Summary
Это сообщение описывает методологий для изоляции и культуре альвеолярных макрофагов от людей и мышиных моделях для экспериментальных целей.
Abstract
Альвеолярные макрофаги являются безнадежно дифференцированной, легких резидентов макрофаги дородовой происхождения. Альвеолярные макрофаги являются уникальными в их долгой жизни и их важную роль в разработке легких и функции, а также их локализованные легких ответов на инфекции и воспаления. На сегодняшний день, существует не единый метод для идентификации, изоляции и обработки альвеолярных макрофагов от людей и мышей. Такой метод необходим для исследования на эти важные врожденные иммунные клетки в различных экспериментальных условиях. Метод, описанный здесь, который может быть легко принят любой лаборатории, это упрощенный подход для уборки альвеолярных макрофагов с Бронхоальвеолярный лаваж жидкости или из легочной ткани и поддержание их в пробирке. Потому что альвеолярные макрофаги главным образом происходят как адэрентных клеток в альвеолы, этот метод посвящен выбить их до сбора урожая и идентификации. Легких является весьма васкуляризированной органом, и различные типы клеток миелоидного и лимфоидных происхождения населяют, взаимодействуют и находятся под влиянием легкого микроокружения. С помощью набора поверхностных маркеров, в описанный здесь, исследователи могут легко и однозначно отличить от других лейкоцитов альвеолярных макрофагов и очищают их вниз по течению приложений. Здесь разработанный метод культуры поддерживает оба человека и мыши альвеолярных макрофагов в пробирки роста и совместим с клеточной и молекулярной исследований.
Introduction
Микроокружения легких является уникально сложной экосистемы с каналом разработки воздуха и сосудистую. Вдыхаемый воздух проходит через трахею и многочисленные филиалы бронхов и бронхиол до достижения альвеолы, где происходит обмен газа крови воздух. Из-за прямое взаимодействие с атмосферой дыхательную поверхность требует защиты от потенциально вредного воздействия частиц и загрязнителей. Количество физических, химических и иммунологических барьеров защитить легкй. В частности развертывания фагоцитов на дыхательную поверхность обслуживает систему важной первой линии обороны. Альвеолярных макрофагов (AMs) являются одним из видов легких резидентов фагоцитов, и они составляют подавляющее большинство легких макрофагов бассейн. Как их названия, AMs преимущественно локализуются в просвете альвеол и происходят как сидячие клетки, которые постоянно образца окружающей атмосферы и общаться с альвеолярный эпителий1. В стационарном состоянии легких более 95% фагоцитов в альвеолярной пространстве являются AMs2, состав которых может измениться из-за воспаления, инфекции или хронического воздействия загрязнителей.
АПП участвовать в широком диапазоне функций, которые могут быть локальными для легких и/или имеющим системное значение. Например AMs имеют важное значение в развитии и оптимального функционирования легких; иммунной наблюдения; Распродажа сотовой мусора, вторгаясь патогенов, и вдыхании частиц3,4,5,6,7. Целевые истощение AMs известно повредить Распродажа респираторных вирусов и бактерий в4,8. Помимо их роли как фагоцитов и первой линии защитников легочной гомеостаза, AMs известны функционировать как антиген представляющих клеток в вызывая T клетки иммунитета9, потенцирования эффективность интраназальная вакцина10 и влияние на легких ограничено аутоиммунные заболевания после трансплантации легких11,12. Дефицит в AM функции были связаны с легочных альвеол proteinosis (PAP), состояние в результате генетической мутации, злокачественности или инфекции, что ухудшает Распродажа легочной ПАВ13,14. Трансплантация AMs сейчас изучается как терапевтический подход для лечения Пап 15,16.
АПП, как известно, происходят во время эмбриогенеза и сохраняются в легких на протяжении всей жизни без будучи заменена циркулирующих лейкоцитов2,17. Хотя, AM оборот не обнаруживается в гомеостатических легких, различные уровни оборота утра были зарегистрированы в некоторых клинических условиях, включая инфекции гриппа вирус4, myeloablative облучения18, подверженности эндотоксинов 19и20старости. АПП верил самостоятельного возобновить через низкосортных распространения17,21, но некоторые недавние исследования утверждают, что моноциты может породить населением внутрисосудистого легких макрофаги22,23 под экспериментальных условиях, но функциональность этих новообращенных легочной макрофагов еще должен быть определен в легочных заболеваний. Кроме того понимание порог стимул в контексте AM активации является потенциально интересный район, как легких пытается сохранить равновесие между воспалительных сигналов и иммунорегуляторное машины.
