Summary
Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.
Abstract
Alveoläre Makrophagen sind unheilbar differenzierte, Lunge-Bewohner Makrophagen pränatalen Ursprungs. Alveoläre Makrophagen sind einzigartig in ihrem langen Leben und ihre wichtige Rolle bei der Lungenentwicklung und Funktion sowie ihre Lunge lokalisiert Reaktionen auf Infektionen und Entzündungen. Bisher existiert kein einheitliches Verfahren für die Identifizierung, Isolierung und Handhabung der alveolären Makrophagen von Menschen und Mäusen. Diese Methode ist für Studien über diese wichtigeren angeborenen immunen Zellen in verschiedene experimentelle Einstellungen erforderlich. Die hier beschriebene Methode, die leicht von jedem Labor übernommen werden können, ist ein vereinfachter Ansatz Ernte alveoläre Makrophagen aus alvéolaire Lavage Fluid oder von Lungengewebe und pflegen sie in Vitro. Da alveoläre Makrophagen in erster Linie als adhärente Zellen in den Alveolen auftreten, liegt der Schwerpunkt dieser Methode auf verdrängen sie vor der Ernte und Identifikation. Die Lunge ist ein stark vaskularisierte Organ, und verschiedene Zelltypen myeloischen und lymphatischen Ursprungs bewohnen, interagieren und durch die Lunge Mikroumgebung beeinflusst werden. Mit dem Satz von oberflächenmarker beschrieben hier, können Forscher leicht und eindeutig andere Leukozyten alveoläre Makrophagen unterscheiden und für downstream-Anwendungen reinigen. Die Kultur-Methode entwickelt hierin unterstützt sowohl menschlich als auch Maus alveoläre Makrophagen für in-vitro- Wachstum und ist kompatibel mit zellulären und molekularen Studien.
Introduction
Die Lunge Mikroumgebung ist ein einzigartig Komplexes Ökosystem mit einer aufwendigen Luftleitung und Gefäßsystem. Die eingeatmete Luft geht durch die Luftröhre und durch zahlreiche Zweige der Bronchien und Bronchiolen vor Erreichen der Alveolen, wo die Blut-Luft-Gasaustausch auftritt. Durch direkte Interaktion mit der Atmosphäre erfordert die respiratorische Oberfläche Schutz vor potenziell schädlichen Auswirkungen von luftgetragenen Partikeln und Schadstoffen. Eine Reihe von physikalischen, chemischen und immunologischen Barrieren schützen die Lungen. Bereitstellung von Phagozyten an der respiratorischen Oberfläche dient vor allem eine wichtige Erstlinien Abwehrsystem. Alveoläre Makrophagen (AMs) sind eine Art von Lungenkrebs-Resident Phagozyten, und sie bilden die überwiegende Mehrheit der Lunge Makrophagen Pool. Wie ihr Name schon sagt, AMs sind in erster Linie auf das alveoläre Lumen lokalisiert und treten als festsitzende Zellen, die ständig der Umgebungsatmosphäre zu probieren und die Kommunikation mit der alveoläre Epithel1. Im Steady-State Lunge sind mehr als 95 % der Phagozyten im alveolären Bereich AMs2, deren Zusammensetzung aufgrund von Entzündungen, Infektionen oder chronische Exposition gegenüber Schadstoffen verändern kann.
AMs beteiligen sich eine Vielzahl von Funktionen, die möglicherweise lokal auf die Lunge und/oder systemrelevant. AMs sind beispielsweise wichtig bei der Entwicklung und die optimale Funktion der Lunge; immunüberwachung; und Freigabe der zelltrümmer, eindringende Krankheitserreger und inhalierten Partikel3,4,5,6,7. Gezielte Dezimierung der AMs ist bekannt, Räumung von respiratorischen Viren und Bakterien4,8beeinträchtigen. Neben ihrer Rolle als Phagozyten und eine Erstlinien Verteidiger der pulmonalen Homöostase, AMs sind dafür bekannt, funktionieren wie Antigen-präsentierenden Zellen in entlocken T Zell-Immunität9, die Wirksamkeit der intranasale Impfstoff10 potenzierende und Beeinflussung der Lunge eingeschränkt Autoimmunität nach Lung Transplantation11,12. Mangel AM Funktion ist verbunden worden, um pulmonale alveoläre Proteinosis (PAP), eine Bedingung, die durch eine genetische Mutation, Bösartigkeit oder Infektion, die Clearance von pulmonalen Tenside13,14beeinträchtigt. Transplantation von AMs wird jetzt als einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von PAP- 15,16geprüft.
