Summary
Denne meddelelse beskriver metoder til isolering og kultur af alveolær makrofager fra mennesker og murine modeller til forsøgsformål.
Abstract
Alveolær makrofager er terminalt differentieret, lunge-resident makrofager af prænatal oprindelse. Alveolær makrofager er unikke i deres lange liv og deres vigtige rolle i lunge udvikling og funktion, samt deres lunge-lokaliseret reaktioner på infektion og inflammation. Til dato, findes ingen ensartet metode til identifikation, isolation og behandling af alveolær makrofager fra mennesker og mus. En sådan metode er behov for undersøgelser på disse vigtige medfødte immun celler i forskellige eksperimentelle indstillinger. Den metode beskrevet her, som kan let vedtages af ethvert laboratorium, er en forenklet indfaldsvinkel til høst alveolær makrofager fra bronchoalveolar lavage væske eller lungevæv og fastholde dem i vitro. Fordi alveolær makrofager opstår primært som vedhængende celler i alveolerne, er fokus for denne metode på løs dem før høst og identifikation. Lungerne er en meget vaskulariserede orgel, og forskellige celletyper af myeloide eller lymfoide oprindelse bebor, interagere og påvirkes af lunge mikromiljø. Ved hjælp af sæt af celleoverflademarkører beskrevet her, kan forskere nemt og utvetydigt skelne alveolær makrofager fra andre leukocytter, og rense dem for efterfølgende ansøgninger. Metoden kultur udviklet heri understøtter både menneskelige og mus alveolær makrofager for in vitro vækst, og er kompatibel med cellulære og molekylære undersøgelser.
Introduction
Lunge mikromiljø er et unikt kompleks økosystem med en omfattende luft conduit og Vaskulaturen. Den inhalerede luft rejser gennem luftrøret og talrige grene af bronkier og bronchioles før de når alveolerne, hvor blod-air gasudveksling opstår. På grund af direkte interaktion med atmosfæren kræver den respiratoriske overflade beskyttelse mod potentielt skadelige virkninger af luftbårne partikler og forurenende stoffer. En række fysiske, kemiske og immunologiske barrierer beskytte lungerne. Navnlig serverer udbredelsen af fagocytter på den respiratoriske overflade et vigtigt første linje forsvarssystem. Alveolær makrofager (AMs) er en type af lunge-resident fagocytter, og de udgør størstedelen af lunge makrofag pool. Som navnet antyder, AMs er primært lokaliseret til den alveolære lumen og forekomme som siddende celler, der hele tiden prøve den omgivende atmosfære og kommunikere med alveolær epitel1. I steady state lunger er mere end 95% af fagocytter i den alveolære rum AMs2, hvis sammensætning kan ændre på grund af betændelse, infektion eller kronisk eksponering for forurenende stoffer.
AMs deltage i en bred vifte af funktioner, der kan være lokale til lungerne og/eller systemisk betydning. For eksempel, er AMs afgørende i udviklingen og optimal funktion af lungerne; immun overvågning; og toldbehandling af celleaffald, invaderende patogener og inhalerede partikler3,4,5,6,7. Målrettet udtynding af AMs vides at forringe clearance af respiratoriske virus og bakterier4,8. Ud over deres rolle som fagocytter og en første-line forsvarere af pulmonal homøostase, AMs er kendt som antigen-præsenterer celler i fremkalde T celle immunitet9, forstærkende effekt af intranasal vaccine10 og påvirke lunge-begrænset autoimmunitet efter lunge transplantation11,12. Mangel i AM funktion har været knyttet til pulmonal alveolær proteinosis (PAP), en tilstand som følge af en genetisk mutation, malignitet eller infektion, der forringer clearance af pulmonal overfladeaktive stoffer13,14. Transplantation af AMs er nu ved at blive undersøgt som en terapeutisk tilgang til behandling af PAP 15,16.
AMs er kendt stammer under embryogenese og persistere i lungerne gennem hele livet uden at blive erstattet af cirkulerende leukocytter2,17. Selvom AM omsætning er ikke målbart i homeostatiske lunger, er varierende niveauer af AM omsætning blevet rapporteret i visse kliniske omstændigheder, herunder infektion af influenza virus4, myeloablative bestråling18, eksponering for endotoxin 19, og alderdom20. AMs menes at selv forny via en lav spredning17,21, men nogle nyere undersøgelser hævder at monocytter kan give anledning til en befolkning på intravaskulær lunge makrofager22,23 under eksperimentelle betingelser, men funktionaliteten af disse nyligt konverterede pulmonal makrofager har endnu at være defineret i lungesygdomme. Derudover forståelse tærsklen til stimulus i forbindelse med AM aktivering er et potentielt interessant område, da lungen forsøger at bevare en balance mellem de inflammatoriske signaler og immunregulerende maskiner.
