Summary
Dette beskriver metoder for isolasjon og kultur alveolar makrofager fra mennesker og murine modeller for eksperimentelle formål.
Abstract
Alveolar makrofager er terminalt differensiert, lunge-resident makrofager prenatal opprinnelsesland. Alveolar makrofager er unike i sitt lange liv og deres viktige rolle i lunge utvikling og funksjon, samt svarene deres lunge-lokalisert infeksjon og betennelse. Hittil finnes ingen enhetlig metode for identifikasjon, isolasjon og håndtering av alveolar makrofager fra mennesker og mus. Slik metode er nødvendig for studier av disse viktige medfødte immunceller i forskjellige eksperimentelle innstillinger. Metoden beskrevet her, som kan lett vedtatt av alle laboratorium, er en forenklet tilnærming til høsting alveolar makrofager fra bronchoalveolar lavage væske eller lungevev og opprettholde dem i vitro. Fordi alveolar makrofager primært skje som tilhenger celler i alveoler, er fokus for denne metoden på dislodging dem før harvest og identifikasjon. Lungene er en svært vascularized organ, og ulike celletyper lymfoide og myeloide opprinnelsesland bor, samhandle og påvirkes av lunge-microenvironment. Ved hjelp av settet med overflate markører som er beskrevet her, kan forskere enkelt og utvetydig skille alveolar makrofager fra andre leukocytter, og renser dem for nedstrøms programmer. Metoden kultur utviklet her støtter både menneskelige og mus alveolar makrofager for i vitro vekst, og er kompatibel med mobilnettet og molekylære studier.
Introduction
Lunge-microenvironment er et unikt komplekst økosystem med forseggjort luft kanal og blodkar. Inhalert luft reiser gjennom luftrøret og mange grener av bronchi og bronchioles før han nådde alveoler, der blod-luft gassutveksling oppstår. På grunn av direkte interaksjon med atmosfæren krever åndedretts overflaten beskyttelse fra de skadelige effektene av luftbårne partikler og forurensning. En rekke fysiske, kjemiske og immunologiske barrierer beskytte lungene. Spesielt, serverer distribusjon av phagocytes på luftveiene overflaten en viktig første linje forsvar. Alveolar makrofager (AMs) er en type lunge-resident phagocytes, og de utgjør majoriteten av lunge macrophage bassenget. Som navnet antyder, AMs er hovedsakelig lokalisert til den alveolar lumen og oppstår fastsittende celler som stadig prøve ambient atmosphere og kommunisere med alveolar epitel1. I steady state lungene er mer enn 95% av phagocytes inn alveolar AMs2, der sammensetningen kan endre på grunn av betennelse, infeksjon eller kronisk eksponering for forurensing.
AMs delta i et bredt spekter av funksjoner som kan være lokale til lungene og/eller systemisk betydning. For eksempel er AMs viktig i utviklingen og optimal funksjon av lungene; immun overvåking; og klarering av mobilnettet rusk, invaderende patogener og innånding partikler,3,,4,,5,,6,,7. Målrettet uttømming av AMs er kjent for å svekke klarering av respiratoriske virus og bakterier4,8. Foruten sin rolle som phagocytes og en første-linje forsvarere av lunge homeostase, AMs er kjent for å fungere som antigen presentere celler i fremlokkende T celle immunitet9, potentiating effekt intranasal vaksine10 og påvirke lunge-begrenset autoimmunitet etter lunge transplantasjon11,12. Mangel på AM funksjonen har vært knyttet til lunge alveolar proteinosis (PAP), en tilstand som følge av en genetisk mutasjon, kreft eller infeksjon som svekker klaring lunge tensider13,14. Transplantasjon av AMs blir nå undersøkt som et terapeutisk tilnærming til behandling av PAP 15,16.
AMs er kjent kommer under embryogenesis og å vedvare i lungene hele livet uten av sirkulerende leukocytter2,17. Selv om AM omsetning er undetectable i homøostatisk lungene, er varierende grad av AM omsetning rapportert i enkelte kliniske inkludert smitte av influensa virus4, myeloablative bestråling18, eksponering for endotoxin 19og alderdom20. AMs antas å selvstendig fornye via en lav kvalitet spredning17,21, men enkelte studier hevder at monocytter kan gi opphav til en befolkning på intravascular lunge makrofager22,23 under eksperimentelle forhold, men funksjonaliteten til disse nylig konverterte lunge makrofager har ennå å bli definert lungesykdommer. Videre forstå terskelen til stimulans i sammenheng med AM aktivisering er et potensielt interessant område, som lungene prøver å beholde en likevekt mellom inflammatorisk signaler og immunoregulatory maskiner.
