Summary
Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.
Abstract
Os macrófagos alveolares são macrófagos terminalmente diferenciados, pulmão-residente de origem pré-natal. Os macrófagos alveolares são únicos em sua longa vida e o seu importante papel no desenvolvimento pulmonar e função, bem como suas respostas pulmão-localizada a infecção e inflamação. Até à data, nenhum método unificado para identificação, isolamento e manipulação dos macrófagos alveolares com os humanos e ratos existe. Esse método é necessário para estudos sobre essas células imunes inatas importantes em várias configurações experimentais. O método descrito aqui, que pode ser facilmente adoptado por qualquer laboratório, é uma abordagem simplificada para colheita de macrófagos alveolares de líquido de lavagem broncoalveolar ou de tecido pulmonar e mantê-los em vitro. Porque os macrófagos alveolares ocorrem principalmente como células aderentes no alvéolo, o foco desse método é desalojá-los antes da colheita e identificação. O pulmão é um órgão altamente vascularizado, e vários tipos de células de origem mieloide e linfoide habitam, interagem e são influenciados pelo microambiente do pulmão. Usando o conjunto de marcadores de superfície descrita aqui, pesquisadores podem facilmente e de forma inequívoca distinguir outros leucócitos macrófagos alveolares e purificá-los para aplicações a jusante. O método de cultura desenvolvido neste documento suporta ambos humanos e macrófagos alveolares para multiplicação in vitro de rato e é compatível com estudos celulares e moleculares.
Introduction
O microambiente pulmonar é um ecossistema complexo exclusivamente com uma conduta de ar elaborada e vasculatura. O ar inalado viaja através da traqueia e inúmeras ramificações dos brônquios e bronquíolos antes de atingir os alvéolos, onde ocorre a troca de gás de ar-sangue. Devido à interação direta com a atmosfera, a superfície respiratória requer proteção contra os efeitos potencialmente prejudiciais de partículas suspensas no ar e poluentes. Uma série de barreiras físicas, químicas e imunológicas protege os pulmões. Nomeadamente, a implantação dos fagócitos na superfície respiratória serve um sistema importante primeira linha de defesa. Macrófagos alveolares (AMs) são um tipo de fagócitos residente no pulmão, e eles compõem a grande maioria do grupo de macrófagos pulmonares. Como seu nome sugere, AMs são principalmente localizadas para o lúmen alveolar e ocorrem como células sésseis que constantemente a atmosfera ambiente da amostra e comunicar-se com o epitélio alveolar1. No estado estacionário, pulmões, mais de 95% dos fagócitos no espaço alveolar são AMs2, cuja composição pode alterar devido a inflamação, infecção ou exposição crônica aos poluentes.
AMs participarem em uma ampla gama de funções que podem ser locais para os pulmões e/ou de importância sistêmica. Por exemplo, AMs são essenciais para o desenvolvimento e o bom funcionamento dos pulmões; vigilância imunológica; e liberação de restos celulares, invadindo a patógenos e partículas inaladas3,4,5,6,7. Alvo de depleção de AMs é conhecida por prejudicar a liberação de vírus respiratórios e bactérias4,8. Além de seu papel como fagócitos e um defensores da primeira linha da homeostase pulmonar, AMs são conhecidos por funcionar como células apresentadoras de antígeno em suscitar T célula imunidade9, potencializando a eficácia da vacina intranasal10 e influenciando a auto-imunidade restrição pulmonar após transplante de pulmão11,12. Deficiência na função AM tem sido associada a lipoidoproteinose alveolar pulmonar (PAP), uma condição resultante de uma mutação genética, malignidade ou infecção que prejudica o apuramento de surfactantes pulmonares13,14. Transplante de AMs agora está sendo explorada como uma abordagem terapêutica para o tratamento de PAP 15,16.
MGA é conhecidas que se originam durante a embriogênese e a persistir nos pulmões durante toda a vida sem ser substituído por leucócitos2,17de circulação. Embora, volume de negócios AM é indetectável nos pulmões homeostáticos, diferentes níveis de volume de negócios AM têm sido relatados em determinadas condições clínicas, incluindo a infecção pela gripe vírus4, mieloablativo irradiação18, exposição a endotoxina 19e20anos. MGA é acreditadas para auto renovar através de um baixo grau de proliferação de17,21, mas alguns estudos recentes afirmam que os monócitos podem dar origem a uma população de pulmão intravascular macrófagos22,23 , sob condições experimentais, mas a funcionalidade destes recém-convertidos macrófagos pulmonares ainda têm de ser definidos em doenças pulmonares. Além disso, compreender o limiar de estímulo no contexto de ativação AM é uma área potencialmente interessante, como o pulmão tenta preservar um equilíbrio entre os sinais inflamatórios e a maquinaria imunorreguladores.