Физиологические и патологические изменения, которые приводят к потере иммунной регуляции имеют важное значение для оценки в различных клинических параметров (например, респираторные инфекции, заболевания легких, воспалительных и фиброзных легочных заболеваний). Тем не менее AMs все чаще признаются в качестве показателей или даже детерминанты здоровья легких11,24. В настоящее время есть нет единых протоколов для сбора урожая, характеризующие, и/или поддержание AMs от людей и доклинические мышиных моделях. Отсутствие консенсуса по утра прекурсоров и фенотипы, а подробная методология была основным камнем преткновения в расшифровке роль(и) AM в легких здоровья и болезни. Следующий протокол предлагает окончательное определение, изоляции и в пробирке культуры стратегию, которая будет значительно глубокого понимания поведения AM и облегчить AM-целенаправленных диагностических и терапевтических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и институционального обзора Совет (IRB) в госпиталь и медицинский центр Святого Иосифа.
1. изоляция AMs из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) жидкости
- Обезболивают 8 недельных C57BL/6 мышь с кетамин (87.5 мг/кг массы тела) и коктейль через внутрибрюшинной инъекции Ксилазина (12,5 мг/кг веса тела). Продолжить, когда мышь достигает хирургического наркоза с потеря рефлексов и расслабление мышц.
- Поместите курсор мыши на поверхность вскрытия брюшной стороной вверх. Примените мазь офтальмологический ветеринар на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание и протрите всю вентральной поверхности мыши с стерильных алкоголя приготовительный колодки, насыщенных с 70% изопропиловый спирт для дезинфекции.
- Подключите мышь с все четыре ноги сдержанной.
- Аккуратно откройте брюшной полости с микро рассечение инструменты. Необходимо позаботиться чтобы открыть столько области как можно без повреждения любого висцеральных органов или создание свисая ткани.
- Аккуратно откройте грудной полости, медленно промо грудную клетку через средостения. Идеально грудная клетка может вырезан из стороны в сторону. Необходимо крайняя осторожность, чтобы не травмировать плевры легких при открытии грудной полости.
- Найдите нижней полой вены и надрезают кровоточить мыши. Используйте абсорбирующий ватные подушечки, чтобы впитать крови.
- Inject 10 мл ледяной фосфатный буфер (PBS) в правом желудочке (используя 10 мл шприц и игла 25G) для сброса циркулирующих клеток крови. Абсорбировать приток крови с абсорбирующей ватный тампон. После того, как полностью увлажненную, легкие появится бланшированные и затем готовы для промывания.
- Аккуратно разрезать кожи и мышц в шею подвергнуть дыхательных путей. Тщательно акцизных прилегающих мышц, хрящей и жировой ткани без повреждения трахеи.
- Сделать небольшой надрез (< 2 мм) на трахею кзади гортани. Этот разрез должен быть просто достаточно, чтобы вставить катетер в то время как трахеи еще привязаны к гортани. Вставка 1-дюймовый 22G катетер без иглы в трахею сторону легких. Безопасный катетер с шелк плетеный швом (4-0; не рассасывающиеся) с квадратный узел.
Примечание: Катетер должен быть уравновешенным основе размера мыши. Очень короткие или длинные катетеры, как правило, утечки или слезу дыхательных путей во время промывания. Катетер длина должна быть такой, что когда полностью вставляется кончик остается хорошо в трахею и не достичь основной бронхов. - Приложите 1 мл шприц, наполненный ледяной бал буфера (Ca2 + и Mg2 + бесплатные PBS + 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТА) катетера и медленно привить буфер в легкие. Это будет раздувать легких. Держите шприц, придает катетер для пяти секунд и затем аспирационная жидкость лаважа, осторожно потянув поршень. Это будет выкачать легких. Сбор жидкости в 15 мл Конические трубки помещены на льду.
- Повторите шаг 1.10 для девять раз и бассейн промывание жидкости. Не превышать 1 мл буфера очищаемых, как это может превышать емкость легких и привести к ее разрыву.