De fysiologiske eller patologisk endringene som fører til tap av immun regulering er viktig å vurdere i forskjellige kliniske innstillinger (f.eks luftveisinfeksjoner, inflammatorisk lungesykdom og fibrotiske lungesykdom). Likevel blir AMs stadig mer anerkjent som indikatorer eller selv determinanter av lunge helse11,24. Det er foreløpig ingen enhetlig protokoller tilgjengelig for høsting, karakteriserer eller opprettholde AMs fra mennesker og prekliniske murine modeller. Mangelen på en konsensus om AM prekursorer og fenotyper og fravær av en detaljert metodikk hadde vært store veisperring i tyde roller av AM i lunge helse og sykdom. Følgende protokollen tilbyr en definitiv identifikasjon, isolasjon og i vitro kultur strategi som vil sterkt fremme forståelsen av AM atferd og lette AM målrettede diagnostiske og terapeutiske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av den institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) og institusjonelle Review Board (IRB) på St Joseph's Hospital og Medical Center.
1. isolering av AMs fra Murine Bronchoalveolar Lavage (BAL) væske
- Anaesthetize en åtte uke gamle C57BL/6 musen med ketamin (87,5 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (12.5 mg/kg kroppsvekt) cocktail via en intraperitoneal injeksjon. Fortsette når musen oppnår kirurgisk anestesi med tap av reflekser og avslapning av musklene.
- Plass musen på en disseksjon overflate med ventral side vendt oppover. Bruk ophthalmica vet salve øyne å hindre dehydrering og tørk hele ventrale overflaten av musen med sterilt alkohol prep pads mettet med 70% isopropanol å desinfisere.
- Montere musen med alle fire bena behersket.
- Forsiktig åpne bukhulen med mikro disseksjon verktøy. Må utvises åpne området så mye som mulig uten å skade noen visceral organer eller opprette overhengende vev.
- Forsiktig åpne bryst hulrom ved sakte incising ribbe buret gjennom brysthulen. Ideelt sett kan ribbe buret kreditert fra side til side. Utvise forsiktighet må tas ikke å skade pleura av lungene ved åpning bryst hulrom.
- Finn den underlegne vena cava og gjøre et snitt å blø musen. Bruk absorberende bomull pads slikke blodet.
- Injisere 10 mL iskald fosfat bufret saltvann (PBS) i den høyre ventrikkel (med 10 mL sprøyte og 25G nål) for å spyle sirkulerende blod celler. Absorbere flyten av blod med bomullsklut pads. Når helt parfyme, lungene vises forvellet og er så klar for lavage.
- Forsiktig klippes huden og muskel i halsen å avsløre luftveiene. Nøye avgiftsdirektoratet de tilstøtende muskler, brusk og fettvev uten å skade luftrøret.
- Lag et lite innsnitt (< 2 mm) på luftrøret bakenfor strupehodet. Denne snitt bør være akkurat nok til å sette inn et kateter inn mens luftrøret er fortsatt knyttet til strupehodet. Sette inn en 1-tommers 22G kateter uten en nål inn i luftrøret til lungene. Sikre kateter med en silke flettet Sutur (4-0, ikke-absorberbare) med en firkant knute.
Merk: Kateter må trimmes basert på musen størrelsen. Ekstremt korte eller lange katetre tendens til å lekke og/eller rive luftveiene under lavage. Kateter lengden skal være slik at når satt helt inn tips restene godt i luftrøret og ikke nå primær bronchi. - Fest 1-mL sprøyte fylt med iskald BAL-buffer (Ca2 + og Mg2 + gratis PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) kateter og sakte innpode bufferen inn i lungene. Dette vil blåse opp lungene. Sug opp væske lavage ved å trekke forsiktig stempelet holde sprøyten festet til kateter i fem sekunder. Dette vil deflate lungene. Samle væske i en 15 mL konisk tube plassert på is.