As alterações fisiológicas ou patológicas que levam à perda do Regulamento imune são importantes para avaliar em vários ambientes clínicos (por exemplo, infecções respiratórias, doença inflamatória pulmonar e doenças pulmonares fibróticas). Não obstante, AMs são cada vez mais reconhecidos como indicadores ou mesmo determinantes da saúde pulmonar11,24. Atualmente, existem protocolos não unificados disponível para colheita, caracterizando, e/ou manutenção AMs com os humanos e modelos pré-clínicos de murino. Falta de um consenso sobre AM precursores e fenótipos e ausência de uma metodologia detalhada tinham sido grande bloqueio em decifrar função (ões) de AM na doença e na saúde pulmonar. O seguinte protocolo oferece uma identificação definitiva, isolamento e em vitro cultura estratégia extremamente avançar a compreensão do comportamento de AM e facilitar estudos de diagnósticos e terapêuticos AM-alvo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) o cuidados de Animal institucional e o institucional Review Board (IRB), no Hospital e centro médico de St. Joseph.
1. isolamento de AMs do líquido de lavagem broncoalveolar murino (BAL)
- Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.
- Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com almofadas de preparação de álcool estéril saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.
- Monte o mouse com as quatro patas contidas.
- Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.
- Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.
- Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.
- Injete soro fisiológico 10ml gelada tamponado de fosfato (PBS) no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Absorva o fluxo de sangue com almofadas de algodão absorvente. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e então estão prontos para lavagem.
- Delicadamente abri a pele e muscular no pescoço para expor as vias aéreas. Excisar cuidadosamente os músculos adjacentes, cartilagens e tecidos de gordura sem danificar a traqueia.
- Faça uma pequena incisão (< 2 mm) na traqueia posterior na laringe. Esta incisão deve ser apenas o suficiente para inserir um cateter em enquanto a traqueia continua preso na laringe. Inserir um cateter de 22G 1 polegada sem uma agulha na traqueia em direção aos pulmões. Fixar o cateter com uma sutura trançada seda (4-0; não absorvível) com um nó quadrado.
Nota: O cateter precisa ser aparado com base no tamanho do mouse. Cateteres de extremamente curtos ou longos tendem a vazar e/ou rasgar a via aérea durante a lavagem. Comprimento do cateter deve ser tal que, quando totalmente inseridos os restos de ponta bem dentro da traqueia e não atingir os brônquios primários. - Anexar uma seringa de 1 mL, cheia de buffer de BAL gelado (Ca2 + e Mg2 + grátis PBS + 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético, EDTA) para o cateter e incutir lentamente o buffer para os pulmões. Isto irá inflar os pulmões. Manter a seringa anexada ao cateter por cinco segundos e então aspirar o fluido de lavagem puxando suavemente o êmbolo. Isso esvaziará os pulmões. Recolha o líquido em um tubo cônico de 15 mL colocado no gelo.
- Repita a etapa 1.10 para nove vezes mais e o fluido de lavagem da piscina. Não exceda 1 mL de tampão por descarga, que podem exceder a capacidade pulmonar e levar a sua ruptura.
- Eutanásia o mouse com overdose de CO2 por protocolo IACUC aprovado.
- Centrifugue o líquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém células do BAL.
Atenção: O sedimento pode ser muito pequeno, então tenha cuidado ao aspirar o sobrenadante. - Ressuspender as células do BAL em 100 μL de tampão (PBS + 2% calor inativada soro fetal bovino (FBS) + 1 mM EDTA e ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) de 25 mM) de fluxo/classificação.
- Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.
- Executar o anticorpo que mancha com fluorescência menos um (FMO) e single-mancha controles11,25. Avaliar o BAL células por um analisador de célula de análise de citometria de fluxo de célula única (ver Tabela de materiais) seguiram pelo software de análise adequada (consulte a Tabela de materiais).
- Isolar a AMs por uma célula de fluorescência-ativado classificador (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Como alternativa, tipo AMs em 1 mL de tampão de lise (ver Tabela de materiais) suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.