- Усыпить мыши с CO2 передозировка IACUC утверждены Протоколом.
- Центрифуга 10 мл бал жидкости на 250 x g при 4 ° C на 10 минут. Пелле ячейка содержит клетки бал.
Осторожностью: Пелле может быть очень мала, поэтому осторожность при аспирационных супернатант. - Ресуспензируйте бал клетки в 100 мкл потока/сортировки буфера (PBS + 2% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) + 1 мм ЭДТА 25 мм N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic кислоты (HEPES)).
- Блокировать неспецифических антитела связывая к Fc рецептор, добавляя мыши ФК блок (клон 2.4G2, 10 мкг/мл) и инкубации за 20 минут на льду.
- Выполняют антитело пятная наряду с флуоресцентным минус один (FMO) и одно пятно элементов11,25. Оценивать BAL клетки анализатором ячейки (см. Таблицу материалы) следуют одноклеточных потока cytometry анализ программного обеспечения надлежащего анализа (см. Таблицу материалы).
- Изолировать AMs активирован флуоресценции клеток сортировщик (см. Таблицу материалы) непосредственно в 1 мл мыши я культуры среднего когда AMs предназначены для культуры в vitro или в естественных условиях клетки передачи. Кроме того сортировка АПП в 1 мл литического буфера (см. Таблицу материалы) дополнены 10 мкл/мл β-меркаптоэтанол для извлечение RNA.
2. изоляция AMs от мыши легких, одноклеточных подвеска
- Обезболивают 8 недельных C57BL/6 мышь с кетамин (87.5 мг/кг массы тела) и коктейль через внутрибрюшинной инъекции Ксилазина (12,5 мг/кг веса тела). Продолжить, когда мышь достигает хирургического наркоза с потеря рефлексов и расслабление мышц.
- Поместите курсор мыши на поверхность вскрытия брюшной стороной вверх. Примените мазь офтальмологический ветеринар на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание и протрите всю вентральной поверхности мыши с стерильных Спиртовые салфетки, насыщенных с 70% изопропиловый спирт для дезинфекции.
- Подключите мышь с все четыре ноги сдержанной.
- Аккуратно откройте брюшной полости с микро рассечение инструменты. Необходимо позаботиться чтобы открыть столько области как можно без повреждения любого висцеральных органов или создание свисая ткани.
- Аккуратно откройте грудной полости, медленно промо грудную клетку через средостения. Идеально грудная клетка может вырезан из стороны в сторону. Необходимо крайняя осторожность, чтобы не травмировать плевры легких при открытии грудной полости.
- Найдите нижней полой вены и надрезают кровоточить мыши. Используйте абсорбирующий ватные подушечки, чтобы впитать крови.
- Inject 10 мл ледяной PBS в правый желудочек (используя 10 мл шприц и игла 25G) для сброса циркулирующих клеток крови. После того, как полностью увлажненную, легкие появится бланшированные и готовы к уборке.
- Вскрыть из легких, разрыв трахеи, кровеносных сосудов и связок в 15 мл Конические трубки с 5 мл холодного Дульбекко изменение орла среднего (DMEM). Поддерживать его на льду до следующего шага.
- Усыпить мыши с CO2 передозировка IACUC утверждены Протоколом.
- Перевести перфузии легких в стерильных и пирогена бесплатно 60 мм культуры блюдо с 3 мл DMEM. С помощью рассекает щипцы дразнить из дыхательных путей и других материалов, трудно не легочной ткани, если он присутствует. Фарш легочной ткани с помощью скальпеля для < 1 мм размер.
- Добавить 300 мкг/мл Liberase TL и 5 ед/мл DNase I, смешивать, закупорить и проинкубируйте 25 минут при 37° C в инкубаторе. Осторожно смешайте один раз закупорить после 10 минут.
- Передайте диссоциированных легких через стрейнер ячейки 100 мкм, установлен на 50 мл Конические трубки. Использование задней поршень от 1 мл шприц к заторного скопления клеток на фильтре. Промойте фильтр с 20 мл мыть буфера (PBS + 2% тепла инактивированных FBS + 2 мм ЭДТА).
- Центрифуга на 500 x g при 4 ° C за 5 минут. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер мыть 20 мл.