- Gjenta trinn 1,10 for ni ganger og basseng lavage væsken. Ikke overstige 1 mL buffer per flush, som kan overstige lungekapasiteten og føre til sin brudd.
- Euthanize musen med CO2 overdose av IACUC godkjent protokollen.
- Sentrifuge 10 mL BAL væsken 250 x g på 4 ° C i 10 minutter. Cellen pellet inneholder BAL celler.
Forsiktig: Pellet kan være svært liten, så forsiktige når aspirating nedbryting. - Resuspend BAL cellene i 100 μL flyt/sortering buffer (PBS + 2% varme inaktivert fosterets bovin serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic syre (HEPES)).
- Blokkere uspesifikke antistoff bindingen til Fc reseptor ved å legge musen Fc blokk (klone 2.4G2, 10 μg/mL) og rugende i 20 minutter på is.
- Utføre antistoff flekker med fluorescens minus én (FMO) og enkelt-flekken kontrollerer11,25. Evaluere BAL celler av en celle analyzer (se Tabell for materiale) etterfulgt av encellede flyt cytometri analyse av riktig analyseprogramvare (se Tabell for materiale).
- Isolere AMs av en fluorescens-aktivert cellen sorter (se Tabell for materiale) direkte i 1 mL musen er kultur medium når AMs er ment for i vitro kultur eller i vivo celle overføring. Sorter AMs i 1 mL lyseringsbuffer (se Tabell for materiale) eventuelt supplert med 10 μL/mL β-Mercaptoethanol for RNA utvinning.
2. isolering av AMs fra musen lunge, encellede suspensjon
- Anaesthetize en åtte uke gamle C57BL/6 musen med ketamin (87,5 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (12.5 mg/kg kroppsvekt) cocktail via en intraperitoneal injeksjon. Fortsette når musen oppnår kirurgisk anestesi med tap av reflekser og avslapning av musklene.
- Plass musen på en disseksjon overflate med ventral side vendt oppover. Bruk ophthalmica vet salve øyne å hindre dehydrering og tørk hele ventrale overflaten av musen med sterilt alkohol pads mettet med 70% isopropanol å desinfisere.
- Montere musen med alle fire bena behersket.
- Forsiktig åpne bukhulen med mikro disseksjon verktøy. Må utvises åpne området så mye som mulig uten å skade noen visceral organer eller opprette overhengende vev.
- Forsiktig åpne bryst hulrom ved sakte incising ribbe buret gjennom brysthulen. Ideelt sett kan ribbe buret kreditert fra side til side. Utvise forsiktighet må tas ikke å skade pleura av lungene ved åpning bryst hulrom.
- Finn den underlegne vena cava og gjøre et snitt å blø musen. Bruk absorberende bomull pads slikke blodet.
- Injisere 10 mL iskald PBS i høyre ventrikkel (med 10 mL sprøyte og 25G nål) for å spyle sirkulerende blod celler. Når helt parfyme, lungene vises forvellet og er klar for innhøsting.
- Dissekere ut lungene ved severing trachea, blodkar og leddbånd i en 15 mL konisk tube med 5 mL kaldt Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM). Opprettholde det på is til neste trinn.
- Euthanize musen med CO2 overdose av IACUC godkjent protokollen.
- Overføre perfused lungene i et sterilt og pyrogen-gratis 60 mm kultur parabol med 3 mL DMEM. Hjelp av dissekere tang tease ut luftveiene og andre harde ikke-lungevev materiale, hvis den finnes. Hakke lungevev med skalpell til < 1 mm størrelse.
- Legge til 300 µg/mL Liberase TL og 5 U/mL DNase jeg blande av pipettering og ruge på 37° C i en inkubator for 25 minutter. Bland forsiktig når av pipettering etter 10 minutter.
- Dissosiert lungene passere en 100 µm celle sil installert på en 50 mL konisk rør. Bruk baksiden av en stempelet fra 1 mL sprøyte for å mash up celle klumper på filteret. Filteren vaskes med 20 mL vaskebuffer (PBS + 2% varme deaktivert FBS + 2 mM EDTA).
- Sentrifuge på 500 x g på 4 ° C i 5 minutter. Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i 20 mL vaskebuffer.
- Gjenta trinn 2.12 og 2.13 to ganger, endre filter og rør hver gang. Pre soaking filteret i vaskebuffer for mer enn fem minutter øker AM avkastningen. Forberede encellede suspensjon ved å legge til 100 μL flyt/sortering celle pellet-buffer.
