה.
- Centrifuge את הנוזל 10 מ ל BAL ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בגדר התא מכיל תאים BAL.
התראה: בגדר עשוי להיות קטן מאוד, אז לנקוט זהירות בעת כ רפה בעברית את תגובת שיקוע. - Resuspend התאים BAL μL 100 של זרימה/מיון מאגר (PBS + 2% חום לא פעיל העובר שור סרום (FBS) + 1 מ"מ EDTA + 25 מ מ של חומצה N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)).
- לחסום את האיגוד לא ספציפית נוגדנים לקולטן Fc על-ידי הוספת בלוק Fc העכבר (לשבט 2.4G2, μg/מ"ל), המקננת במשך 20 דקות על קרח.
- לבצע נוגדן מכתים יחד עם פלורסצנטיות מינוס אחד (FMO) ושולט יחיד-כתם11,25. להעריך את הכדור התאים על ידי מנתח תא (ראה טבלה של חומרים) ואחריו ניתוח cytometry זרימה בתא יחיד על-ידי תוכנת ניתוח המתאים (ראה טבלה של חומרים).
- לבודד AMs על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית סדרן (ראה טבלה של חומרים) ישירות לתוך עכבר 1 מ"ל אני תרבות בינוני כאשר AMs מיועדות חוץ גופית בתוך התרבות או ויוו תא העברה. לחלופין, מיון AMs לתוך מאגר פירוק 1 מ"ל (ראה טבלה של חומרים) בתוספת 10 μL/mL β-Mercaptoethanol לחילוץ RNA.
2. בידוד של AMs של העכבר הריאה, תא בודד השעיה
- להרדים על העכבר C57BL/6 בת שבוע 8 עם קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (12.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) קוקטייל באמצעות הזרקה בקרום הבטן. המשך כאשר העכבר משיגה הרדמה כירורגית עם אובדן רפלקסים והרפיה של השרירים.
- הנח את העכבר על משטח חיתוך עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה. הוטרינר אופטלמולוגיות משחה למרוח את העיניים כדי למנוע התייבשות, לנגב את המשטח הגחון כל של העכבר עם רפידות סטרילית אלכוהול רווי אלכוהול איזופרופיל 70% לחטא.
- הר העכבר כל ארבע רגליים מרוסנת.
- בעדינות פתח את חלל הבטן בעזרת כלי ניתוח מיקרו. חייבים להקפיד לפתוח כמה שטח ככל האפשר מבלי לפגוע בכל האיברים מהבטן או יצירת רקמות לראשיכם.
- בעדינות פתח בחלל בית-החזה על ידי לאט אם הצלעות דרך חלל החזה. באופן אידיאלי, הצלעות אפשר להוציא מצד לצד. קיצוני חייבים להקפיד שלא לפצוע את קרום הריאות של הריאות בעת פתיחת בחלל בית-החזה.
- אתר הכלילי התחתון ולאחר בחתך לדמם את העכבר. השתמש סופג כותנה רפידות לספוג את הדם.
- להזריק PBS קר כקרח 10 מ"ל לתוך החדר הימני (באמצעות מזרק 10 מ"ל ואת המחט 25 גרם) ריקון כדוריות הדם במחזור. ברגע לגמרי perfused, הריאות יופיעו blanched והם מוכנים לקציר.
- שווייץ הריאות באמצעות ניתוק את קנה הנשימה, הדם והרצועות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ של קור בינונית ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM). לשמור את זה על הקרח עד השלב הבא.
- המתת חסד את העכבר עם CO2 יתר על-ידי פרוטוקול IACUC אושרה.
- להעביר את הריאות perfused לתוך תבשיל תרבות סטרילי ללא pyrogen 60 מ מ עם 3 מ ל DMEM. בעזרת מלקחיים לנתח להקניט את דרכי הנשימה וחומר קשה הרקמה הלא-ריאה אחרות, אם קיים. מינצ רקמת הריאה עם איזמל כדי < בגודל 1 מ מ.