- Повторите шаги 2.12 и 2.13 дважды, изменяя фильтр и трубы каждый раз. Предварительного замачивания фильтр в мыть буфер для более чем пяти минут увеличивает урожайность AM. Подготовка одной ячейки подвеска, добавив 100 мкл, поток/сортировка буфера ячейка Пелле.
- Блокировать неспецифических антитела связывая к Fc рецептор, добавляя мыши ФК блок (клон 2.4G2, 10 мкг/мл) и инкубации за 20 минут на льду.
- Выполните антитело пятная наряду с FMO и сингл пятно элементов11,25. Оценивать легких клетки анализатором ячейки (см. Таблицу материалы) следуют одной ячейки проточной цитометрии анализ, анализ программного обеспечения.
- AMs Сортировка по сортировщик клетки (см. Таблицу материалы) непосредственно в 1 мл мыши AM культуры среднего когда AMs предназначены для культуры в vitro или в естественных условиях клетки передачи. Кроме того сортировать АПП в 1 мл буфера Lysis дополнена 10 мкл/мл β-меркаптоэтанол для извлечение RNA.
3. изоляция AMs от человека бал жидкости
- Организовать передачу человека бал жидкости из клиники в лабораторию при 4 ° C.
- Центрифуга бал жидкости (10-50 мл) на 250 x g при 4 ° C на 10 минут. Пелле ячейка содержит клетки бал11.
- Помыть лепешка с 20 мл мыть буфера (PBS + 2% тепла инактивированных FBS + 2 мм ЭДТА) и центрифуги на 250 x g при 4 ° C на 10 минут.
- Ресуспензируйте бал клетки находятся в 100 мкл буфера потока/сортировки (PBS + 2% тепла инактивированных FBS + 1 мм ЭДТА + 25 мм HEPES).
- Блокировать неспецифических антитела связывая к Fc рецептор, добавляя человека ФК блока (клон Fc1.3070, 25 мкг/мл) и инкубации за 20 минут на льду.
- Выполните антитело пятная наряду с FMO и сингл пятно элементов11,24. Оценивать BAL клетки анализатором ячейки (см. Таблицу материалы) следуют одной ячейки проточной цитометрии анализ, анализ программного обеспечения.
- AMs сортировки путем сортировки клеток (см. Таблицу материалы) непосредственно в 1 мл человека AM культуры среднего или 1 мл буфера Lysis дополнена 10 мкл/мл β-меркаптоэтанол.
4. в vitro культуры от AMs
- После сортировки клеток, урожай клетки центрифугированием на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
- Ресуспензируйте человека АПП в 1 мл человеческой культуры среднего AM [Розуэлл парк Мемориальный институт средних FBS (RPMI) 1640 с 10%, 20% L-929 культура супернатанта (как источник макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF), конечная концентрация 100 ед/мл), пируват натрия 1 мм, 10 мм N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic кислоты (HEPES) и 1 x пенициллина/стрептомицина (Факультативного)]. Аналогичным образом Ресуспензируйте мыши АПП в 1 мл мыши AM питательной среды [DMEM, дополненная 10% FBS, 20% L-929 культуры супернатанта (как источник M-CSF, конечная концентрация 100 ед/мл), 1 мм пируват натрия, 10 мм HEPES и 1 x пенициллина/стрептомицина (опционально )].
- Перечисление Трипановый синий, исключая жизнеспособных клеток, клеток счетчика и регулировка концентрации жизнеспособных клеток в 1 x 10-6/мл.
Примечание: В идеале, до 5 x 105 AMs может быть изолирован от бал жидкости, собранные из 8-10 недельных C57BL/6 мужчины мыши. AM доходность от легких дайджест мыши является переменной и может быть немного меньше, чем мыши бал жидкости. AM доходность от человека бал жидкости зависит от объема жидкости, бал, общий объем физиологического раствора, используемых в промывание и клинического состояния пациента. - Основываясь на урожайность и экспериментальной необходимость, семян клетки в камере слайды, культуры блюда или фляги культуры. В идеале семян AMs на 1 x 105/мл, 10 мл среднего в колбе T25 культуры ткани.
- Инкубируйте клетки в увлажненные инкубатора 37 ° C с 5% CO2 атмосферы.
