Summary
Deze mededeling beschrijft methodologieën voor isolatie en cultuur van de alveolaire macrofagen van mens en lymfkliertest modellen voor experimentele doeleinden.
Abstract
Alveolaire macrofagen zijn terminaal gedifferentieerde, Long-inwoner van macrofagen van prenatale oorsprong. Alveolaire macrofagen zijn uniek in hun lange levensduur en hun belangrijke rol in de ontwikkeling van de Long en functie, evenals hun Long-gelokaliseerde reacties op infecties en ontstekingen. Tot op heden bestaat er geen uniforme methode voor de identificatie, isolatie, en behandeling van de alveolaire macrofagen van mensen en muizen. Deze methode is nodig voor studies over deze belangrijke aangeboren immuun cellen in verschillende experimentele instellingen. De methode die hier beschreven, die kan gemakkelijk door elk laboratorium worden aangenomen, is een vereenvoudigde aanpak voor het oogsten van de alveolaire macrofagen uit bronchoalveolar lavage vloeistof of longweefsel en onderhouden hen in vitro. Omdat alveolaire macrofagen voornamelijk als Adherente cellen in de longblaasjes optreden, is de focus van deze methode op hen verjagend voorafgaand aan de oogst en identificatie. De Long is een zeer gevacuoliseerd orgaan, en verschillende celtypes van myeloïde of lymfoïde oorsprong bewonen, interactie en worden beïnvloed door de communicatie van de longen. Met behulp van de set van oppervlakte markers beschreven hier, kunnen onderzoekers gemakkelijk ondubbelzinnig alveolaire macrofagen onderscheiden van andere leukocyten en zuiveren ze voor downstream toepassingen. De methode van de cultuur ontwikkeld hierin ondersteunt beide mens muis alveolaire macrofagen in vitro groeimogelijkheden en is compatibel met cellulaire en moleculaire studies.
Introduction
De Long-communicatie is een uniek complex ecosysteem met een uitgebreide lucht conduit en therapieën. De ingeademde lucht reist via de luchtpijp en vele vertakkingen van de bronchiën en bronchioli alvorens de longblaasjes, waar het bloed-lucht gasuitwisseling plaatsvindt. Als gevolg van directe interactie met de atmosfeer vereist het respiratoire oppervlak bescherming tegen de potentieel schadelijke effecten van deeltjes in de lucht en verontreinigende stoffen. Een aantal fysieke, chemische en immunologische belemmeringen beschermen de longen. Implementatie van fagocyten aan de luchtwegen oppervlakte dient met name een belangrijke eerste regel verdedigingssysteem. Alveolaire macrofagen (AMs) zijn een soort Long-ingezeten fagocyten, en ze vormen de overgrote meerderheid van de longkanker macrofaag zwembad. Zoals hun naam al doet vermoeden, AMs zijn voornamelijk gelokaliseerd op de alveolaire lumen en optreden als sessiele cellen die voortdurend de omgevingsklimaat proeven en communiceren met de alveolaire epitheel1. In stationaire toestand longen zijn meer dan 95% van de fagocyten in de alveolaire ruimte AMs2, waarvan de samenstelling als gevolg van ontsteking, infectie of chronische blootstelling aan verontreinigende stoffen wijzigen kan.
AMs deelnemen aan een breed scala van functies die mogelijk lokale naar de longen en/of systemische belang. Bijvoorbeeld, zijn AMs van essentieel belang in de ontwikkeling en de optimale werking van de longen; immuun toezicht; en de ontmijning van cellulaire puin, invasie van ziekteverwekkers, en geïnhaleerde deeltjes3,4,5,6,7. Gerichte uitputting van AMs heet schade kunnen toebrengen aan de goedkeuring van de respiratoire virussen en bacteriën4,8. Naast hun rol als fagocyten en een verdedigers van de eerste regel van de pulmonaire homeostase, AMs zijn gekend om te functioneren als antigeen-presenteren cellen in het opwekken van T cel immuniteit9, potentiating van de werkzaamheid van intranasale vaccin10 en Long-beperkte autoimmuniteit na Long transplantatie11,12te beïnvloeden. Tekort aan AM functie is gekoppeld aan de pulmonaire alveolaire proteinosis (PAP), een aandoening als gevolg van een genetische mutatie, maligniteit of infectie die Goedkeuringvande pulmonaire oppervlakteactieve stoffen13,14 schaadt. Transplantatie van AMs is nu onderzocht als een therapeutische benadering voor de behandeling van PAP 15,16.