AMs sind bekannt in der Embryogenese stammen und in den Lungen lebenslang beibehalten, ohne durch zirkulierenden Leukozyten2,17ersetzt. Obwohl AM Umsatz in homöostatische Lunge nicht nachweisbar ist, sind unterschiedlicher AM Umsatz in bestimmten klinischen Bedingungen, einschließlich Infektion berichtet worden, durch das Influenza-Virus4, Bolusinjektion Bestrahlung18, Einwirkung von endotoxin 19und Alter20. AMs werden geglaubt, um über eine minderwertige Verbreitung17,21selbst zu erneuern, aber einige neuen Studien behaupten, dass Monozyten können Anlass zu einer Bevölkerung von intravaskulären Lunge Makrophagen22,23 unter experimentelle Bedingungen, aber Funktionalität diese neu konvertierte pulmonaler Makrophagen haben noch bei Lungenkrankheiten definiert werden. Darüber hinaus ist die verstehen der Schwellenwerts des Reizes im Zusammenhang mit der Aktivierung AM eine potenziell interessante Gegend, wie die Lunge ein Gleichgewicht zwischen den entzündlichen Signalen und immunregulatorische Maschinen zu bewahren versucht.
Die physiologischen oder pathologischen Veränderungen, die zu Verlust der Immunregulation sind wichtig, in verschiedenen klinischen Einstellungen (z. B. Infektionen der Atemwege, entzündliche Lungenerkrankungen und fibrotische Lungenerkrankung) zu bewerten. AMs werden allerdings zunehmend als Indikatoren oder sogar Determinanten der pulmonalen Gesundheit11,24anerkannt. Derzeit gibt es keine einheitliche Protokolle zur Ernte, Charakterisierung und/oder Aufrechterhaltung AMs aus Mensch und präklinischen murinen Modellen. Mangel an Konsens über AM Ausgangsstoffe und Phänotypen und fehlender eine detaillierte Methode das Haupthindernis in Entzifferung Rolle(n) AM pulmonalen Gesundheit und Krankheit gewesen. Das folgende Protokoll bietet ein endgültiges Identifikations-, isoliert und in-vitro- Kultur-Strategie, die stark AM gezielte diagnostische und therapeutische Studien erleichtern und das Verständnis der AM Verhalten wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) und die institutionelle Review Board (IRB) am St.-Josephs Hospital und Medical Center genehmigt.
1. Isolierung des AMs aus murinen alvéolaire Lavage (BAL) Flüssigkeit
- Betäuben Sie eine acht Wochen alten C57BL/6-Maus mit Ketamin (87,5 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12,5 mg/kg Körpergewicht) über eine intraperitoneale Injektion cocktail. Gehen Sie bei Maus chirurgische Anästhesie mit Verlust von Reflexen und Entspannung der Muskulatur erreicht.
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Dissektion-Oberfläche, mit der Bauchseite nach oben. Tragen Sie Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf Augen zu verhindern Austrocknung und wischen die gesamte ventrale Oberfläche der Maus mit sterilen Prep Alkoholtupfer gesättigt mit 70 % Isopropanol zu desinfizieren.
- Montieren Sie die Maus mit allen vier Beinen zurückgehalten.
- Öffnen Sie sanft die Bauchhöhle mit Mikro Dissektion Werkzeuge. Vorsicht ist geboten, um so viel Raum wie möglich zu öffnen, ohne irgendwelche viszeralen Organe beschädigen oder überhängenden Gewebe zu schaffen.
- Sanft öffnen der Brusthöhle durch Eingrabung langsam den Brustkorb durch das Mediastinum. Im Idealfall können den Brustkorb von Seite zur Seite herausgeschnitten werden. Extreme Vorsicht ist geboten, um nicht zu verletzen die Pleura der Lunge während des Öffnens der Brusthöhle.
- Suchen Sie die minderwertige Vena Cava und einen Einschnitt, die Maus zu bluten. Verwenden Sie Watte-Pads, um Blut aufzusaugen.
