Summary
Detta meddelande beskriver metoder för isolering och kultur av alveolära makrofager från människor och murina modeller i experimentsyfte.
Abstract
Alveolära makrofager är terminalt differentierade, lung-bosatta makrofager av prenatal ursprung. Alveolära makrofager är unika i sitt långa liv och deras viktiga roll i lungans utveckling och funktion, samt deras lung-lokaliserad svar på infektion och inflammation. Hittills finns ingen enhetlig metod för identifiering, isolering och hantering av alveolära makrofager från människor och möss. Sådan metod behövs för studier på dessa viktiga innate immuna celler i olika experimentella inställningar. Den metod som beskrivs här, som lätt kan antas av alla laboratorier, är en förenklad metod att skörda alveolära makrofager från bronkoalveolär lavage vätska eller lungvävnad och underhålla dem in vitro. Eftersom alveolära makrofager uppstå primärt som vidhäftande celler i alveolerna, fokuserar denna metod på lossnar dem före skörd och identifiering. Lungan är en högt vaskulariserad organ och olika celltyper med myeloiska och lymfoida ursprung bebor, interagera och påverkas av den lung mikromiljö. Genom att använda uppsättningen ytmarkörer som beskrivs här, kan forskare enkelt och entydigt skilja alveolära makrofager från andra leukocyter, och rena dem för nedströms tillämpningar. Metoden kultur framkallade häri stöder både mänskliga och mus alveolära makrofager för in vitro tillväxt, och är kompatibel med cellulära och molekylära studier.
Introduction
Den lung närmiljön är ett unikt komplexa ekosystem med en genomarbetad luft conduit och kärlsystemet. Inandningsluften färdas genom luftstrupen och många grenar bronker och bronkioler innan den når alveolerna, där blod-air gasutbyte sker. På grund av direkt interaktion med atmosfären kräver respiratoriska ytan skydd från de potentiellt skadliga effekterna av luftburna partiklar och föroreningar. Ett antal fysiska, kemiska och immunologiska barriärer skydda lungorna. Särskilt, serverar distribution av fagocyter vid respiratoriska ytan en viktig första linjens försvarssystem. Alveolära makrofager (AMs) är en typ av lungcancer är boförälder fagocyter, och de utgör majoriteten av lung makrofag poolen. Som namnet antyder, AMs är främst lokaliserade till alveolära lumen och förekomma som fastsittande celler som ständigt prova den omgivande atmosfären och kommunicera med den alveolära epitel1. I steady-state lungorna är mer än 95% av fagocyter i alveolära utrymmet AMs2, vars sammansättning kan förändra på grund av inflammation, infektion eller kronisk exponering för föroreningar.
AMs delta i ett brett utbud av funktioner som kan vara lokalt för lungorna och/eller systemvikt. Till exempel är AMs väsentliga för utvecklingen och en optimalt fungerande lungor; immun övervakning. och clearance av cellulära skräp, invaderande patogener och inhalerade partiklar3,4,5,6,7. Riktade utarmning av AMs är känt för att försämra clearance av respiratoriska virus och bakterier4,8. Förutom sin roll som fagocyter och en första linjens försvarare av pulmonell homeostas, AMs är kända att fungera som antigen-presenterande celler i framkalla T cell immunitet9, potentierande effekten av intranasalt vaccin10 och påverka lung-begränsad autoimmunitet efter lung transplantation11,12. Brist i AM funktion har kopplats till pulmonell alveolär proteinosis (PAP), ett tillstånd som följd av en genetisk mutation, malignitet eller infektion som försämrar clearance av pulmonell tensider13,14. Transplantation av AMs är nu utforskas som en terapeutisk metod för behandling av PAP 15,16.