AMs zijn bekend ontstaan tijdens de embryogenese en te volharden in de longen gedurende het hele leven zonder verdrongen door het circuleren van leukocyten2,17. Hoewel, AM omzet is niet detecteerbaar in homeostatische longen, zijn verschillende niveaus van AM omzet gemeld in bepaalde klinische voorwaarden met inbegrip van infectie door het influenza virus4, myeloablative bestraling18, blootstelling aan endotoxinen 19en20van de ouderdom. AMs worden verondersteld zelf vernieuwen via een low-grade proliferatie17,21, maar sommige recente studies beweren dat monocyten aanleiding kunnen geven tot een bevolking intravasculaire Long macrofagen22,23 onder experimentele omstandigheden, maar de functionaliteit van deze nieuwe geconverteerde pulmonaire macrofagen moeten nog worden omschreven in longziekten. Bovendien begrijpen de drempel van stimulus in het kader van de activering van de AM is een potentieel interessant gebied, zoals de Long probeert te behouden een evenwicht tussen de inflammatoire signalen en de immunoregulerende machines.
De fysiologische of pathologische veranderingen die tot verlies van immuunregulatie leiden zijn belangrijk om te evalueren in verschillende klinische settings (bijvoorbeeld infecties van de luchtwegen, inflammatoire longziekte en fibrotische longziekte). AMs zijn echter steeds meer erkend als indicatoren of zelfs determinanten van de gezondheid van de pulmonaire11,24. Momenteel zijn er geen uniforme protocollen beschikbaar voor oogsten, karakteriseren, en/of onderhouden AMs van mens en preklinische lymfkliertest modellen. Ontbreken van een consensus op AM precursoren en fenotypes en het ontbreken van een gedetailleerde methodologie hadden de grote wegversperring in ontcijferen rol(len) van AM bij pulmonaire gezondheid en ziekte. Het volgende protocol biedt een definitieve identificatie, isolatie en in vitro cultuur strategie die sterk zal verder van het begrijpen van AM gedrag en AM-gerichte diagnostische en therapeutische studies te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en de institutionele Review Board (IRB) bij St Joseph's Hospital and Medical Center.
1. isolatie van AMs aan de vloeistof die lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage (BAL)
- Anaesthetize een acht-week-oude C57BL/6 muis met ketamine (87,5 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (12,5 mg/kg lichaamsgewicht) via een intraperitoneale injectie cocktail. Gaat u verder wanneer muis chirurgische anesthesie met verlies van reflexen en ontspanning van spieren verkrijgt.
- Plaats de muis op een oppervlak van de dissectie met de ventrale zijde naar boven. Ophthalmic dierenarts zalf toepassen op ogen ter voorkoming van uitdroging en veeg het gehele ventrale oppervlak van muis met steriele alcohol prep pads verzadigd met 70% isopropanol desinfecteren.
- Monteer de muis met alle vier poten worden gefixeerd.
- Voorzichtig open de buikholte met micro dissectie tools. Wees voorzichtig om zo veel gebied open mogelijk zonder een viscerale organen beschadigen of overhangende weefsel te maken.
- Voorzichtig open de borstholte langzaam gebeuren de ribbenkast door middel van het mediastinum door te snijden. In het ideale geval kan de ribbenkast worden weggesneden van kant naar kant. Uiterste zorg moet men niet te verwonden de pleura van de longen tijdens het openen van de borstholte.
- Zoek van de vena cava inferior en maak een incisie te bloeden van de muis. Het gebruik van absorberende katoenen pads voor het opzuigen van bloed.
- Injecteren 10 mL ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in het rechterventrikel (met 10 mL spuit en naald 25G) leeggemaakt circulerende cellen van het bloed. Absorberen van de stroom van bloed met absorberend katoen kussentjes. Zodra het volledig geperfundeerd, de longen geblancheerde zal verschijnen en dan klaar voor lavage.