- Injizieren Sie 10 mL eiskaltes Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Rechte Herzkammer (mit 10 mL Spritze und Nadel 25G) zum zirkulierenden Blutzellen zu spülen. Der Blutfluss mit Watte-Pads zu absorbieren. Einmal komplett durchblutet, die Lungen erscheint blanchiert und sind dann bereit für Lavage.
- Vorsichtig Aufschneiden der Haut und Muskel in den Hals, um die Atemwege zu entlarven. Verbrauchsteuern Sie sorgfältig die angrenzenden Muskeln, Knorpel und Fettgewebe ohne Beschädigung der Luftröhre.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (< 2 mm) auf die Luftröhre nach den Kehlkopf. Dieser Schnitt sollte gerade genug, um einen Katheter in einfügen, während die Luftröhre Kehlkopf noch angeschlossen ist. Legen Sie einen 1-Zoll-22G-Katheter ohne Nadel in die Luftröhre zur Lunge. Der Katheter mit einer Seide geflochtene Naht (4: 0; nicht absorbierbare) mit einem Kreuzknoten.
Hinweis: Der Katheter muss getrimmt werden basierend auf der Größe der Maus. Extrem kurze oder lange Katheter tendenziell undicht und/oder reißen die Atemwege während Lavage. Katheter-Länge sollte so sein, dass bei vollständig eingesteckt bleibt die Spitze gut innerhalb der Luftröhre und erreichen nicht die primäre Bronchien. - Befestigen Sie eine 1-mL-Spritze mit eiskalten BAL-Puffer (Ca2 + und Mg2 + kostenlose PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure, EDTA) des Katheters gefüllt und vermitteln Sie langsam den Puffer in die Lunge zu. Dies wird die Lungen aufzublasen. Halten Sie die Spritze befestigt am Katheter für fünf Sekunden und Aspirieren Sie die Lavage-Flüssigkeit durch leichtes Ziehen des Kolbens. Dies wird Luft aus der Lunge. Sammeln Sie die Flüssigkeit in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis gelegt.
- Wiederholen Sie Schritt 1.10 für neun weitere Male und bündeln Sie die Lavage-Flüssigkeit. Überschreiten Sie 1 mL Puffer pro Spülung, nicht, da das Überschreiten der Lungenkapazität und zu seinen Bruch führen kann.
- Die Maus mit CO2 Überdosierung durch IACUC genehmigte Protokoll einschläfern.
- Zentrifugieren Sie die 10 mL BAL-Flüssigkeit bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten. Die Zelle Pellet enthält BAL Zellen.
Vorsicht: Das Pellet kann sehr klein sein, also seien Sie vorsichtig, wenn den überstand absaugen. - Aufschwemmen Sie BAL Zellen in 100 μL der Strömung/Sortierung Puffer (PBS + 2 % Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic Säure (HEPES)).
- Die unspezifische Antikörperbindung an Fc-Rezeptor zu blockieren, indem hinzufügen Maus Fc-Block (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis.
- Führen Sie Antikörper Färbung zusammen mit Fluoreszenz minus eins (FMO) und Single-Fleck steuert11,25. Bewerten die BAL Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Flow Cytometry-Analyse von geeigneten Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien).
- AMs isolieren von einer Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) direkt in 1 mL Maus bin Kulturmedium beim AMs für Kultur in Vitro oder in Vivo bestimmt sind Zelle übertragen. Alternativ (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt Art AMs in 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol für RNA-Extraktion.
2. Isolierung des AMs von Maus-Lunge, Single-Zellsuspension
- Betäuben Sie eine acht Wochen alten C57BL/6-Maus mit Ketamin (87,5 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12,5 mg/kg Körpergewicht) über eine intraperitoneale Injektion cocktail. Gehen Sie bei Maus chirurgische Anästhesie mit Verlust von Reflexen und Entspannung der Muskulatur erreicht.
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Dissektion-Oberfläche, mit der Bauchseite nach oben. Tragen Sie Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf Augen zu verhindern Austrocknung und wischen die gesamte ventrale Oberfläche der Maus mit sterilen Alkoholtupfer gesättigt mit 70 % Isopropanol zu desinfizieren.
- Montieren Sie die Maus mit allen vier Beinen zurückgehalten.