AMs är kända för sitt ursprung under embryogenes och kvarstå i lungorna under hela livet utan att ersättas av cirkulerande leukocyter2,17. Även AM omsättning är omätbara i homeostatiska lungor, har varierande nivåer av AM omsättning rapporterats i vissa kliniska tillstånd inklusive infektion av influensa virus4, myeloablativ bestrålning18, exponering för endotoxin 19och ålderdom20. AMs tros själv förnya via en låggradig spridning17,21, men några nyligen gjorda studier hävdar att monocyter kan ge upphov till en befolkning av intravaskulär lung makrofager22,23 under experimentella förhållanden, men funktionaliteten i dessa nyligen konverterade pulmonell makrofager har ännu inte definieras i lungsjukdomar. Dessutom förstå tröskeln till stimulans i samband med AM aktivering är ett potentiellt intressant område, som lungorna försöker bevara en equilibrium mellan de inflammatoriska signalerna och immunoregulatoriska maskiner.
De fysiologiska eller patologiska förändringar som leder till förlust av immunreglering är viktigt att utvärdera i olika kliniska inställningar (t.ex. luftvägsinfektioner, inflammatorisk lungsjukdom och fibrotiska lungsjukdom). AMs redovisas dock alltmer som indikatorer eller ens bestämningsfaktorerna för pulmonell hälsa11,24. För närvarande finns det inga enhetliga protokoll som är tillgängliga för skörd, karakterisera eller upprätthålla AMs från människor och prekliniska murina modeller. Bristen på samförstånd om AM prekursorer och fenotyper och avsaknad av en detaljerad metod hade varit den stora vägspärren i dechiffrera roller för AM i pulmonell hälsa och sjukdom. Följande protokoll erbjuder en slutgiltig identifiering, isolering och in vitro- kultur strategi som kraftigt kommer att främja förståelsen av AM beteende och underlätta AM-riktade diagnostiska och terapeutiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC) och den institutionella granskning Board (IRB) på St Joseph's Hospital och Medical Center.
1. isolering av AMs från murina bronkoalveolär Lavage (BAL) vätska
- Bedöva en åtta veckor gamla C57BL/6 mus med ketamin (87,5 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (12,5 mg/kg kroppsvikt) cocktail via en intraperitoneal injektion. Fortsätt när musen uppnår kirurgisk anestesi med förlust av reflexer och muskelavslappning.
- Placera musen på en dissektion yta med den ventrala sidan uppåt. Applicera oftalmologiska vet salva på ögonen för att förhindra uttorkning och torka hela ventrala ytan av mus med steril alkohol prep pads mättad med 70% isopropanol att desinficera.
- Montera musen med alla fyra benen fastspända.
- Öppna försiktigt bukhålan med mikro dissektion verktyg. Var noga med att öppna så mycket område som möjligt utan att skada någon viscerala organ eller skapa överhängande vävnad.
- Öppna försiktigt brösthålan av långsamt öppning av bröstkorgen genom mediastinum. Idealiskt, revbenen kan vara censurerade från sida till sida. Extrem försiktighet måste iakttas för att inte skada lungsäcken i lungorna när du öppnar brösthålan.
- Leta upp den sämre vena cava och gör ett snitt att blöda musen. Använd absorberande bomullsrondeller för att suga upp blod.
- Injicera 10 mL iskallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i höger kammare (med 10 mL doseringsspruta och 25G nål) för att spola cirkulerande blodkroppar. Absorbera blodflödet med absorberande bomullsrondeller. När helt perfusion, lungorna visas blancherade och är sedan redo för lavage.
- Försiktigt skära öppna huden och muskel i nacken att utsätta luftvägarna. Noggrant punktskatt den angränsande muskler, brosk och fett vävnader utan att skada luftstrupen.
- Göra ett litet snitt (< 2 mm) på luftstrupen bakre till struphuvudet. Detta snitt bör vara precis tillräckligt för att infoga en kateter in i samtidigt luftstrupen är knuten till struphuvudet. Sätt en 1-tums 22G kateter utan nål i luftstrupen till lungorna. Säkra katetern med en siden flätad sutur (4-0; icke-absorberbara) med en square knut.