2. isolamento de AMs do pulmão do rato, suspensão de célula única
- Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.
- Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com álcool estéril almofadas saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.
- Monte o mouse com as quatro patas contidas.
- Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.
- Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.
- Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.
- Injete 10 mL PBS gelado no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e estão prontos para a colheita.
- Dissecar os pulmões pelo rompimento da traqueia, vasos sanguíneos e ligamentos em um tubo cônico de 15 mL, com 5 mL de frio médio modificado águia de Dulbecco (DMEM). Mantê-lo no gelo até o próximo passo.
- Eutanásia o mouse com overdose de CO2 por protocolo IACUC aprovado.
- Transferi os pulmões perfundidos para um prato de cultura estéril e apirógena 60 mm com 3 mL DMEM. Com a ajuda de pinças de dissecação destrinchar as vias aéreas e outro material duro tecido não-pulmonar, se presente. Picar o tecido pulmonar com um bisturi para < tamanho de 1 mm.
- Adicionar 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL DNase, misturar pipetando e incubar a 37° C numa incubadora por 25 minutos. Misture suavemente uma vez pipetando após 10 minutos.
- Passe os pulmões dissociados através de um filtro de célula 100 µm instalado em um tubo cónico de 50 mL. Use a volta de um êmbolo de seringa de 1 mL para amassar até grupos de célula no filtro. Lavar o filtro com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA).
- Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de tampão de lavagem.
- Repita as etapas 2.12 e 2.13 duas vezes, mudando o filtro e tubo de cada vez. Pré-imersão o filtro em tampão de lavagem por mais de cinco minutos aumenta o rendimento de AM. Preparar a suspensão de célula única adicionando 100 μL de tampão para o centrifugado de fluxo/classificação.
- Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.
- Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha11,25. Avaliar o pulmão células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.
- AMs tipo por um classificador de pilha (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Alternativamente, classificar AMs em 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.
3. isolamento de AMs de fluido humano BAL
- Transferir o líquido de BAL humano da clínica para o laboratório a 4 ° C.
- Centrifugue o fluido BAL (10-50 mL) em 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém BAL células11.
- Lave o pellet com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA) e centrifugar 250 x g a 4 ° C por 10 minutos.
- Ressuspender as células do BAL estão em 100 μL de tampão de fluxo/classificação (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).
- Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando humana Fc bloco (clone Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.
- Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha11,24. Avaliar o BAL células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.
- AMs tipo por um classificador de célula (ver Tabela de materiais) diretamente em meio de cultura de 1ml AM humana ou 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol.
4. in vitro cultura da AMs
- Seguindo a classificação de célula, recolher as células por centrifugação a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
- Resuspenda AMs humanas em 1 mL meio de cultura humano AM [Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) suplementado com 10% de 1640 FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de colônia de macrófagos (M-CSF), fator de concentração final de 100 U/mL), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Da mesma forma, resuspenda mouse AMs em 1ml rato meio de cultura AM [DMEM suplementado com 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de M-CSF, concentração final de 100 U/mL), 1 mM piruvato de sódio, 10 mM HEPES e 1x penicilina/estreptomicina (opcional )].
- Enumerar as trypan azul-excluindo células viáveis por um contador de célula e ajustar a concentração de células viáveis em 1 x 106/mL.
Nota: Idealmente, acima de 5 x 105 AMs pode ser isolado de BAL fluido coletado de um rato masculino C57BL/6 de 8-10 semanas. O rendimento do AM do digest de pulmão do rato é variável e pode ser um pouco menos do que o fluido do mouse BAL. Rendimento de AM de fluido humano BAL depende do volume do fluido BAL, o volume total de soro usado na lavagem e a condição clínica do paciente. - Baseado no rendimento e necessidade experimental, as sementes das células em câmara slides, pratos de cultura ou frascos de cultura. Idealmente, as sementes do AMs em 1 x 105/mL, com média de 10 mL em um frasco de cultura de tecidos de T25.
- Incube as células numa incubadora umidificado de 37 ° C com 5% CO2 atmosfera.
Nota: AMs vai crescer como células aderentes e são de crescimento extremamente lento (tempo de duplicação > 7 dias). - Em 24 horas após a semeadura, AMs devem ser aderente e não irá ser desanexada por uma mudança suave de meio de cultura. Remover o meio por aspiração de uma extremidade e reabasteça com meio fresco, pre-aquecido a 37 ° C.