- Voorzichtig opengesneden van de huid en spieren in de nek om de luchtweg bloot te stellen. Accijnzen zorgvuldig de aangrenzende spieren, kraakbeen en vetweefsel zonder schade aan de luchtpijp.
- Maken van een kleine incisie (< 2 mm) op de luchtpijp posterieure aan het strottenhoofd. Deze incisie moet net genoeg om het invoegen van een katheter in terwijl de luchtpijp nog steeds met het strottenhoofd verbonden is. Plaats een katheter 22G 1-inch zonder een naald in de luchtpijp naar de longen. Beveiligen van de katheter met een zijde gevlochten hechtdraad (4-0; niet-absorbeerbare) met een vierkante knoop.
Opmerking: De katheter moet worden bijgesneden op basis van de grootte van de muis. Zeer korte of lange katheters neiging om te lekken en/of de luchtweg tijdens lavage scheuren. Katheter lengte moet zodanig zijn dat wanneer volledig ingevoegd de tip blijft goed binnen de luchtpijp en bereiken niet de primaire bronchiën. - Koppelt u een 1 mL spuit gevuld met ijskoude BAL buffer (Ca2 + en Mg2 + gratis PBS + 1 mM ethyleendiamminetetra zuur, EDTA) om de katheter en langzaam het indruppelen van de buffer in de longen. Dit zal het opblazen van de longen. Houd de injectiespuit toegevoegd aan de katheter van vijf seconden en vervolgens gecombineerd de lavage vloeistof door zachtjes te trekken van de zuiger. Dit zal laten leeglopen van de longen. Het verzamelen van de vloeistof in een conische tube van 15 mL geplaatst op ijs.
- Herhaal stap 1.10 voor negen vaker en bundelen de lavage vloeistof. Overschrijd niet 1 mL buffer per spoeling, als dat kan hoger zijn dan de longcapaciteit en tot haar breuk leiden.
- De muis met CO2 overdosis euthanaseren door IACUC goedgekeurde protocol.
- De vloeistof 10 mL BAL bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten centrifugeren. De cel pellet bevat BAL cellen.
Let op: De pellet kan zeer klein, dus wees voorzichtig bij het aspirating van de bovendrijvende substantie. - Resuspendeer de cellen van de BAL in 100 μl van de stroom/sorteren buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic zuur (HEPES)).
- De niet-specifieke antilichaam dat aan Fc receptor bindt blokkeren door het toevoegen van muis Fc blok (kloon 2.4G2, 10 μg/mL) en incubatie gedurende 20 minuten op het ijs.
- Uitvoeren van antilichaam kleuring samen met fluorescentie min één (FMO) en single-vlek besturingselementen11,25. Evalueren van de BAL cellen door een cel analyzer (Zie Tabel van materialen) gevolgd door eencellige stroom cytometry analyse door passende analysesoftware (Zie Tabel van materialen).
- AMs isoleren door een cel fluorescentie-geactiveerde sorter (Zie Tabel van materialen) direct in 1 mL muis ben kweekmedium wanneer AMs bestemd zijn voor in vitro cultuur of in vivo cel overdracht. Als alternatief (Zie Tabel van materialen) soort AMs in 1 mL Lysis-buffermengsel aangevuld met 10 μl/mL β-Mercaptoethanol voor RNA extractie.
2. isolatie van AMs van muis Long, eencellige schorsing
- Anaesthetize een acht-week-oude C57BL/6 muis met ketamine (87,5 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (12,5 mg/kg lichaamsgewicht) via een intraperitoneale injectie cocktail. Gaat u verder wanneer muis chirurgische anesthesie met verlies van reflexen en ontspanning van spieren verkrijgt.
- Plaats de muis op een oppervlak van de dissectie met de ventrale zijde naar boven. Ophthalmic dierenarts zalf toepassen op ogen ter voorkoming van uitdroging en veeg het gehele ventrale oppervlak van muis met steriele alcohol pads verzadigd met 70% isopropanol desinfecteren.
- Monteer de muis met alle vier poten worden gefixeerd.