Obs: Katetern behöver trimmas baserat på mus storlek. Extremt kort eller lång katetrar tenderar att läcka eller riva luftvägarna under lavage. Kateterns längd bör vara sådan att när ordentligt tip resterna väl inom luftstrupen och inte nå den primära bronker. - Bifoga en 1 mL spruta fylld med iskall BAL-buffert (Ca2 + och Mg2 + gratis PBS + 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt, EDTA) till katetern och långsamt ingjuta bufferten i lungorna. Detta kommer att blåsa i lungorna. Förvara sprutan fästs katetern i fem sekunder och sedan aspirera lavage vätskan genom att försiktigt dra kolven. Detta kommer att tömma lungorna. Samla in vätskan i en 15 mL konisk slang placeras på is.
- Upprepa steg 1.10 för nio gånger och pool lavage vätskan. Överskrid inte 1 mL buffert per flush, som kan överstiga lungkapacitet och leda till dess bristning.
- Avliva musen med CO2 överdos av IACUC godkända protokoll.
- Centrifugera i 10 mL BAL vätska vid 250 x g vid 4 ° C i 10 minuter. Cellpelleten innehåller BAL celler.
Varning: Pelleten kan vara mycket små, så var försiktig när Aspirera supernatanten. - Att resuspendera cellerna BAL i 100 μL av flöde/sortering buffert (PBS + 2% värme inaktiverat fetalt bovint serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic syra (HEPES)).
- Blockera ospecifik antikropp bindningen till Fc receptor genom att lägga till mus Fc block (klona 2.4G2, 10 μg/mL) och ruvar i 20 minuter på isen.
- Utföra antikropp färgning tillsammans med fluorescens minus en (FMO) och single-fläcken kontrollerar11,25. Utvärdera BAL celler av en cell analyzer (se Tabell för material) följt av encelliga flödescytometri Flödesanalys av lämplig analysprogramvara (se Tabell för material).
- Isolera AMs av fluorescens-aktiverad cell sorterare (se Tabell för material) direkt in 1 mL musen är odlingsmedium när AMs är avsedda för in vitro kultur eller i vivo cell överföring. Sortera AMs i 1 mL lyseringsbuffert (se Tabell för material) alternativt kompletteras med 10 μl/mL β-merkaptoetanol för RNA-extraktion.
2. isolering av AMs från mus Lung, Single-cell Suspension
- Bedöva en åtta veckor gamla C57BL/6 mus med ketamin (87,5 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (12,5 mg/kg kroppsvikt) cocktail via en intraperitoneal injektion. Fortsätt när musen uppnår kirurgisk anestesi med förlust av reflexer och muskelavslappning.
- Placera musen på en dissektion yta med den ventrala sidan uppåt. Applicera oftalmologiska vet salva på ögonen för att förhindra uttorkning och torka hela ventrala ytan av mus med steril alkohol pads mättad med 70% isopropanol att desinficera.
- Montera musen med alla fyra benen fastspända.
- Öppna försiktigt bukhålan med mikro dissektion verktyg. Var noga med att öppna så mycket område som möjligt utan att skada någon viscerala organ eller skapa överhängande vävnad.
- Öppna försiktigt brösthålan av långsamt öppning av bröstkorgen genom mediastinum. Idealiskt, revbenen kan vara censurerade från sida till sida. Extrem försiktighet måste iakttas för att inte skada lungsäcken i lungorna när du öppnar brösthålan.
- Leta upp den sämre vena cava och gör ett snitt att blöda musen. Använd absorberande bomullsrondeller för att suga upp blod.
- Injicera 10 mL iskallt PBS i höger kammare (med 10 mL doseringsspruta och 25G nål) för att spola cirkulerande blodkroppar. När helt perfusion, lungorna visas blancherade och är redo för skörd.