- להוסיף 300 µg/mL Liberase TL ו- 5 U/mL DNase, לערבב על-ידי pipetting, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור במשך 25 דקות. בעדינות לערבב פעם אחת על-ידי pipetting אחרי 10 דקות.
- עוברים את הריאות dissociated דרך מסננת תא 100 מיקרומטר מותקן צינור חרוטי 50 מ. להשתמש בגב בוכנה של מזרק 1 מ"ל מחית את הגושים תא מסנן. שטוף את המסנן עם 20 מ ל שטיפת מאגר (PBS + 2% חום מוחלש FBS + 2 מ מ EDTA).
- צנטריפוגה ב 500 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא במאגר שטיפת 20 מ.
- חזור על שלבים 2.12 ו 2.13 פעמיים, שינוי מסנן ' ' הצינור בכל פעם. -השריה המסנן במאגר לשטוף יותר מ-5 דקות מגביר את התשואה AM. להכין התליה תא בודד על-ידי הוספת 100 μL זרימה/מיון המאגר כדי בגדר התא.
- לחסום את האיגוד לא ספציפית נוגדנים לקולטן Fc על-ידי הוספת בלוק Fc העכבר (לשבט 2.4G2, μg/מ"ל), המקננת במשך 20 דקות על קרח.
- לבצע נוגדן מכתים יחד עם FMO ויחיד-כתם פקדים11,25. להעריך את הריאה תאים על-ידי מנתח תא (ראה טבלה של חומרים) ואחריו cytometry זרימה בתא יחיד ניתוח על ידי ניתוח תוכנה.
- AMs מיון לפי סדרן התא (ראה טבלה של חומרים) ישירות לתוך עכבר 1 מ"ל. אני בינוני תרבות AMs מיועדות חוץ גופית בתוך התרבות או ויוו תא העברה. לחלופין, למיין AMs לתוך 1 מ"ל מאגר פירוק בתוספת 10 μL/mL β-Mercaptoethanol לחילוץ RNA.
3. בידוד של AMs של נוזל BAL אנושי
- לארגן העברה של נוזל BAL האדם מהמרפאה למעבדה ב 4 º C.
- Centrifuge הנוזל BAL (10-50 מ"ל) ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בגדר התא מכיל תאים BAL11.
- לשטוף את גלולה עם 20 מ ל שטיפת מאגר (PBS + 2% חום מוחלש FBS + 2 מ מ EDTA), צנטריפוגה ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- Resuspend BAL התאים נמצאים μL 100 של זרימה/מיון מאגר (PBS + 2% חום מוחלש FBS + 1 מ"מ EDTA + 25 מ מ HEPES).
- לחסום את האיגוד נוגדן ספציפי לקולטן Fc על-ידי הוספת בלוק Fc אנושי (שיבוט Fc1.3070, 25 μg/mL) המקננת במשך 20 דקות על קרח.
- לבצע נוגדן מכתים יחד עם FMO, יחיד-כתם פקדים11,24. להעריך את הכדור התאים על ידי מנתח תא (ראה טבלה של חומרים) ואחריו cytometry זרימה בתא יחיד ניתוח על ידי ניתוח תוכנה.
- AMs מיון לפי סדרן התא (ראה טבלה של חומרים) ישירות לתוך 1 מ"ל AM האנושי תרבות בינוני או 1 מ"ל פירוק מאגר בתוספת 10 μL/mL β-Mercaptoethanol.
4. in vitro לקשרי תרבות של AMs
- בעקבות תא המיון, לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- Resuspend האנושי AMs 1 מ"ל אדם בינוני תרבות AM [רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) 1640 בתוספת 10% FBS, 20% L-929 התרבות supernatant (כמקור של המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), הריכוז הסופי של 100 U/mL). פירובט נתרן 1 מ מ, 10 מ מ N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic חומצה (HEPES) ו 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי)]. באופן דומה, resuspend העכבר AMs 1 מ"ל העכבר AM תרבות בינוני [DMEM בתוספת 10% FBS, 20% L-929 התרבות supernatant (כמקור של M-CSF, הריכוז הסופי של 100 U/mL), 1 מ"מ נתרן פירובט, 10 מ מ HEPES ו- 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי )].