De fysiologiske eller patologiske ændringer, der fører til tab af immun forordning er vigtigt at vurdere i forskellige kliniske indstillinger (fx luftvejsinfektioner, inflammatoriske lungesygdom og fibrotisk lungesygdom). AMs er imidlertid i stigende grad anerkendt som indikatorer eller endda determinanter for pulmonal sundhed11,24. I øjeblikket, findes der ingen samlet protokoller for høst, karakterisering og/eller opretholde AMs fra mennesker og prækliniske murine modeller. Mangel på enighed om AM prækursorer og fænotyper, og fraværet af en detaljeret metode havde været den store vejspærring i meddelelser rolle(r) i AM i pulmonal sundhed og sygdom. Følgende protokol tilbyder en endelig identifikation, isolation og in vitro- kultur strategi, der vil stærkt fremme forståelsen af AM adfærd og lette AM-målrettet diagnostiske og terapeutiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) og institutionelle Review Board (IRB) på St. Joseph's Hospital og Medical Center.
1. isolering af AMs fra Murine Bronchoalveolar Lavage (BAL) væske
- Anaesthetize en otte-uge-forhenværende C57BL/6 mus med ketamin (87,5 mg/kg kropsvægt) og xylazin (12,5 mg/kg kropsvægt) cocktail via en intraperitoneal injektion. Fortsætte når musen opnår kirurgisk anæstesi med tab af reflekser og afslapning af muskler.
- Placer musen på en dissektion overflade med den ventrale side opad. Anvende oftalmologiske vet salve på øjnene at forhindre dehydrering og tørre hele den ventrale overflade af mus med steril alkohol prep puder mættet med 70% isopropanol til at desinficere.
- Montere musen med alle fire ben tilbageholdende.
- Forsigtigt åbne bughulen med micro dissektion værktøjer. Skal sørges for at åbne så meget område som muligt uden at skade nogen viscerale organer eller oprette udhængende væv.
- Forsigtigt åbne brysthulen ved langsomt incising brystkassen gennem mediastinum. Ideelt, brystkassen kan være skåret ud fra side til side. Ekstrem omhu skal tages ikke at skade lungerne pleura under åbning af brysthulen.
- Find den ringere vena cava og gøre et snit til at bløde musen. Bruge absorberende vatrondeller til at suge blod op.
- Injicér 10 mL iskold fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ind i højre hjertekammer (ved hjælp af 10 mL sprøjte og 25G kanyle) for at skylle cirkulerende blod celler. Absorbere strømmen af blod med absorberende vatrondeller. Når helt perfunderet, lungerne vises blancheret og er derefter klar til lavage.
- Forsigtigt skære åbne hud og muskler i nakken til at udsætte luftvejene. Omhyggeligt Punktafgifter tilstødende muskler, brusk og fedt væv uden at beskadige luftrøret.
- Gør et lille snit (< 2 mm) på luftrøret posterior til strubehovedet. Dette indsnit bør være lige nok til at indsætte et kateter ind mens luftrøret er stadig knyttet til strubehovedet. Indsætte en 1-tommer 22G kateter uden nål i luftrøret til lungerne. Sikre kateter med en silke flettet sutur (4-0; ikke-resorberbare) med en firkantede knude.
Bemærk: Kateteret skal være trimmet baseret på mus størrelse. Ekstremt korte eller lange katetre tendens til at lække og/eller rive luftvejene under lavage. Kateter længde skal være sådan at når sat helt tip resterne godt inden for luftrøret og ikke nå de primære bronkier. - Vedhæfte en 1 mL sprøjte fyldt med iskolde BAL buffer (Ca2 + og Mg2 + gratis PBS + 1 mM ethylendiamintetra syre, EDTA) til kateteret og langsomt instill bufferen i lungerne. Det vil puste i lungerne. Hold sprøjten knyttet til kateteret i fem sekunder og derefter Aspirér lavage væske ved forsigtigt at trække stemplet. Dette vil tømme lungerne. Indsamle væsken i en 15 mL konisk slange lagt på is.