Примечание: АПП будет расти как адэрентных клеток и растут очень медленно (время удвоения > 7 дней). - На 24 часа после посева, AMs должно быть сторонником и не будет отсоединена нежный изменением питательной среды. Удалите носитель, аспирации от одного конца и пополняться свежими среднего, предварительно нагретой до 37 ° C.
Примечание: Клетки теперь могут использоваться для оценки AM физиологии или воздействия раздражителей. АПП, выращенных в камере слайды можно удобно витражи с соответствующим антител и идеальны для микроскопических визуализации. Для оценки потока гранулярных AMs собирают по инкубации с неферментативного ячейки отделения решения. - Аспирационная питательной среды и добавьте разъединять решения достаточно для покрытия поверхности культуры (примерно 2 мл на колбу T25) и инкубировать при 37 ° C за 5-10 минут. Не очищая будет необходимо, и не рекомендуется для механически очистить клетки. Аккуратно постучите по стенкам, добавить 1-2 мл буфера потока/Сортировка и аккуратно Пипетка вверх и вниз, чтобы отсоединить большинство адэрентных клеток.
- Для исследования РНК Лизируйте клетки непосредственно на культуры блюдо, добавив буфера Lysis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поток гранулярных подход к идентификации мыши АПП показано на рисунке 1. Это включает в себя анализ минимальный набор необходимых в разграничении AMs от других легких резидентом или легкого проникновения фагоцитов поверхностных маркеров. Дифференциальный анализ необходим для положительной идентификации AMs из интерстициальных макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилов, моноцитов и моноцитарных легочной макрофаги, которые происходят в легких. Следующая схема поверхностных маркеров могут использоваться легко различать эти типы клеток друг от друга где AMs являются CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+-Ab + /-, F4/80-, CD11b- ; Интерстициальный макрофаги являются CD45+, CD11b+-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Дендритные клетки являются CD45+, CD11b+, CD11c+-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Дендритные клетки являются CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+-Ab +, CD11b-; Плазмоцитарная Dendritic клетки являются CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+-Ab -, нейтрофилы являются CD45+, CD11b, Ly - 6 G++, CD11c- ,-Ab -Ly - 6 C–и моноциты являются CD45+CD64+ /-, Ly - 6 C+ /-,-Ab -. AM населения, выделены красным (CD11cПривет и Siglec-FПривет) и голубой (CD11cПривет, Siglec-Fint), соответственно, представляют обычные AMs (крупные населения) и моноцитарных легочной макрофагов ( незначительные населения), происходят в альвеолярной пространстве. Поток, сортировка CD45+, CD11cПривет, Siglec-FПривет клетки урожайности очищенный мыши AMs. Рисунок 2 иллюстрирует клеток поверхности маркеры необходимые для точной идентификации и изоляции человека АПП. Человека АПП идентифицированы как CD45+, CD11b+, CD163, HLA-DR++, CD169+и CD206+ бал клеток и может быть отсортирован по течению приложений потока.
Рисунок 1 : Анализ представительных потока гранулярных мыши AMs. (A) анатомическое расположение АПП в разделе ткани легких мыши (гематоксилином и эозином). АПП обозначаются стрелками и линейки шкалы составляет 60 мкм. (B) представитель проточной цитометрии стробирования стратегии выявления мыши АПП в клетках бал. Образцы были оценены анализатором ячейки и данные были вниз пробы на 500 событий для сравнения путем анализа программного обеспечения. Красный (CD11cПривет и Siglec-FПривет) и чирок (CD11cПривет, Siglec-Fint), соответственно, являются обычными AMs (крупные населения) и моноцитарных легочной макрофагов (незначительные населения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Анализ представительных потока гранулярных человека АПП. (A) стробирование стратегии для идентификации человека AMs от бал жидкости от получателя трансплантации легких человека. (B) светлые области микрофотография человеческого AMs на семь дней культуры. Линейки шкалы составляет 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
АПП являются долгоживущие легких резидентов макрофаги, заполняющих легких, начиная с рождения и Несокрушимая над всей жизни26. Их роль в физиологии легких7 и патологии12 и их потенциал для прогнозирования легочной аутоиммунитета24 были признаны. Потому что AMs долгосрочное присутствие в легких11,27 , и потому, что они участвуют в активации и прогрессирования иммунных реакций11,24, их роли в других хронических воспалительных и фиброзных легких заболевания необходимо оценить. Исторически AMs был путать личность и часто были ошибочно. С недавно принятой фенотипические маркеры25,28это теперь возможно отличить человека и мыши AMs от других легких фагоцитов (например, интерстициальный макрофаги, дендритные клетки легких и Моноцит производные легочной макрофагов). Описанные здесь методы были оптимизированы для изоляции и в пробирке культуры человека AMs и мыши. Хотя эти протоколы могут быть приняты для AMs широко от других видов, соответствующей фенотипических решимость должна проводиться создать набор «минимально требуемого» поверхностных маркеров для тщательной характеристики.