- Öffnen Sie sanft die Bauchhöhle mit Mikro Dissektion Werkzeuge. Vorsicht ist geboten, um so viel Raum wie möglich zu öffnen, ohne irgendwelche viszeralen Organe beschädigen oder überhängenden Gewebe zu schaffen.
- Sanft öffnen der Brusthöhle durch Eingrabung langsam den Brustkorb durch das Mediastinum. Im Idealfall können den Brustkorb von Seite zur Seite herausgeschnitten werden. Extreme Vorsicht ist geboten, um nicht zu verletzen die Pleura der Lunge während des Öffnens der Brusthöhle.
- Suchen Sie die minderwertige Vena Cava und einen Einschnitt, die Maus zu bluten. Verwenden Sie Watte-Pads, um Blut aufzusaugen.
- Injizieren Sie 10 mL eiskaltem PBS in den rechten Ventrikel (mit 10 mL Spritze und Nadel 25G), um die zirkulierenden Blutzellen zu spülen. Einmal komplett durchblutet, die Lungen erscheint blanchiert und sind bereit für die Ernte.
- Aus der Lunge durch Abtrennen der Luftröhre, Blutgefäße und Bänder in ein 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL kaltes sezieren Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM). Erst im nächsten Schritt auf Eis halten.
- Die Maus mit CO2 Überdosierung durch IACUC genehmigte Protokoll einschläfern.
- Übertragen Sie der PERFUNDIERTEN Lunge in einer Kulturschale sterile und Pyrogenfreie kostenlos 60 mm mit 3 mL DMEM. Herauszuarbeiten Sie mit Hilfe der Zange sezieren, die Atemwege und andere harte Lungengewebe Material, falls vorhanden. Zerkleinere das Lungengewebe mit einem Skalpell zu < 1 mm Größe.
- Hinzufügen von 300 µg/mL Liberase TL und 5 U/mL DNase I, mischen, indem Sie pipettieren und 25 Minuten bei 37° C in einem Inkubator inkubieren. Mischen Sie vorsichtig einmal durch pipettieren nach 10 Minuten.
- Ein 100 µm Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr installiert durchlaufen Sie die dissoziierten Lungen. Verwenden Sie die Rückseite von einem Kolben von 1 mL Spritze, mash up Zelle Klumpen auf dem Filter. Waschen Sie den Filter mit 20 mL Waschpuffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 2 mM EDTA).
- Zentrifugieren Sie bei 500 X g bei 4 ° C für 5 Minuten. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL Waschpuffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.12 und 2.13 zweimal, Filter und Schlauch jedes Mal ändern. Pre-Einweichen des Filters in Waschpuffer für mehr als fünf Minuten erhöht die AM Ertrag. Bereiten Sie Einzel-Zellsuspension durch Zugabe von 100 μl Puffer, um die Zelle Pellet Fluss/Sortierung.
- Die unspezifische Antikörperbindung an den Fc-Rezeptor zu blockieren, indem hinzufügen Maus Fc-Block (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis.
- Führen Sie Antikörper Färbung sowie FMO und Single-Fleck Kontrollen11,25. Bewerten die Lunge Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Durchflusszytometrie Analyse durch Analyse Software.
- Art-AMs durch einen Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) direkt in 1 mL Maus bin Kulturmedium beim AMs für Kultur in Vitro oder in Vivo bestimmt sind Zelle übertragen. Sortieren Sie alternativ AMs in 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol für RNA-Extraktion ergänzt.
3. Isolierung des AMs aus menschlichen BAL-Flüssigkeit
- Übertragung der menschlichen BAL-Flüssigkeit aus der Klinik an das Labor bei 4 ° c zu vereinbaren
- Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit (10-50 mL) bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten. Die Zelle Pellet enthält BAL Zellen11.
- Waschen Sie die Pellets mit 20 mL Waschpuffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 2 mM EDTA) und Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
- Aufschwemmen der BAL-Zellen in 100 μL sind der Strömung/Sortierung Puffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).
- Die unspezifische Antikörperbindung an den Fc-Rezeptor durch Hinzufügen von menschlichen Fc Block (Klon Fc1.3070, 25 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf dem Eis zu blockieren.
- Führen Sie Antikörper Färbung sowie FMO und Single-Fleck Kontrollen11,24. Bewerten die BAL Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Durchflusszytometrie Analyse durch Analyse Software.