- Voorzichtig open de buikholte met micro dissectie tools. Wees voorzichtig om zo veel gebied open mogelijk zonder een viscerale organen beschadigen of overhangende weefsel te maken.
- Voorzichtig open de borstholte langzaam gebeuren de ribbenkast door middel van het mediastinum door te snijden. In het ideale geval kan de ribbenkast worden weggesneden van kant naar kant. Uiterste zorg moet men niet te verwonden de pleura van de longen tijdens het openen van de borstholte.
- Zoek van de vena cava inferior en maak een incisie te bloeden van de muis. Het gebruik van absorberende katoenen pads voor het opzuigen van bloed.
- 10 mL ijskoud PBS injecteren met het rechterventrikel (met 10 mL spuit en naald 25G) leeggemaakt circulerende cellen van het bloed. Zodra het volledig geperfundeerd, de longen geblancheerde zal verschijnen en zijn klaar voor oogst.
- Ontleden uit de longen door doorsnijden omvat van de luchtpijp, de bloedvaten en de ligamenten in een conische tube van 15 mL met 5 mL koude Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (DMEM). Handhaven op ijs tot de volgende stap.
- De muis met CO2 overdosis euthanaseren door IACUC goedgekeurde protocol.
- Breng de perfused longen in een steriele en pyrogeen-gratis 60 mm cultuur schotel met 3 mL DMEM. Met hulp van de ontrafeling van de verlostang plagen uit de luchtwegen en andere harde, niet op premie-of longweefsel materiaal, indien aanwezig. Het longweefsel met een scalpel tot gehakt < 1 mm grootte.
- Voeg 300 µg/mL Liberase TL en 5 U/mL DNase ik, Meng door pipetteren en Incubeer bij 37° C in een broedstoof gedurende 25 minuten. Meng voorzichtig eens door pipetteren na 10 minuten.
- De gedissocieerde longen passeren een 100 µm cel zeef geïnstalleerd op een conische buis van 50 mL. Gebruik de achterkant van een zuiger uit 1 mL spuit aan beslag op cel bosjes op het filter. Was het filter met 20 mL was buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd FBS + 2 mM EDTA).
- Centrifugeer bij 500 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 20 mL was buffer.
- Herhaal stap 2.12 en 2.13 tweemaal, het filter en de buis veranderen elke keer. Vooraf het filter onderdompelen in was buffer voor meer dan vijf minuten verhoogt het rendement van de AM. Maak van eencellige suspensie door toevoeging van 100 μl stroom/sorteren buffer naar de cel-pellet.
- De niet-specifieke antilichaam binding aan de receptor Fc blokkeren door het toevoegen van muis Fc blok (kloon 2.4G2, 10 μg/mL) en incubatie gedurende 20 minuten op het ijs.
- Uitvoeren van antilichaam kleuring samen met FMO en single-vlek besturingselementen11,25. Evalueren van de longen cellen door een cel analyzer (Zie Tabel van materialen) gevolgd door eencellige stroom cytometry analyse door analyse software.
- Soort AMs door een cel sorter (Zie Tabel van materialen) direct in 1 mL muis ben kweekmedium wanneer AMs bestemd zijn voor in vitro cultuur of in vivo cel overdracht. U kunt ook sorteren AMs in 1 mL Lysis-buffermengsel aangevuld met 10 μl/mL β-Mercaptoethanol voor RNA extractie.
3. isolatie van AMs van menselijke BAL vloeistof
- Regelen van de overdracht van de menselijke BAL vloeistof uit de kliniek naar het laboratorium bij 4 ° C.
- Centrifugeer de BAL vloeistof (10-50 mL) bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. De pellet cel bevat BAL cellen11.
- Wassen van de pellet met 20 mL was buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd FBS + 2 mM EDTA) en centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de cellen BAL in 100 μl zijn van de stroom/sorteren buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES).
- De niet-specifieke antilichaam binding aan de receptor Fc blokkeren door toevoeging van menselijke Fc blok (kloon Fc1.3070, 25 μg/mL) en incubatie gedurende 20 minuten op het ijs.