- Gentag trin 1,10 for ni flere gange og samle lavage væske. Ikke overstige 1 mL buffer pr flush, som der kan overstige lungekapacitet og føre til sit ruptur.
- Aflive mus med CO2 overdosis af IACUC godkendt protokollen.
- Centrifugeres 10 mL BAL væske på 250 x g ved 4 ° C i 10 minutter. Celle pellet indeholder BAL celler.
Forsigtighed: Pellet kan være meget små, så udvise forsigtighed, når sugning supernatanten. - Resuspend BAL celler i 100 μL af flow/sortering buffer (PBS + 2% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic syre (HEPES)).
- Blokere uspecifik antistof binding til Fc receptor ved at tilføje musen Fc blok (klon 2.4G2, 10 μg/mL) og inkubere i 20 minutter på is.
- Udføre antistof farvning med fluorescens minus én (FMO) og single-pletten kontrol11,25. Evaluere BAL celler af en celle analyzer (Se Tabel af materialer) efterfulgt af en enkelt celle flow flowcytometri analyse af relevant analyse software (Se Tabel af materialer).
- Isolere AMs af et fluorescens-aktiveret celle sidesorteringen (Se Tabel af materialer) direkte ind i 1 mL mus er næringssubstratet når AMs er beregnet til in vitro kultur eller i vivo celle overførsel. Alternativt, sortere AMs i 1 mL lysisbuffer (Se Tabel af materialer) suppleret med 10 μl/mL β-Mercaptoethanol for RNA udvinding.
2. isolering af AMs fra mus lunge, encellede Suspension
- Anaesthetize en otte-uge-forhenværende C57BL/6 mus med ketamin (87,5 mg/kg kropsvægt) og xylazin (12,5 mg/kg kropsvægt) cocktail via en intraperitoneal injektion. Fortsætte når musen opnår kirurgisk anæstesi med tab af reflekser og afslapning af muskler.
- Placer musen på en dissektion overflade med den ventrale side opad. Anvende oftalmologiske vet salve på øjnene at forhindre dehydrering og tørre hele den ventrale overflade af mus med steril alkohol puder mættet med 70% isopropanol til at desinficere.
- Montere musen med alle fire ben tilbageholdende.
- Forsigtigt åbne bughulen med micro dissektion værktøjer. Skal sørges for at åbne så meget område som muligt uden at skade nogen viscerale organer eller oprette udhængende væv.
- Forsigtigt åbne brysthulen ved langsomt incising brystkassen gennem mediastinum. Ideelt, brystkassen kan være skåret ud fra side til side. Ekstrem omhu skal tages ikke at skade lungerne pleura under åbning af brysthulen.
- Find den ringere vena cava og gøre et snit til at bløde musen. Bruge absorberende vatrondeller til at suge blod op.
- Indsprøjtes 10 mL iskold PBS i højre hjertekammer (ved hjælp af 10 mL sprøjte og 25G kanyle) for at skylle cirkulerende blod celler. Når helt perfunderet, lungerne vises blancheret og er klar til høst.
- Dissekere ud i lungerne ved overskæring luftrøret, blodkar og ledbånd i en 15 mL konisk slange med 5 mL af kolde Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM). Opretholde det på køl indtil det næste skridt.
- Aflive mus med CO2 overdosis af IACUC godkendt protokollen.
- Overfør perfused lungerne i en steril og pyrogen-gratis 60 mm kultur skål med 3 mL DMEM. Med hjælp af dissekere pincet drille ud af luftvejene og andre hårde ikke-lungevæv materiale, hvis den findes. Hakkekød lungevæv med en skalpel til < 1 mm størrelse.
- Tilsæt 300 µg/mL Liberase TL og 5 U/mL DNase jeg, mix af pipettering og inkuberes ved 37° C i en inkubator i 25 minutter. Forsigtigt blandes én gang af pipettering efter 10 minutter.
- Passere dissocierede lungerne gennem en 100 µm celle si installeret på en 50 mL konisk slange. Bruge bagsiden af en stemplet fra 1 mL sprøjte for at mash up celle klumper på filteret. Vask filteret med 20 mL vaskebuffer (PBS + 2% varme inaktiverede FBS + 2 mM EDTA).
- Der centrifugeres 500 x g ved 4 ° C i 5 minutter. Supernatanten og resuspenderes celle i 20 mL wash buffer.