- Blokkere uspesifikke antistoff bindingen til Fc reseptoren ved å legge musen Fc blokk (klone 2.4G2, 10 μg/mL) og rugende i 20 minutter på is.
- Utføre antistoff flekker FMO og enkelt-flekken kontroller11,25. Evaluere lungene celler av en celle analyzer (se Tabell for materiale) etterfulgt av én celle flowcytometri analyse av analyse programvare.
- Sorter AMs av cellen sortering (se Tabell for materiale) direkte inn i 1 mL musen er kultur medium når AMs er ment for i vitro kultur eller i vivo celle overføring. Du kan også sortere AMs i 1 mL lyseringsbuffer supplert med 10 μL/mL β-Mercaptoethanol for RNA utvinning.
3. isolering av AMs fra menneskelige BAL væske
- Ordne overføring av menneskelige BAL væsken fra klinikken til laboratoriet på 4 ° C.
- Sentrifuge BAL væske (10-50 mL) 250 x g på 4 ° C i 10 minutter. Cellen pellet inneholder BAL celler11.
- Vask pellets med 20 mL vaskebuffer (PBS + 2% varme deaktivert FBS + 2 mM EDTA) og sentrifuger 250 x g på 4 ° C i 10 minutter.
- Resuspend BAL cellene er i 100 μL flyt/sortering buffer (PBS + 2% varme deaktivert FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).
- Blokkere uspesifikke antistoff bindingen til Fc reseptoren ved å legge til menneskelig Fc blokk (klone Fc1.3070, 25 μg/mL) og rugende i 20 minutter på is.
- Utføre antistoff flekker FMO og enkelt-flekken kontroller11,24. Evaluere BAL celler av en celle analyzer (se Tabell for materiale) etterfulgt av én celle flowcytometri analyse av analyse programvare.
- Sorter AMs av cellen sortering (se Tabell for materiale) direkte i 1 mL menneskelige AM kultur medium eller 1 mL lyseringsbuffer supplert med 10 μL/mL β-Mercaptoethanol.
4. in vitro kultur av AMs
- Etter celle sortering, høste celler av sentrifugering 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
- Resuspend menneskelig AMs i 1 mL menneskelige AM kultur medium [Roswell Park Memorial Institute middels (RPMI) 1640 supplert med 10% FBS, 20% L-929 kultur supernatant (som en kilde til macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF), 100 U/mL siste konsentrasjon), 1 mM natrium pyruvate, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic syre (HEPES) og 1 x penicillin/streptomycin (valgfritt)]. Tilsvarende resuspend musen AMs i 1 mL musen AM kultur medium [DMEM med 10% FBS, 20% L-929 kultur supernatant (som en kilde til M-CSF, 100 U/mL siste konsentrasjon), 1 mM natrium Pyruvate, 10 mM HEPES og 1 x penicillin/streptomycin (valgfritt )].
- Nummererer trypan blå unntatt levedyktig cellene av en celle teller og justere levedyktig celle konsentrasjonen på 1 x 106/mL.
Merk: Ideelt sett opp til 5 x 105 AMs kan være isolert fra BAL væske fra en 8-10 uke gamle C57BL/6 mannlige mus. ER avkastningen fra musen lunge sammendraget er variabel og kan være litt mindre enn musen BAL væsken. AM avkastning fra menneskelige BAL væske avhenger av BAL væsken, det totale volumet av saline brukes i lavage og pasientens kliniske tilstand. - Basert på avkastning og eksperimentelle nødvendighet, frø cellene i kammeret lysbilder, kultur retter eller kultur flasker. Ideelt sett frø AMs på 1 x 105/mL med 10 mL medium i en T25 vev kultur kolbe.
- Inkuber cellene i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO2 atmosfære.
Merk: AMs vil vokse som tilhenger celler og er svært langsom voksende (dobling tid > 7 dager). - 24 timer etter såing, AMs bør være tilhenger og vil ikke gå av en mild endring av kultur medium. Fjerne mediet av aspirasjon fra den ene enden og fylle med fersk medium pre varmet til 37 ° C.