- Uitvoeren van antilichaam kleuring samen met FMO en single-vlek besturingselementen11,24. Evalueren van de BAL cellen door een cel analyzer (Zie Tabel van materialen) gevolgd door eencellige stroom cytometry analyse door analyse software.
- Soort AMs door een cel sorter (Zie Tabel van materialen) direct in 1 mL menselijke AM kweekmedium of 1 mL Lysis-buffermengsel aangevuld met 10 μl/mL β-Mercaptoethanol.
4. in vitro cultuur van AMs
- Na de cel sorteren, oogsten de cellen door centrifugatie bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer menselijke AMs in 1 mL menselijke AM kweekmedium [Roswell Park Memorial Instituut middellange (RPMI) 1640 aangevuld met 10% FBS, 20% L-929 cultuur supernatant (als een bron van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF), 100 eindconcentratie van U/mL), 1 mM natrium pyruvaat 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic zuur (HEPES) en 1 x penicilline/streptomycine (optioneel)]. Evenzo resuspendeer muis AMs in 1 mL muis AM kweekmedium [DMEM aangevuld met 10% FBS, 20% L-929 cultuur supernatant (als een bron van M-CSF, 100 eindconcentratie van U/mL), 1 mM natrium pyruvaat, 10 mM HEPES en 1 x penicilline/streptomycine (optioneel )].
- Inventariseren van de trypan blauw-exclusief levensvatbare cellen door een cel teller en pas de levensvatbare cellen concentratie aan 1 x 106/mL.
Opmerking: in het ideale geval van 5 x 105 AMs kunnen worden geïsoleerd aan de BAL vloeistof verzameld uit een 8-10 week oud C57BL/6 mannelijke muis. De AM-opbrengst van de muis Long digest is variabel en kan worden iets minder dan die van de muis BAL vloeistof. AM opbrengst van menselijke BAL vloeistof is afhankelijk van het volume van de vloeistof van de BAL, de totale hoeveelheid zoutoplossing gebruikt in de lavage en klinische toestand van de patiënt. - Op basis van het rendement en de experimentele noodzaak, seed cellen in kamer dia's, cultuur gerechten of cultuur kolven. In het ideale geval Beënt de AMs op 1 x 105/mL met 10 mL medium in een maatkolf van T25 weefselkweek.
- Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator van 37 ° C met 5% CO2 sfeer.
Opmerking: AMs zal groeien als Adherente cellen en zijn uiterst langzaam groeiende (verdubbeling tijd > 7 dagen). - 24 uur na zaaien, AMs moet aanhanger en zal niet worden losgemaakt door een zachte verandering van kweekmedium. Verwijder het medium door aspiratie van de ene kant en vullen met vers medium vooraf opgewarmd tot 37 ° C.
Opmerking: De cellen kunnen nu worden gebruikt om AM Fysiologie of de effecten van stimuli te beoordelen. AMs gegroeid in kamer dia's gemakkelijk kunnen worden gekleurd met passende antilichamen en zijn ideaal voor microscopische visualisatie. Voor de evaluatie van de cytometrische van de stroom, worden AMs geoogst door incubatie met niet-enzymatische cel distantiëren van de oplossing. - Het kweekmedium gecombineerd en distantieert oplossing genoeg om te dekken van het oppervlak van de cultuur (ongeveer 2 mL per T25 kolf) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten toe te voegen. Geen schrapen nodig zal zijn, en het wordt niet aanbevolen om de cellen mechanisch schrapen. Tik zachtjes op de zijkanten, voeg 1-2 mL buffer stroom/sorteren en Pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag als u wilt loskoppelen van de meerderheid van de Adherente cellen.