- Art-AMs durch einen Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt direkt in 1 mL menschlichen AM Kulturmedium oder 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol.
4. in-vitro- Kultur von AMs
- Im Anschluss an die Zellsortierung Ernten der Zellen durch Zentrifugieren bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
- Aufschwemmen Sie menschliche AMs in 1 mL menschlichen AM Kulturmedium [Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) 1640 ergänzt mit 10 % FBS, 20 % 929 Kultur überstand (als eine Quelle von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), 100 U/mL Endkonzentration), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic Säure (HEPES) und 1 X Penicillin/Streptomycin (optional)]. In ähnlicher Weise Aufschwemmen Sie Maus AMs in 1 mL Maus AM Kulturmedium [DMEM mit 10 % FBS, 20 % 929 Kultur überstand (als Quelle für M-CSF, 100 U/mL Endkonzentration), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM HEPES und 1 X Penicillin/Streptomycin (optional ergänzt )].
- Aufzählen der Trypan blau-lebensfähige Zellen durch einen Zelle Zähler und passen Sie die tragfähige Zellkonzentration auf 1 x 106/mL.
Hinweis: Im Idealfall kann bis zu 5 x 105 AMs isoliert von BAL-Flüssigkeit, die aus einer 8-10 Wochen alte C57BL/6 männliche Maus gesammelt werden. AM Ertrag aus dem Maus-Lunge-Digest kann ist variabel und etwas weniger als die der Maus BAL-Flüssigkeit. AM Ertrag aus menschlichen BAL-Flüssigkeit hängt vom Volumen der BAL-Flüssigkeit, das Gesamtvolumen der Saline in der Lavage und klinischen Zustand des Patienten verwendet. - Basierend auf den Ertrag und die experimentelle Notwendigkeit, Samen der Zellen in Kammer Folien, Kultur-Gerichte oder Kulturflaschen. Im Idealfall Samen Sie das AMs auf 1 x 10-5-/mL mit 10 mL Medium in einem T25 Gewebekultur Kolben.
- Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator von 37 ° C mit 5 % CO2 Atmosphäre.
Hinweis: AMs wird als adhärente Zellen wachsen und sind extrem langsamwüchsig (Verdopplungszeit > 7 Tage). - 24 Stunden nach Aussaat, AMs sollte sein Anhänger und wird nicht durch einen sanften Wechsel des Kulturmediums abgenommen werden. Entfernen Sie das Medium durch Absaugen von einem Ende und Auffüllen mit frischem Medium auf 37 ° c vorgewärmt
Hinweis: Die Zellen können jetzt verwendet werden, AM Physiologie oder die Auswirkungen von Reizen zu beurteilen. AMs gewachsen in Kammer Folien können auch bequem mit entsprechenden Antikörpern gebeizt und sind ideal für mikroskopische Visualisierung. Für Flow durchflusszytometrischen Bewertung geerntet AMs durch Inkubation mit nicht-enzymatische Zelle abkoppelt Lösung. - Das Kulturmedium abgesaugt und fügen Trennendem Lösung genug zur Abdeckung der Kultur (ca. 2 mL pro T25 Kolben) und ca. 5-10 Minuten bei 37 ° C inkubieren. Kein kratzen wird notwendig sein, und es wird nicht empfohlen, die Zellen mechanisch zu kratzen. Klopfen Sie leicht die Seiten, fügen Sie 1-2 mL Flow/Sortierung Puffer und pipette vorsichtig rauf und runter um die Mehrheit der adhärenten Zellen zu lösen.