- ספירת trypan blue-להוציא התאים קיימא מאת מונה תא ולהתאים את הריכוז תא קיימא-עונה 1 פרק 106/mL.
הערה: באופן אידיאלי, עד כדי 5 x 105 AMs ניתן מבודד נוזל BAL שנאסף על העכבר זכר C57BL/6 בשבוע 8-10 הישן. התשואה AM מן התקציר הריאות העכבר משתנה וייתכן מעט פחות מזו של הנוזל העכבר BAL. התשואה AM נוזל BAL אנושי תלוי כמות הנוזל בל, הנפח הכולל של תמיסת מלח משמש את שטיפת, מצבו הקליני של החולה. - בהתבסס על התשואה והצורך ניסיוני, זרע תאי קאמרית שקופיות, תרבות מנות או תרבות מבחנות. באופן אידיאלי, זרע את AMs-עונה 1 פרק 10 /mL5בינונית 10 מ ל בקבוקון T25 תרביות רקמה.
- דגירה התאים חממה humidified 37 ° C עם 5% CO2 אווירה.
הערה: AMs יגדל כאשר תאים חסיד והם מאוד הגדלים לאט (הכפלת זמן > 7 ימים). - ב- 24 שעות לאחר זריעה, AMs צריך להיות חסיד, לא להיות מנותק על-ידי שינוי עדין של תרבות בינוני. להסיר את המדיום על ידי השאיפה מקצה אחד, לחדש בינונית טרייה מראש התחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
הערה: התאים כעת ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעות של גירויים לפיזיולוגיה AM. AMs גדל בשקופיות קאמרית יכול להיות מוכתם בנוחות עם נוגדנים המתאימים, והינם אידיאליים בעבור ויזואליזציה מיקרוסקופיים. להערכת cytometric זרימה, נקצרים AMs על ידי דגירה-אנזימטי תא בריא פתרון. - האחות המדיום תרבות ולהוסיף בריא פתרון מספיק כדי לכסות את המשטח תרבות (כ 2 מ"ל לכל T25 הבקבוק), תקופת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס של 5-10 דקות. גירוד לא יהיה צורך, לא מומלץ לגרד את התאים באופן מכני. טפח בעדינות בצדדים, להוסיף 1-2 מ ל זרימה/מיון מאגר, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק את הרוב של תאים חסיד.
- ללימודים RNA, lyse התאים ישירות על המנה תרבות על-ידי הוספת המאגר פירוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגישה cytometric זרימה כדי לזהות העכבר AMs מוצג באיור1. זה כולל ניתוח של ערכה מינימלית של הצורך בהבחנה AMs של אחרים phagocytes ריאות-תושב או ריאות הסתננות משטח סמנים. ניתוח דיפרנציאלית נדרש כדי לזהות באופן חיובי AMs של מקרופאגים אינטרסטיציאליות, תאים דנדריטים, נויטרופילים, ומונוציטים ו מקרופאגים ריאתי נגזר מונוציט להתרחש בתוך הריאות. התוכנית הבאה של סמני פני השטח יכול להיות מועסק להבחין בקלות מסוגי התאים אחד מהשני איפה AMs CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+,-Ab + /-, F4/80-, CD11b- ; מקרופאגים interstitial הם CD45+, CD11b+,-Ab +, CD64+, CD24–; CD11b + תאים דנדריטים הם CD45+, CD11b+, CD11c+,-Ab +, CD24+, CD64–; CD103 + תאים דנדריטים הם CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+,-Ab +, CD11b–; תאים Plasmacytoid Dendritic הם CD45+, CD317+, Siglec-ה+, Ly - 6 C+,-Ab -, נויטרופילים הם CD45+, Ly - 6 גרם+, CD11b+, CD11c- ,-Ab -Ly - C 6–, ומונוציטים הן CD45+, CD64+ /-, Ly - 6 C+ /-,-Ab -. האוכלוסיות AM מודגש ובאדום (CD11cהי ו Siglec-Fשלום), טורקיז (CD11c. היי, Siglec-Fint), בהתאמה, מייצגים AMs קונבנציונאלי (האוכלוסין הגדולים) ו- (נגזר מונוציט מקרופאגים ריאתי מינורי באוכלוסייה) אשר מתרחשים במרחב מכתשי. זרימה מיון CD45+, CD11c. היי, Siglec-Fשלום תאים התשואות מטוהרים העכבר AMs. איור 2 ממחישה את תא השטח סמני הדרושות זיהוי מדויק ובידוד של AMs אנושי. AMs האדם מזוהים באופן חיובי על היותך CD45+, CD11b+, ד ר+הלע, CD163+, CD169+, ו CD206+ BAL תאים, וניתן זרימה מיון עבור יישומים במורד הזרם.