- Lyse de cellen direct op de schotel van cultuur door het toevoegen van Lysis buffer voor RNA studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stroom cytometrische aanpak om te identificeren muis AMs is afgebeeld in Figuur 1. Dit omvat analyse van een minimumpakket van oppervlakte markers in AMs onderscheiden van andere Long-ingezeten of Long-infiltreren fagocyten noodzakelijk. Differentiële analyse is vereist AMs positief kan identificeren van interstitiële macrofagen, dendritische cellen, neutrofiele granulocyten, monocyten en monocyt-afgeleide pulmonaire macrofagen die zich in de longen voordoen. Het volgende schema van oppervlakte markers kan worden ingezet om deze celtypes gemakkelijk te onderscheiden van elkaar waar AMs zijn CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+, I-Ab +/-, F4/80-, CD11b- ; Interstitiële macrofagen zijn CD45+, CD11b+, I-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Dendritische cellen zijn CD45+, CD11b+, CD11c+, I-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Dendritische cellen zijn CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+, I-Ab +, CD11b-; Plasmacytoid Dendritic cellen zijn CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+, I-A-b -, neutrofielen zijn CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- , I-A-b -Ly - 6 C-en monocyten zijn CD45+, CD64+/-, Ly - 6 C+/-, ik-A-b -. De bevolking van de AM gemarkeerd in rood (CD11cHallo en Siglec-FHallo) en teal (CD11cHallo, Siglec-Fint), respectievelijk, vertegenwoordigen conventionele AMs (grote bevolking) en pulmonaire macrofagen monocyt-afgeleide ( Minor bevolking) die zich voordoen in de alveolaire ruimte. Stromen sortering van CD45+, CD11cHallo, Siglec-FHallo cellen opbrengsten gezuiverde muis AMs. Figuur 2 illustreert cel oppervlakte markeringen nodig zijn voor een nauwkeurige identificatie en isolatie van menselijke AMs. De menselijke AMs zijn positief geïdentificeerd voor zijn CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, en CD206+ BAL cellen, en kunnen stroom gesorteerd voor downstream toepassingen.
Figuur 1 : Representatief flow cytometrische analyse van muis AMs. (A) anatomische locatie voor AMs in een muis Long weefselsectie (haematoxyline en eosine). AMs worden aangegeven met pijlen en de schaal bar is 60 μm. (B) vertegenwoordiger stroom cytometry gating strategie ter identificatie van de muis AMs in BAL cellen. Monsters werden beoordeeld door een cel analyzer en gegevens werden neer bemonsterd op 500 gebeurtenissen voor vergelijking door de analysesoftware. Rood (CD11cHallo en Siglec-FHallo) en teal (CD11cHallo, Siglec-Fint), respectievelijk, zijn conventionele AMs (grote bevolking) en monocyt-afgeleide pulmonaire macrofagen (kleine bevolking). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief flow cytometrische analyse van menselijke AMs. (A) Gating strategie om te identificeren menselijke AMs van BAL vloeistof uit een menselijke Long transplantatie ontvanger. (B) helder veld opname van menselijke AMs op zeven dagen van de cultuur. De bar van de schaal is 400 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMs zijn lang-leven Long-ingezeten macrofagen die bevolken de longen beginnen bij de geboorte en blijvende over de gehele levensduur26. Hun rol in de pulmonaire fysiologie7 en pathologie12 en hun potentieel voor het voorspellen van pulmonaire autoimmuniteit24 zijn bekroond. Omdat AMs een langdurige aanwezigheid in longen11,27 hebben en omdat zij betrokken bij de activering en de progressie van immuunresponsen11,24, hun rol(len) in andere chronische inflammatoire en fibrotische Long zijn ziekten moet worden geëvalueerd. Historisch, AMs had een verward identiteit en werden vaak onrechte. Met de onlangs aangenomen fenotypische markeringen25,28is het nu mogelijk te onderscheiden menselijke en muis AMs uit andere pulmonaire fagocyten (bijvoorbeeld interstitiële macrofagen, pulmonale dendritische cellen en monocyt afgeleid van pulmonaire macrofagen). De hier beschreven methoden zijn geoptimaliseerd voor isolatie en voor in vitro cultuur van muis en mens AMs. Hoewel deze protocollen kunnen in grote lijnen worden goedgekeurd voor AMs van andere diersoorten, moet passende fenotypische bepaling worden uitgevoerd om vast te stellen een reeks van 'minimaal vereist' oppervlakte markers voor grondige karakterisering.