- Für RNA-Studien lyse der Zellen in der Kulturschale direkt durch Zugabe von Lysis Puffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der Fluss durchflusszytometrischen Ansatz, Maus AMs zu identifizieren ist in Abbildung 1dargestellt. Dazu gehört die Analyse der einen minimalen Satz von oberflächenmarker notwendig in AMs von anderen Lunge-Resident oder Lunge infiltrieren Fresszellen zu unterscheiden. Differenzialanalyse muss eindeutig identifizieren AMs aus interstitielle Makrophagen, Dendritische Zellen, Neutrophilen, Monozyten und Monocyte abgeleitet pulmonaler Makrophagen, die in der Lunge auftreten. Das folgende Schema der oberflächenmarker kann eingesetzt werden, um leicht unterscheiden diese Zelltypen voneinander wo AMs CD45 sind+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+,-Ab + /F4/80-, CD11b- ; Interstitielle Makrophagen sind CD45+, CD11b+,-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Dendritische Zellen sind CD45+, CD11b+, CD11c+,-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Dendritische Zellen sind CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+,-Ab +, CD11b-; Plasmazytoide Dendritic Zellen sind CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+,-Ab-, neutrophile sind CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab -Ly - 6 C–und Monozyten sind CD45+, CD64+ /-, Ly - 6 C+ /-Ab -. Die AM Populationen in rot (CD11cHallo und Siglec-FHallo) und Blaugrün (CD11cHallo, Siglec-FInt) bzw. hervorgehoben darstellen konventionellen AMs (Ballungszentren) und pulmonaler Makrophagen Monocyte abgeleitet ( kleinere Bevölkerung), die in den alveolären Raum auftreten. Sortierung von CD45 fließen+, CD11cHallo, Siglec-FHallo Zellen Erträge gereinigten Maus AMs. Abbildung 2 veranschaulicht Zelle oberflächenmarker notwendig für eine genaue Identifizierung und Isolierung von menschlichen AMs. Die menschliche AMs sind positiv identifiziert als CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, und CD206+ BAL Zellen und Informationsfluss für downstream-Anwendungen sortiert werden können.
Abbildung 1 : Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse der Maus AMs. (A) anatomische Lage des AMs in einem Maus-Lunge-Gewebe-Abschnitt (Hämatoxylin und Eosin). AMs sind mit Pfeilen gekennzeichnet und der Maßstab ist 60 μm. (B) repräsentative Durchflusszytometrie Anspritzung Strategie zur Maus AMs in BAL Zellen zu identifizieren. Proben wurden von einer Zelle Analyzer bewertet und Daten wurden nach unten abgetastet, 500 Veranstaltungen zum Vergleich durch die Analysesoftware. Rot (CD11cHallo und Siglec-FHallo) und Blaugrün (CD11cHallo, Siglec-FInt) sind bzw. konventionelle AMs (Ballungszentren) und Monocyte-abgeleitete pulmonaler Makrophagen (kleinere Bevölkerung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse der menschlichen AMs. (A) Gating Strategie um menschliche AMs von BAL-Flüssigkeit aus einer menschlichen Lunge transplantempfänger zu identifizieren. (B) Hellfeld Schliffbild des menschlichen AMs an sieben Tage der Kultur. Der Maßstab ist 400 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMs sind langlebige Lunge ansässige Makrophagen, die die Lunge beginnt bei der Geburt und dauerhaft über die gesamte Lebensdauer26bevölkern. Ihre Rollen in pulmonalen Physiologie7 und Pathologie12 und ihr Potenzial zur pulmonalen Autoimmunität24 Vorhersagen wurden erkannt. Da AMs eine langfristige Präsenz in der Lunge11,27 haben und Aktivierung und Fortschreiten der Immunantworten11,24, ihre Rolle(n) in andere chronische entzündliche und fibrotische Lunge beteiligt sind Krankheiten müssen ausgewertet werden. Historisch, AMs hatte eine verwirrende Identität und wurden häufig misidentified. Mit kürzlich verabschiedeten phänotypische Markierungen25,28ist es jetzt möglich, Menschen zu unterscheiden und Maus AMs von anderen pulmonalen Fresszellen (z. B. interstitielle Makrophagen, pulmonale dendritischen Zellen und monocyte Pulmonale Makrophagen abgeleitet). Die hier beschriebenen Methoden sind für die Isolierung und für in-vitro- Kultur von Maus und Mensch AMs optimiert worden. Obwohl diese Protokolle im großen und ganzen für AMs artfremder angenommen werden können, sollten entsprechende phänotypischen Entschlossenheit durchgeführt werden, um "minimal erforderliche" oberflächenmarker für gründliche Charakterisierung festgelegt werden.