Merk: Cellene kan nå brukes til å vurdere AM fysiologi eller effekten av stimuli. AMs dyrket i kammeret lysbilder kan være praktisk farget med passende antistoffer og er ideelle for mikroskopiske visualisering. For flyt cytometric evaluering høstes AMs ved inkubasjon med ikke-enzymatisk cellen dissociating løsning. - Sug opp kultur medium og legge dissociating løsning nok til å dekke kultur overflaten (ca 2 mL per T25 kolbe) og ruge på 37 ° C i 5-10 minutter. Ingen skraping vil være nødvendig, og det anbefales ikke å skrape cellene mekanisk. Forsiktig tapper sidene, legge til 1-2 mL flyt/sortering buffer og Pipetter forsiktig opp og ned for å koble fleste tilhenger cellene.
- For RNA studier, lyse cellene direkte på kultur parabol ved å legge lyseringsbuffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flow cytometric tilnærming til å identifisere musen AMs er vist i figur 1. Dette inkluderer analyse av et minimum antall overflate markører nødvendig i atskillende AMs fra andre lunge-bosatt eller lunge-infiltrere phagocytes. Differensialanalyse må identifisere AMs fra interstitiell makrofager, dendrittiske celler, nøytrofile, monocytter og monocytt-avledet lunge makrofager som forekommer i lungene. Skjemaet for overflate markører kan brukes å lett skille disse celletyper fra hverandre der AMs er CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+, enb +/-F4/80-, CD11b- ; Interstitiell makrofager er CD45+, CD11b+, enb +, CD64+, CD24-; CD11b + Dendrittiske celler er CD45+, CD11b+, CD11c+, enb +, CD24+, CD64-; CD103 + Dendrittiske celler er CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+, enb +, CD11b-; Presenterer antigener Dendritic celler er CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+, enb -, nøytrofile er CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- , Enb -Ly - 6 C-og monocytter er CD45+, CD64+/-, Ly - 6 C+/-, enb -. AM befolkningen uthevet i rødt (CD11cHei og Siglec-FHei) og teal (CD11cHei, Siglec-Fint), henholdsvis representerer konvensjonelle AMs (store befolkning) og monocytt-avledet lunge makrofager ( mindre befolkningen) som oppstår i alveolar plass. Flow sortering av CD45+, CD11cHei, Siglec-FHei celler gir renset musen AMs. Figur 2 viser cellen overflate markører nødvendig for en presis identifisering og isolering av menneskelig AMs. De menneskelige AMs er positiv kjennemerke for CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, og CD206+ BAL celler, og kan være flow sorterte for nedstrøms programmer.
Figur 1 : Representant flyt cytometric analyse av musen AMs. (A) anatomiske plasseringen av AMs i en mus lunge vev delen (hematoxylin og eosin). Baren skala er 60 μm aMs er angitt med piler. (B) representant flowcytometri gating strategi for å identifisere musen AMs i BAL celler. Prøvene ble vurdert av en celle analysator og data var ned samplet 500 hendelser for sammenligning av analyseprogramvare. Rød (CD11cHei og Siglec-FHei) og teal (CD11cHei, Siglec-Fint), henholdsvis, er konvensjonelle AMs (store befolkning) og monocytt-avledet lunge makrofager (mindre befolkning). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant flyt cytometric analyse av menneskelig AMs. (A) Gating strategi for å identifisere menneskelige AMs fra BAL væske fra en menneskelig lunge transplantasjon mottaker. (B) lyse feltet mikroskop-bilde av menneskelig AMs på syv dager med kultur. Skala baren er 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMs er lang-levende lunge-resident makrofager som fyller lungene begynner ved fødselen og varig over hele livet tidsrommet26. Deres roller i lunge fysiologi7 og patologi12 og deres potensial å spå lunge autoimmunitet24 har blitt anerkjent. Fordi AMs har en langsiktig tilstedeværelse i lungene11,27 og fordi de er involvert i aktivering og progresjon av immunreaksjoner11,24, deres roller i andre kronisk inflammatorisk og fibrotiske lunge sykdommer må evalueres. Historisk AMs hadde en forvirret identitet og var ofte feilidentifisert. Med nylig vedtatt fenotypiske markører25,28er det nå mulig å skille menneskelig og mus AMs fra andre lunge phagocytes (f.eks interstitiell makrofager lunge dendrittiske celler og monocytt avledet lunge makrofager). Metodene som er beskrevet her er optimalisert for isolasjon og i vitro kultur av mus og menneskelige AMs. Selv om disse protokollene kan vedtas av AMs bredt fra andre arter, bør riktig fenotypiske fastsettelse utføres for å etablere et sett med "minimalt pålagt" overflate markører for grundig karakterisering.