- Gentag trin 2.12 og 2.13 to gange, ændring af filter og slange hver gang. Pre iblødsætning filteret i wash buffer for mere end fem minutter øger AM udbytte. Forbered encellede suspension ved at tilføje 100 μL flow/sortering buffer til celle pellet.
- Blokere uspecifik antistof binding til Fc receptor ved at tilføje musen Fc blok (klon 2.4G2, 10 μg/mL) og inkubere i 20 minutter på is.
- Udføre antistof farvning FMO og single-pletten kontrol11,25. Evaluere lungekræft cellerne ved en celle analyzer (Se Tabel af materialer) efterfulgt af encellede flowcytometri analyse af analyse software.
- Form AMs af en celle sidesorteringen (Se Tabel af materialer) direkte ind i 1 mL mus er næringssubstratet når AMs er beregnet til in vitro kultur eller i vivo celle overførsel. Alternativt kan du sortere AMs i 1 mL lysisbuffer suppleret med 10 μl/mL β-Mercaptoethanol for RNA udvinding.
3. isolering af AMs fra menneskelige BAL væske
- Arrangere overførslen af den menneskelige BAL væske fra klinikken til laboratorium ved 4 ° C.
- Der centrifugeres BAL væske (10-50 mL) på 250 x g ved 4 ° C i 10 minutter. Celle pellet indeholder BAL celler11.
- Vaske pellet med 20 mL vaskebuffer (PBS + 2% varme inaktiverede FBS + 2 mM EDTA) og centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 minutter.
- Resuspend BAL celler er i 100 μL af flow/sortering buffer (PBS + 2% varme inaktiverede FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).
- Blokere uspecifik antistof binding til Fc receptor ved at tilføje menneskelige Fc blok (klon Fc1.3070, 25 μg/mL) og inkubere i 20 minutter på is.
- Udføre antistof farvning FMO og single-pletten kontrol11,24. Evaluere BAL celler af en celle analyzer (Se Tabel af materialer) efterfulgt af encellede flowcytometri analyse af analyse software.
- Sorter AMs af en celle sidesorteringen (Se Tabel af materialer) direkte ind i 1 mL menneskelige AM næringssubstratet eller 1 mL lysisbuffer suppleret med 10 μl/mL β-Mercaptoethanol.
4. in vitro kultur af AMs
- Efter cellen sortering, skal du høste cellerne ved centrifugering ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
- Resuspend menneskelige AMs i 1 mL menneskelige AM næringssubstratet [Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 suppleret med 10% FBS, 20% L-929 kultur supernatanten (som en kilde til makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF), 100 U/mL endelige koncentration), 1 mM natrium pyruvat, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic syre (HEPES), og 1 x penicillin/streptomycin (valgfri)]. Ligeledes resuspend mus AMs i 1 mL mus AM næringssubstratet [DMEM suppleret med 10% FBS, 20% L-929 kultur supernatanten (som en kilde til M-CSF, 100 U/mL endelige koncentration), 1 mM natrium pyruvat, 10 mM HEPES og 1 x penicillin/streptomycin (valgfri )].
- Optælles trypan blå-eksklusive levedygtige celler af en celle counter og justere levedygtige celle koncentration på 1 x 106/mL.
Bemærk: Ideelt set op til 5 x 105 AMs kan isoleres fra BAL væske indsamlet fra en 8-10 uge gamle C57BL/6 mandlige mus. AM udbyttet af mus lunge digest er variabel og kan være lidt mindre end mus BAL væske. AM udbytte fra menneskelige BAL væske afhænger af mængden af BAL væske, den samlede mængde af saltvand bruges i lavage og patientens kliniske tilstand. - Baseret på udbytte og eksperimenterende nødvendighed, seed celler i salen dias, kulturen retter eller kultur kolber. Ideelt, seed AMs på 1 x 105/mL med 10 mL medium i en T25 vævskultur kolbe.
- Inkuber celler i et 37 ° C befugtet kuvøse med 5% CO2 atmosfære.
Bemærk: AMs vil vokse som vedhængende celler og er meget langsomt voksende (fordobling tid > 7 dage). - 24 timer efter såning, AMs bør være tilhænger og vil ikke adskilles af en blid ændring af næringssubstratet. Fjern mediet ved aspiration fra den ene ende og genopbygge med friske medium pre varmet til 37 ° C.