Zur Isolierung der murinen AMs durch Lavage Einbeziehung von chelatisierenden Agent (d.h., EDTA) und Pre-Kühlung des BAL-Puffers erwiesen sich in der aktuellen Studie wichtig. Da AMs sind Anhänger der alveolären Wand, Verwendung von PBS allein war wirkungslos in den Zellen verdrängen und erzeugt eine deutlich niedrigere Rendite. Sicherung der Installation des Katheters in die Luftröhre ist ein weiterer wichtiger Schritt. Darauf sollte geachtet werden, eine auslaufsichere Befestigung zu gewährleisten, die BAL Flüssigkeitsverlust minimiert. Besondere Vorsicht ist erforderlich beim Lavaging eine jüngere Maus (< 6 Wochen alt), da die strukturellen Zartheit der Luftröhre zu reißen oder Leckage während Lavage führen kann. Installation von zwei aufeinander folgenden nicht überlappenden Nähte oft sorgt für eine sichere Befestigung des Katheters und verhindert Lecks. Obwohl nicht-enzymatische Dissoziation (zB., mit einem Chelator ergänzt-Puffer) war nur AM Isolation in dieser Studie durchgeführt, ist es möglich, dass enzymatische Dissoziation mit Kollagenase während Lunge Lavage eine bessere Ausbeute AM produzieren kann.
Die Ausbeute an menschlichen AM BAL-Flüssigkeit ist variabel. AMs bilden fast 10 % aller BAL-Zellen aus menschlichen Lunge Transplantationspatienten Norton Brust-Institut während der Routine nach Lungentransplantation Weiterverfolgung gesammelt, und die Gesamtausbeute Uhr ist abhängig von mehreren Variablen. Solche Variablen umfassen klinische Zustand des Patienten, das Volumen der Saline in Lavage verwendet und das Volumen der BAL-Flüssigkeit AM Isolation verarbeitet. Pre-Lavage Verfahren (z. B. Nadel Biopsien), die zu Microhemorrhage führen verändern die zelluläre Zusammensetzung der BAL Zellen; Dennoch ermöglicht die Implementierung von phänotypischen Marker für eine eindeutige Erkennung und Charakterisierung von den menschlichen AM Pool (Abbildung 2).
Verwendung von 929 Klimaanlage Medium (eine Quelle von M-CSF) war notwendig für die in-vitro- Wartung des AMs. Es ist unsere Überzeugung, dass eine Supplementierung von gereinigtem M-CSF würde ausreichen, um nachhaltig das AMs in Kultur; Allerdings muss eine optimierte Konzentration ausgearbeitet werden für Mensch und Maus-AMs. Die kultivierten Zellen können für Studien über Endozytose, Reaktion auf Entzündungen, Antigenpräsentation, Reifung/Aktivierungsstatus oder anderen Assays, die Wartung von lebenden Zellen für ein Zeitverlauf Analyse11,24 erfordert verwendet . Im Rahmen dieser Studie, es wurde nicht versucht, AMs als eine ständig kultivierten Linie und terminal Kurzzeitstudien pflegen (< 30 Tage seit der Ernte) wurden durchgeführt. Daher ist eine offensichtliche Einschränkung dieser Methode Mangel eine Langzeitdaten Kultur, vor allem auf die Stabilität der Zellen (d. h. ob AMs wachsen können, als eine endliche oder kontinuierliche Linie, die Antwort von AMs auf Kryoprotektanten und Kryokonservierung, und phänotypischen und/oder genotypischen Drift) nach laufenden Kultur. AMs sind lang lebende Zellen in vivo und ein gewisses Maß an Variation zwischen den Zellen isoliert von gesunde Lungen und von denen eine Infektion der Atemwege oder entzündliche/autoimmune Antworten erwartet.
Alles in allem, die Methode hier vorgestellten Dokumente einen vereinfachten Ansatz zur Isolierung, Charakterisierung, und menschliche Pflege und Maus AMs in einem Zellkultursystem. Obwohl dieses Protokoll weiter optimiert werden kann, je nach Bedarf experimentelle kann es als ein Anfänger-Protokoll, die funktionelle Relevanz des AMs in Erkrankungen der Atemwege und Lungen Medizin zu zergliedern dienen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts Clare Prendergast. Sicherheitsanweisungen wird unterstützt durch eine Forschung gewähren (#2095) von der Stiftung Flinn und TM wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01HL056643 und R01HL092514). Sicherheitsanweisungen der Methoden entwickelt, die Studie konzipiert und schrieb das Manuskript; OM mit Tierversuchen und klinischen Probe Beschaffung unterstützt; SB mit durchflusszytometrischen Analyse und Zellsortierung unterstützt; TM die Studien überwacht und überprüft das Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