Nota: As células agora podem ser usadas para avaliar a fisiologia de AM ou os efeitos de estímulos. AMs cultivadas em slides câmara podem convenientemente ser manchadas com anticorpos apropriados e são ideais para visualização microscópica. Para avaliação de fluxo cytometric, AMs são colhidos pela incubação com célula não enzimáticos, dissociando a solução. - Aspire o meio de cultura e adicionar dissociando solução suficiente para cobrir a superfície de cultura (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incubar a 37 ° C por 5-10 minutos. Não há raspagem será necessário, e não é aconselhável raspar as células mecanicamente. Bata levemente os lados, adicionar 1 a 2 mL de tampão de fluxo/classificação e suavemente Pipetar para cima e para baixo para desanexar a maioria das células aderentes.
- Para estudos de RNA, lyse as pilhas diretamente sobre o prato de cultura pela adição de Lise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A abordagem de fluxo cytometric identificar rato AMs é mostrada na Figura 1. Isso inclui a análise de um conjunto mínimo de marcadores de superfície necessárias na distinção entre AMs de outros fagócitos residentes pulmonar ou pulmão infiltrando. É necessária análise diferencial de identificar positivamente AMs de intersticiais macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monócitos e macrófagos derivados de monócitos pulmonares que ocorrem nos pulmões. O seguinte esquema de marcadores de superfície pode ser empregado para facilmente distinguir estes tipos de células do outro onde AMs são CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+,-Ab + /-, F4/80-, CD11b- ; Os macrófagos intersticiais são CD45+, CD11b+,-Ab +, CD64+, CD24–; CD11b + Células dendríticas são CD45+, CD11b+, CD11c+,-Ab +, CD24+, CD64–; CD103 + Células dendríticas são CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+,-Ab +, CD11b–; Pilhas Dendritic plasmocitoide são CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+,-Ab -, os neutrófilos são CD45+, Ly - 6G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab -Ly - 6 C–e monócitos são CD45+, CD64+, Ly - 6 C+ /-,-A-b. As populações de AM destacadas em vermelho (CD11cOi e Siglec-FOi) e azul-petróleo (CD11cOi, Siglec-Fint), respectivamente, representam AMs convencionais (maior população) e derivados de monócitos macrófagos pulmonares ( menor população) que ocorrem no espaço alveolar. Classificação de CD45 de fluxo+, CD11cOi, Siglec-FOi células rendimentos purificado do mouse AMs. A Figura 2 ilustra marcadores de superfície celular necessárias para uma identificação precisa e isolamento de AMs humanas. O AMs humano são positivamente identificado por ser CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+e CD206+ BAL células e pode ser classificado para aplicações a jusante de fluxo.
Figura 1 : Análise de representante fluxo cytometric do mouse AMs. (A) localização anatômica do AMs em uma seção de tecido de pulmão de rato (hematoxilina e eosina). MGA é indicadas com as setas e barra de escala é 60 μm. (B) de citometria de fluxo representativo gating estratégia para identificar rato AMs em células do BAL. Amostras foram avaliadas por um analisador de célula e dados foram abaixo amostrados para 500 eventos para comparação pelo software de análise. Vermelho (CD11cOi e Siglec-FOi) e azul-petróleo (CD11cOi, Siglec-Fint), é respectivamente, AMs convencionais (maior população) e derivados de monócitos macrófagos pulmonares (população menor). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Análise de cytometric fluxo representativo do AMs humanas. (A) Gating estratégia para identificar humanos AMs de fluido BAL de um receptor de transplante de pulmão humano. (B) Micrografia de campo brilhante de AMs humanas em sete dias de cultura. Barra de escala é 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MGA é macrófagos de pulmão-residente de vida longa que povoam os pulmões começando no nascimento e duradouro sobre a extensão de vida inteira26. Seus papéis na fisiologia pulmonar7 e patologia12 e seu potencial para prever de auto-imunidade pulmonar24 foram reconhecidos. Porque AMs tem uma presença de longo prazo em pulmões11,27 e porque eles estão envolvidos na ativação e progressão de respostas imunes11,24, suas funções no outro pulmão inflamatória e fibrótica crônica doenças deve ser avaliado. Historicamente, AMs tinham uma identidade confusa e muitas vezes foram identificados incorretamente. Com marcadores fenotípicos recentemente adoptado25,28, agora é possível distinguir humana e mouse AMs de outros fagócitos pulmonares (por exemplo, os macrófagos intersticial pulmonares células dendríticas e monócitos derivada de macrófagos pulmonares). Os métodos descritos aqui foram otimizados para isolamento e cultura em vitro de rato e humanos AMs. Embora estes protocolos podem ser amplamente adoptados para AMs, de outras espécies, determinação fenotípica adequada deve ser conduzida para estabelecer um conjunto de marcadores de superfície "minimamente necessária" para a caracterização completa.