Bemærk: Cellerne kan nu bruges til at vurdere AM fysiologi eller virkningerne af stimuli. AMs vokset i salen slides kan være bekvemt farves med passende antistoffer og er ideelle til mikroskopiske visualisering. Flow cytometric evaluering høstes AMs ved inkubering med ikke-enzymatiske celle miljøomkostningerne løsning. - Opsug næringssubstratet og tilføje miljøomkostningerne løsning nok til at dække kultur overflade (ca. 2 mL pr. T25 kolbe) og inkuberes ved 37 ° C i 5-10 minutter. Ingen skrabning bliver nødvendigt, og det anbefales ikke at skrabe cellerne mekanisk. Tryk forsigtigt på siderne, tilføje 1-2 mL flow/sortering buffer og forsigtigt pipetteres op og ned for at frigøre fleste vedhængende celler.
- RNA undersøgelser, lyse celler direkte på kultur skålen ved at tilføje lysisbuffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flow cytometric tilgang til at identificere mus AMs er vist i figur 1. Dette omfatter analyse af et minimumssæt af celleoverflademarkører nødvendige skelne AMs fra andre lunge-resident eller lunge-infiltrerer fagocytter. Differentieret analyse skal identificere AMs fra interstitiel makrofager, dendritiske celler, neutrofiler, monocytter og monocyt-afledte pulmonal makrofager, der forekommer i lungerne. Følgende ordningen af overflade markører kan være ansat til let skelne disse celletyper fra hinanden hvor AMs er CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+,-Ab + /-, F4/80-, CD11b- ; Interstitiel makrofager er CD45+, CD11b+,-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Dendritiske celler er CD45+, CD11b+, CD11c+,-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Dendritiske celler er CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+,-Ab +, CD11b-; Plasmacytoid Dendritic celler er CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+,-Ab -, neutrofile er CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab -, Ly - 6 C-og monocytter er CD45+, CD64+/-, Ly - 6 C+/-,-Ab -. AM populationer fremhævet med rødt (CD11cHej og Siglec-FHej) og krikand (CD11cHej, Siglec-Fint), henholdsvis repræsenterer konventionelle AMs (store befolkning) og monocyt-afledte pulmonal makrofager ( mindre befolkning) der forekommer i den alveolære rum. Flow sortering af CD45+, CD11cHej, Siglec-FHej celler udbytter renset mus AMs. Figur 2 illustrerer celle celleoverflademarkører nødvendige til en præcis identifikation og dyrkning af menneskelige AMs. De menneskelige AMs er positivt identificeret for at være CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, og CD206+ BAL-celler, og kan være strøm sorteret for efterfølgende ansøgninger.
Figur 1 : Repræsentant flow cytometric analyse af musen AMs. (A) anatomiske placering af AMs i en mus lunge væv sektion (hæmatoxylin og eosin). AMs er angivet med pile og skalalinjen er 60 μm. (B) repræsentative flowcytometri gating strategi for at identificere mus AMs i BAL celler. Prøverne blev evalueret af en celle analyzer og data var ned samplet til 500 begivenheder for sammenligning af analyse software. Rød (CD11cHej og Siglec-FHej) og krikand (CD11cHej, Siglec-Fint), henholdsvis er konventionelle AMs (store befolkning) og monocyt-afledte pulmonal makrofager (mindre befolkning). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant flow cytometric analyse af menneskers AMs. (A) Gating strategi for at identificere menneskelige AMs fra BAL væske fra en menneskelig lunge transplantation modtager. (B) lysfelt Mikrograf af menneskelige AMs på syv dage af kultur. Skalalinjen er 400 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMs er lang-levende lunge-resident makrofager, der befolker i lungerne begynder ved fødslen og enduring over hele levetid26. Deres roller i pulmonal fysiologi7 og patologi12 og deres potentiale til at forudsige pulmonal autoimmunitet24 er blevet anerkendt. Fordi AMs har en langsigtet tilstedeværelse i lungerne11,27 , og fordi de er involveret i aktivering og progression af immunrespons11,24, deres roller i andre kroniske inflammatoriske og fibrotisk lunge sygdomme skal evalueres. Historisk, AMs havde en forvirret identitet og var ofte fejlagtigt. Med nyligt vedtagne fænotypiske markører25,28er det nu muligt at skelne mellem mennesker og mus AMs fra andre pulmonal fagocytter (fx interstitiel makrofager, pulmonal dendritiske celler og monocyt afledt pulmonal makrofager). De metoder, der beskrives her har været optimeret til isolation og i in vitro kultur af mus og menneskelige AMs. Selv om disse protokoller kan vedtages bredt for AMs fra andre arter, gennemføres passende fænotypiske beslutsomhed for at fastlægge en række "minimalt kræves" overflade markører for grundig karakterisering.