Voor isolatie van lymfkliertest AMs door lavage, opneming van chelaat agent (d.w.z., EDTA) en vooraf koelen de BAL buffer bleken te zijn belangrijk in de huidige studie. Omdat AMs aanhangend van de alveolaire wanden, gebruik van PBS alleen is niet effectief in het loskomen van de cellen en een aanzienlijk lagere opbrengst geproduceerd. Installatie van de katheter aan de luchtpijp beveiligen is een andere kritische stap. Zorg moet worden getroffen om een lekvrije bijlage die verlies van BAL vloeistof minimaliseert. Extra voorzichtigheid is geboden terwijl lavaging een jongere muis (< 6 weken oud), zoals de structurele delicatesse van de luchtpijp leiden scheuren of lekken tijdens lavage tot kan. Installeren twee opeenvolgende niet-overlappende hechtingen vaak zorgt voor een veilige bevestiging van de katheter en voorkomt lekken. Hoewel niet-enzymatische dissociatie (dwz., met een buffer complexvormer aangevuld) was alleen voor AM isolatie in deze studie wordt uitgevoerd, is het mogelijk dat enzymatische dissociatie met collagenase tijdens Long lavage tot een beter rendement van AM leiden kan.
De opbrengst van menselijke AM aan de vloeistof die BAL is variabele. AMs vormen bijna 10% van alle cellen van de BAL geïnde follow-up van routine na Long transplantatie van menselijke Long transplantatie ontvangers bij Norton ductus Instituut, en het totale rendement van de AM is afhankelijk van meerdere variabelen. Dergelijke variabelen zijn klinische toestand van de patiënt, de hoeveelheid zoutoplossing gebruikt in lavage en het volume van de BAL vloeistof verwerkt voor AM isolatie. Pre lavage procedures (bijvoorbeeld naald biopten), die in microhemorrhage resulteren veranderen de cellulaire samenstelling van cellen van de BAL; Niettemin voorziet uitvoering van fenotypische markers een ondubbelzinnige detectie en karakterisering van de menselijke AM pool (Figuur 2).
Gebruik van L-929 conditioning medium (een bron van M-CSF) was nodig voor het onderhoud in vitro van AMs. Het is onze overtuiging dat suppletie van gezuiverde M-CB zou voldoende zijn om te ondersteunen de AMs in cultuur; een geoptimaliseerde concentratie moet echter worden uitgewerkt voor zowel mens en muis AMs. De gekweekte cellen kan gebruikt voor studies over endocytose, reageren op ontsteking, antigeen presentatie, rijping/activeringsstatus of enige andere bepaling die onderhoud van levende cellen voor een analyse van het tijdsverloop11,24 vereist . In de loop van deze studie was het niet geprobeerd te onderhouden AMs als een continu gekweekte lijn en alleen op korte termijn terminal studies (< 30 dagen sinds de oogst) werden uitgevoerd. Daarom een duidelijke beperking van deze methode is gebrek aan een lange termijn cultuur-gegevens, met name op de stabiliteit van de cellen (dat wil zeggen, of AMs kunnen groeien als een eindige of ononderbroken lijn, de reactie van AMs op cryoprotectant en cryopreservatie, en fenotypische en/of genotypische kien) na aanhoudende cultuur. AMs zijn lang levende cellen in vivo, en een zekere mate van variatie tussen de cellen geïsoleerd uit gezonde longen en van degenen die een infectie van de luchtwegen of inflammatoire/auto-immuun reacties wordt verwacht.
Over het algemeen gepresenteerde de methode hier documenten een vereenvoudigde benadering te isoleren, te karakteriseren, en onderhouden van menselijke en muis AMs in een celcultuur. Hoewel dit protocol kan verder worden geoptimaliseerd op basis van individuele experimentele behoeften, kan het dienen als een beginner's protocol bij het ontleden van de functionele relevantie van AMs in luchtwegen en longen geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren.
Acknowledgments
Wij danken Clare Prendergast voor hulp bij het bewerken van het manuscript. DKN wordt ondersteund door een onderzoek verlenen (#2095) van de Stichting Flinn en TM wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01HL056643 en R01HL092514). DKN de methodes ontwikkeld, ontworpen voor de studie en schreef het manuscript; OM bijgestaan met dierstudies en klinische monster aanbestedingen; SB bijgestaan met Flow cytometrische analyse en cel sorteren; TM onder toezicht van de studies en het herzien van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