Para o isolamento de murino AMs por lavagem, inclusão de quelantes agente (ou seja, EDTA) e pre-refrigeração o buffer de BAL foram encontrados para ser importante no estudo atual. Porque AMs são aderentes à parede alveolar, uso de PBS sozinho foi ineficaz em desalojar as células e produzido um rendimento significativamente mais baixo. Protegendo a instalação do cateter para a traqueia é mais um passo crítico. Deve ter cuidado para garantir um anexo de estanques que minimiza a perda de fluido de BAL. Um cuidado adicional é necessária enquanto lavaging um mouse mais jovem (< 6 semanas de idade), pois a delicadeza estrutural da traqueia pode resultar em vazamentos ou rasgar durante a lavagem. Instalar dois consecutivas disjunto suturas frequentemente garante uma fixação segura do cateter e evita vazamentos. Apesar de dissociação não enzimáticos (i. e., com um buffer de quelante suplementado) foi somente executadas para isolamento de AM neste estudo, é possível que a dissociação enzimática com colagenase durante a lavagem do pulmão pode produzir um melhor rendimento de AM.
O rendimento de sou humano de fluido BAL é variável. AMs constituem cerca de 10% de todas as células do BAL coletadas de transplantados de pulmão humano Norton torácico Instituto durante o seguimento do transplante de pós-pulmão rotina, e o rendimento total do AM é dependente de diversas variáveis. Essas variáveis incluem a condição clínica do paciente, o volume de solução salina utilizada na lavagem e o volume de fluido de BAL transformado para isolamento de AM. Procedimentos de pré-lavagem (por exemplo, biópsias de agulha) que resultam em microhemorrhage alteram a composição celular de células do BAL; Não obstante, implementação de marcadores fenotípicos permite uma detecção inequívoca e caracterização da piscina AM humana (Figura 2).
Utilização de L-929 condicionado medium (uma fonte de M-CSF) era necessária para a manutenção em vitro da AMs. É nossa convicção que a suplementação de M-CSF purificada seria suficiente para sustentar o AMs na cultura; no entanto, uma concentração otimizada precisa ser trabalhado para ambos humanos e mouse AMs. A lata de culturas de células usada para estudos sobre endocitose, resposta a inflamação, apresentação de antigénios, status de maturação/ativação ou qualquer outro ensaio que exige a manutenção de células vivas por um tempo-curso de análise11,24 . No decorrer deste estudo, que não foi tentativa de manter AMs como uma linha continuamente cultivada e estudos terminais apenas a curto prazo (< 30 dias desde a colheita) foram realizadas. Portanto, uma limitação óbvia para este método é a falta de um dados de cultura a longo prazo, particularmente na estabilidade das células (ou seja, se AMs podem crescer como um finito ou contínua de linha, a resposta de AMs crioprotectores e criopreservação, e fenotípica e/ou genotípica deriva) depois da cultura em curso. MGA é longa vida células in vivo e espera-se algum grau de variação entre as células isoladas de pulmões saudáveis e daqueles submetidos a infecção respiratória ou respostas inflamatórias/auto-imune.
No geral, o método apresentado aqui documentos uma abordagem simplificada para isolar, caracterizando-se e manutenção humana e mouse AMs em um sistema de cultura de células. Embora este protocolo pode ser otimizado ainda mais baseado em necessidades individuais experimentais, poderá servir como protocolo de principiante para dissecar a relevância funcional da AMs em medicina pulmonar e doenças respiratórias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Clare Prendergast para obter assistência com o manuscrito de edição. DKN é suportado por uma pesquisa conceder (#2095) da Fundação Flinn e TM é suportada por concessões do National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN desenvolveu os métodos, projetou o estudo e escreveu o manuscrito; OM assistida com estudos em animais e recolha de amostra clínica; SB assistida com fluxo cytometric análise e classificação de célula; TM supervisionou os estudos e revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