For isolation af murine AMs af lavage, inddragelse af chelaterende agent (dvs., EDTA) og pre nedkøling BAL buffer blev fundet for at være vigtigt i den aktuelle undersøgelse. Fordi AMs er vedhængende til alveolær væggen, brug af PBS alene var ineffektive i løs cellerne og produceret et betydeligt lavere udbytte. Sikring af installation af kateter til luftrøret er en anden afgørende skridt. Skal sørges for en lækagesikre vedhæftet fil, der minimerer tab af BAL væske. Ekstra forsigtige mens lavaging en yngre mus (< 6 uger gamle), som den strukturelle delikatesse af luftrøret kan resultere i rivning eller lækage under lavage. Installere to på hinanden følgende ikke-overlappende suturer ofte sikrer en sikker fastgørelse af kateteret og forhindrer lækager. Selv om ikke-enzymatiske dissociation (dvs., med en chelator suppleret buffer) var kun udføres for AM isolation i denne undersøgelse, er det muligt, at enzymatisk dissociation med collagenase under lunge lavage kan producere en bedre AM udbytte.
Udbyttet af menneskelige AM fra BAL væske er variabel. AMs udgør næsten 10% af alle BAL celler indsamlet fra menneskelige lunge transplantation modtagere på Norton thorax Institute under rutinemæssige efter lungetransplantation opfølgning, og den samlede AM udbytte er afhængig af flere variabler. Sådanne variabler omfatter patientens kliniske tilstand, mængden af saltvand bruges i lavage og mængden af BAL væske behandlet for AM isolation. Pre lavage procedurer (f.eks. nål biopsier) som resultere i microhemorrhage ændrer den cellulære sammensætning af BAL celler; ikke desto mindre, gennemførelsen af fænotypiske markører giver mulighed for en entydig påvisning og karakterisering af den menneskelige AM pool (figur 2).
Brug af L-929 conditioning medium (en kilde til M-CSF) var nødvendigt for in vitro- vedligeholdelse af AMs. Det er vores overbevisning, at tilskud af renset M-CSF ville være tilstrækkelig til at opretholde AMs i kultur; en optimeret koncentration skal imidlertid arbejdes ud for både mennesker og mus AMs. Den kulturperle celler kan bruges til undersøgelser af endocytose, svar på betændelse, antigen præsentation, modning/aktivisering status eller andre assay, der kræver vedligeholdelse af levende celler for en tid-kursus analyse11,24 . I løbet af denne undersøgelse, var det ikke forsøgte at opretholde AMs som en løbende kulturperler linje og kun kortsigtede terminal undersøgelser (< 30 dage siden høst) blev udført. Derfor et indlysende begrænsning til denne metode er manglen på en langsigtet kultur data, især på stabiliteten af cellerne (dvs. om AMs kan vokse som en finite eller kontinuerlig linje, svar på AMs cryoprotectants og kryopræservering, og Fænotypiske og/eller genotypiske drift) efter igangværende kultur. AMs er lang levende celler in vivo og en vis grad af variation forventes mellem cellerne isoleret fra sunde lunger og dem gennemgår luftvejsinfektion eller inflammatorisk/autoimmune reaktioner.
Samlet set præsenteres metoden her dokumenter en forenklet tilgang til afsondrethed, kendetegner, og opretholdelse af menneskelig og mus AMs i en celle kultur system. Selv om denne protokol kan optimeres yderligere, baseret på individuelle eksperimentelle behov, kan det tjene som en nybegynder protokollen at dissekere funktionelle relevansen af AMs i luftvejssygdomme og pulmonal medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Clare Prendergast for bistand med redigering håndskriftet. DKN understøttes af en forskning tilskud (#2095) fra Flinn Foundation og TM understøttes af tilskud fra National Institutes of Health (R01HL056643 og R01HL092514). DKN udviklet metoder, designet af undersøgelsen og skrev manuskriptet; OM bistået med dyreforsøg og kliniske prøve indkøb; SB bistået med Flow cytometric analyse og celle sortering; TM overvåget undersøgelserne og gennemgik håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