Для изоляции мышиных AMs, промывание включение хелатообразующий агент (т.е., ЭДТА) и предварительного охлаждения бал буфера были найдены имеют важное значение для нынешнего исследования. Потому что AMs приверженцем альвеолярного стены, использование PBS только был неэффективным в выбивании клетки и значительно ниже доходности. Другим важным шагом является обеспечение установки катетера в трахею. Следует позаботиться о том, для обеспечения герметичности вложение, которое минимизирует потери жидкости бал. Осторожность необходима при lavaging младший мыши (< 6 недель), как структурные деликатес трахеи может привести к разрыву или утечки во время промывания. Установка двух последовательных non перекроя швы часто обеспечивает безопасное вложение катетера и предотвращает утечки. Хотя неферментативного диссоциации (т.е., с буфером хелатором дополнить) был только исполнил для изоляции AM в этом исследовании, вполне возможно, что ферментативные диссоциации с коллагеназы во время промывания легких может производить лучший урожай AM.
Выход человека AM от бал жидкость является переменной. АПП составляют около 10% всех клеток бал, собранных из человеческих легких трансплантации получателей в институте грудной Нортон во время обычной трансплантации после легких решений, и общая доходность AM зависит от нескольких переменных. Такие переменные включают клиническое состояние больного, объем физиологического раствора, используемых в промывание и объем жидкости бал, обработанных для изоляции AM. Процедуры предварительного промывания (например, биопсия иглы), которые приводят к microhemorrhage изменению клеточного состава бал клеток; Тем не менее реализация фенотипические маркеры позволяет однозначно обнаружения и характеристика человека утра бассейн (рис. 2).
Использование L-929 принадлежности среднего (Источник M-CSF) было необходимо для поддержания в vitro АМН Украины. Это наше убеждение что добавки очищенный M-CSF будет достаточно для поддержания АПП в культуре; Однако оптимизированной концентрации необходимо быть работал для обоих человека и мыши AMs. Культивируемых клеток может использоваться для исследования на эндоцитоза, реакции на воспаление, презентации антигена, созревания/активации статуса или любых других assay который требует поддержания живых клеток для анализа времени курс11,24 . В ходе этого исследования, он не пытался сохранить AMs непрерывно культивировали линии и только краткосрочные терминала исследования (< 30 дней с момента сбора урожая) были выполнены. Таким образом, очевидным ограничением этого метода является отсутствие долгосрочных данных культуры, особенно на стабильность клеток (то есть, ли AMs может расти как конечное или непрерывной линии, ответ AMs криопротекторов и криоконсервацию, и Фенотипические и генотипические дрейф) после текущей культуры. АПП длинные живых клеток в естественных условиях, и некоторой степени вариации ожидается между ячейками, изолированные от здоровых легких и дыхательных инфекции или воспалительных/аутоиммунных реакций.
В целом метод представленные здесь документы упрощенный подход к изоляции, характеризующие и поддержание человека и мыши AMs в системе культуры клеток. Хотя этот протокол может быть оптимизирован на основе индивидуальных потребностей экспериментальной, он может служить протокол новичка вскрыть функциональной значимости AMs респираторных заболеваний и легочной медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить.
Acknowledgments
Мы благодарим Клэр Прендергаст за помощь с редактирования рукопись. DKN поддерживается путем исследования Грант (#2095) Фонда Флинн и ТМ поддерживается за счет субсидий из Национального института здравоохранения (R01HL056643 и R01HL092514). DKN разработали методы, Дизайн исследования и написал рукопись; ОМ, помогал с исследования на животных и клинические образцы закупок; SB, помогал с потоком гранулярных анализа и сортировки клеток; TM руководил исследования и обзор рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