איור 1 : זרימה נציג ניתוח cytometric של העכבר AMs. (א) מיקום אנטומי AMs במקטע העכבר ריאות רקמות (hematoxylin ואאוזין). AMs מסומנים עם חיצים, סרגל קנה מידה 60 μm. (B) cytometry זרימה נציג gating אסטרטגיה כדי לזהות העכבר AMs בתאים BAL. דוגמאות הוערכו על ידי מנתח תא, הנתונים היו למטה שנדגמו לאירועים 500 להשוואה על ידי תוכנת ניתוח. כחול-ירקרק (CD11c. היי, Siglec-Fint), אדום (CD11cהי ו Siglec-Fשלום) בהתאמה, הם AMs קונבנציונאלי (האוכלוסין הגדולים) נגזר מונוציט ריאתי מקרופאגים (מינורי באוכלוסייה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : זרימה נציג ניתוח cytometric של האדם AMs. (א) Gating אסטרטגיה לזהות AMs אנושי מ BAL נוזלים מושתלי אמבריולוגיה. Micrograph שדה בהיר (B) של האדם AMs-שבעה ימים של תרבות. סרגל קנה מידה הוא 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMs הם חיים ארוך ריאות תושב מקרופאגים that לאכלס את הריאות החל בלידה, ומתמשך לאורך כל תוחלת החיים26. תפקידיהם פיזיולוגיה ריאתי7 ופתולוגיה12 ו את הפוטנציאל שלהם כדי לנבא מחלת חיסון עצמי ריאתי24 זוהו. כי AMs יש נוכחות ארוכת טווח הריאות11,27 , כי הם מעורבים ההפעלה והתקדמות של11,תגובות חיסוניות24, שלהם תפקידים ב אחרים ריאות כרונית דלקתית, שהותירה מחלות צריך להעריך. מבחינה היסטורית, AMs היו זהות מבולבלת והוא היו לעיתים קרובות טעינו בזיהוי. עם סמנים פנוטיפי אימצה לאחרונה25,28, עכשיו זה אפשרי כדי להבחין בין אדם ועכבר AMs של phagocytes ריאתי אחרים (למשל, בין-תאי מקרופאגים ריאות תאים דנדריטים, מונוציט נגזר מקרופאגים ריאתי). השיטות המתוארות כאן מוטבו עבור בידוד, in vitro לקשרי תרבות של האדם AMs של עכבר. למרות פרוטוקולים אלה יכולים להיות בהרחבה אימצו AMs ממינים אחרים, נחישות פנוטיפי המתאימות וצריך להתנהל להקים קבוצת "דרשו מינימלית" את פני השטח סמנים עבור אפיון מעמיק.