For isolering av murine AMs av lavage, inkludering av chelaterande agent (dvs., EDTA) og pre chilling BAL bufferen ble funnet for å være viktig i denne studien. Fordi AMs tilhenger til alveolar veggen, bruk av PBS alene var ineffektive i dislodging cellene og produsert en betydelig lavere avkastning. Sikre installasjon av kateter til luftrøret er et kritisk steg. Forsiktighet bør utvises å sikre en lekkasjesikker vedlegg som minimerer tap av BAL væske. Ekstra forsiktig er nødvendig mens lavaging en yngre mus (< 6 uker gamle), som den strukturelle delikatessen av trachea kan resultere i rive eller lekkasje under lavage. Installere to påfølgende ikke-overlappende suturer ofte sørger for et sikkert feste kateter og forhindrer lekkasje. Selv om ikke-enzymatisk dissosiasjon (dvs., med en chelator supplert buffer) var bare utført AM isolering i denne studien, er det mulig at enzymatisk dissosiasjon med collagenase under lunge lavage kan gi en bedre AM avkastning.
Avkastningen av menneskelig AM fra BAL væske er variabel. AMs utgjør 10% av alle BAL celler samlet inn fra menneskelige lunge transplantasjon mottakere på Norton bryst Institute under rutinemessig etter lunge transplantasjon oppfølging, og den totale AM avkastningen er avhengig av flere variabler. Slike variabler inkluderer pasientens kliniske tilstand, volumet av saltvann i lavage og volumet av BAL væske behandlet for AM isolasjon. Pre lavage prosedyre (f.eks nål biopsier) som microhemorrhage endre mobilnettet sammensetningen av BAL celler. Likevel, implementering av fenotypiske markører gir en entydig gjenkjenning og karakterisering av menneskelig AM bassenget (figur 2).
Bruk av L-929 condition medium (en kilde av M-CSF) var nødvendig for i vitro vedlikehold av AMs. Det er vår oppfatning at tilskudd av renset M-CSF ville være tilstrekkelig til å opprettholde AMs i kultur; men må en optimalisert konsentrasjon utarbeides for både menneske og mus AMs. Kultivert celler kan brukes for studier av endocytose, betennelse, antigen presentasjon, modning/aktivisering rang eller andre analysen som nødvendiggjør vedlikehold av levende celler for en tid-retters analyse11,24 . I denne studien, var det ikke forsøkte å beholde AMs som en kontinuerlig kulturperler linje og kortsiktige terminal studier (< 30 dager siden harvest) ble utført. Derfor en åpenbar begrensning til denne metoden er mangelen på en langsiktig kultur data, spesielt på stabilitet i cellene (dvs. om AMs kan vokse som et endelig eller kontinuerlig linje, svaret av AMs cryoprotectants og kryonisk bevaring, og fenotypiske og/eller genotypic drift) etter pågående kultur. AMs er lange levende celler i vivo, og en viss grad av variasjon er ventet mellom cellene isolert fra friske lunger og de gjennomgår luftveisinfeksjon eller inflammatorisk/autoimmune svar.
Samlet presentert metoden her dokumenter en forenklet tilnærming til isolere, karakterisere, og opprettholde menneskelige og mus AMs i en celle kultur-systemet. Selv om denne protokollen kan bli ytterligere optimalisert basert på individuelle eksperimentelle behov, kan det tjene som en nybegynners protokollen å dissekere funksjonelle relevansen av AMs i luftveissykdommer og lunge medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å erklære.
Acknowledgments
Vi takker Clare Prendergast for hjelp med redigering manuskriptet. DKN støttes av en research grant (#2095) fra Flinn grunnlaget og TM støttes av tilskudd fra National Institutes of Health (R01HL056643 og R01HL092514). DKN utviklet metoder, utformet studien og skrev manuskriptet; OM assistert dyrestudier og klinisk prøve innkjøp; SB assistert med flyt cytometric analyse og celle sortering; TM overvåket studiene og vurdert manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