עבור בידוד של AMs מאתר על ידי שטיפה, הכללת chelating הסוכן (קרי, EDTA) ו מראש מצמרר המאגר BAL נמצאו חשוב במחקר הנוכחי. מכיוון AMs חסיד אל הקיר מכתשי, השימוש PBS לבד היה יעיל בהם מוציאים את התאים והפיק תשואה נמוכה יותר באופן משמעותי. אבטחת התקנה של הקטטר לקנה הנשימה הינה צעד קריטי נוסף. צריך לקחת כדי להבטיח קובץ מצורף עמיד בפני נזילה זה ממזער אובדן נוזלים BAL. יש צורך לנקוט משנה זהירות בעת lavaging עכבר צעיר (< בן 6 שבועות), כמו העדינות מבנית של חוליות הצוואר עלולה לקרוע או דליפה במהלך שטיפה. התקנת שני ברציפות תפרים שאינם חופפים לעיתים קרובות מבטיח קובץ מצורף מאובטח של הקטטר ומונעת דליפות. למרות שאינם אנזימטי דיסוציאציה (כלומר., עם מאגר chelator בתוספת) היה רק לבידוד AM במחקר זה, זה אפשרי כי דיסוציאציה אנזימטי עם collagenase במהלך שטיפת ריאות אולי לייצר תשואה טובה יותר בבוקר.
התשואה של האדם מימק BAL נוזל הוא משתנה. AMs מהווים כמעט 10% של כל התאים BAL שנאסף אמבריולוגיה המקבלים במכון החזי נורטון במהלך מעקב שגרתית ריאות שלאחר ההשתלה, התשואה AM הכולל תלויה במספר משתנים. משתנים כגון כוללים מצבו הקליני של החולה, נפח תמיסת מלח בשימוש שטיפה הנפח של נוזלים BAL מעובד לבידוד AM. הליכי קדם שטיפה (למשל, ביופסיות מחט) כי התוצאה microhemorrhage לשנות את הרכב הסלולר BAL תאים; עם זאת, יישום של סמנים פנוטיפי מאפשר ברורה וחד משמעית זיהוי ואפיון של הבריכה AM אנושי (איור 2).
השימוש L-929 מיזוג בינוני (מקור של M-CSF) היה צורך במבחנה קיום AMs. האני מאמין שלנו, כי תוספת של מ' מטוהרים-CSF יהיה מספיק לקיים את AMs בתרבות; עם זאת, ריכוז ממוטבת צריך להיות הסתדר אנושיים והן ועכבר AMs. הפח תאים בתרבית בשימוש במחקרים על אנדוציטוזה, בתגובה לדלקת, מצגת אנטיגן, התבגרות/הפעלת מצב או assay אחרים המחייבת תחזוקה של תאים חיים זמן-קורס ניתוח11,24 . במהלך מחקר זה, שזה לא נסיון לשמור על AMs קו בתרבית ללא הרף, רק לטווח קצר מחקרים מסוף (< 30 ימים מאז קציר) בוצעו. לכן, מגבלה הברור בשיטה זו הוא חוסר נתונים תרבות לטווח ארוך, במיוחד על יציבות של התאים (קרי, אם AMs יכול לגדול סופית או רציף קו, התגובה של AMs cryoprotectants, הקפאה קריוגנית, ו סחיפה פנוטיפי ו/או genotypic) לאחר תרבות מתמשכת. AMs ארוכות חיים תאים שלהם in vivo , מידה מסוימת של וריאציה צפוי בין התאים מבודד מן הריאות בריא ואני מאלה שעברו זיהום בדרכי הנשימה או תגובות דלקתיות/אוטואימוניות.
בסך הכל, השיטה המוצגת כאן מסמכים בגישה פשוטה כדי לבודד, אפיון, ועל שמירה על האדם והעכבר AMs במערכת התרבות תאים. למרות פרוטוקול זה ניתן בהמשך למטב בהתאם לצרכים ניסיוני, הוא עשוי לשמש כפרוטוקול למתחילים לנתח את הרלוונטיות פונקציונלי של AMs מחלות נשימה ורפואה ריאתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
אנו מודים קלייר פרנדרגסט לקבלת סיוע בעריכה את כתב היד. DKN נתמך על ידי מחקר מענק (#2095) של קרן Flinn, TM נתמכת על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01HL056643 ו- R01HL092514). DKN פיתחו את השיטות המחקר תוכנן, כתב היד; אום סייע עם מחקרים שנעשו בבעלי חיים והרכש הדגימה הקלינית; SB סייע עם זרימה cytometric ניתוח ומיון תא; TM ומפוקח המחקרים שנסקרו כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