- Dissekera ut lungorna av severing luftstrupe, blodkärl och ligament i en 15 mL koniska rör med 5 mL kallt Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM). Behålla det på is tills nästa steg.
- Avliva musen med CO2 överdos av IACUC godkända protokoll.
- Över perfunderade lungorna till en steril och pyrogenfri 60 mm kultur maträtt med 3 mL DMEM. Med hjälp av dissekera pincett retas sig luftvägarna och andra hårda icke-lungvävnad material, om den finns. Finhacka lungvävnaden med en skalpell till < 1 mm storlek.
- Tillsätt 300 µg/mL Liberase TL och 5 U/mL DNase, blanda genom pipettering och inkubera vid 37° C i en inkubator i 25 minuter. Blanda försiktigt en gång av pipettering efter 10 minuter.
- Passera en 100 µm cell SIL installerad på en 50 mL konisk tub dissocierade lungorna. Använd baksidan av en kolv från 1 mL spruta för att mosa upp cell klumpar på filtret. Tvätta filtret med 20 mL tvättbuffert (PBS + 2% värme inaktiverade FBS + 2 mM EDTA).
- Centrifugera 500 x g vid 4 ° C i 5 minuter. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 20 mL tvättbuffert.
- Upprepa steg 2.12 och 2.13 två gånger, ändra filter och röret varje gång. Före blötläggning filtret i tvättbuffert för mer än fem minuter ökar AM avkastningen. Bereda encelliga suspension genom att tillsätta 100 μL flöde/sortering buffert till cellpelleten.
- Blockera ospecifik antikropp bindningen till Fc receptor genom att lägga till mus Fc block (klona 2.4G2, 10 μg/mL) och ruvar i 20 minuter på isen.
- Utföra antikropp färgning tillsammans med FMO och singel-fläcken kontroller11,25. Utvärdera lungan celler av en cell analyzer (se Tabell för material) följt av encelliga flödescytometri analys av analys programvara.
- Sortera AMs av en cell-sorter (se Tabell för material) direkt in 1 mL musen är odlingsmedium när AMs är avsedda för in vitro kultur eller i vivo cell överföring. Du kan också sortera AMs i 1 mL lyseringsbuffert kompletteras med 10 μl/mL β-merkaptoetanol för RNA-extraktion.
3. isolering av AMs från mänskliga BAL vätska
- Ordna transfer av mänskliga BAL vätska från kliniken till laboratoriet vid 4 ° C.
- Centrifugera BAL vätskan (10-50 mL) 250 x g vid 4 ° C i 10 minuter. Cellpelleten innehåller BAL celler11.
- Tvätta pelleten med 20 mL tvättbuffert (PBS + 2% värme inaktiverade FBS + 2 mM EDTA) och centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 minuter.
- Återsuspendera cellerna BAL är i 100 μL av flöde/sortering buffert (PBS + 2% värme inaktiverade FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).
- Blockera ospecifik antikropp bindningen till Fc receptor genom att lägga mänskliga Fc block (klon Fc1.3070, 25 μg/mL) och ruvar i 20 minuter på isen.
- Utföra antikropp färgning tillsammans med FMO och singel-fläcken kontroller11,24. Utvärdera BAL celler av en cell analyzer (se Tabell för material) följt av encelliga flödescytometri analys av analys programvara.
- Sortera AMs av en cell sorterare (se Tabell för material) direkt in i 1 mL humant AM odlingsmedium eller 1 mL lyseringsbuffert kompletteras med 10 μl/mL β-merkaptoetanol.
4. in vitro kultur av AMs
- Efter cell sortering, skörda cellerna genom centrifugering vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min.
- Återsuspendera mänskliga AMs i 1 mL humant AM odlingsmedium [Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 kompletteras med 10% FBS, 20% L-929 kultur supernatant (som en källa av makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF), 100 U/mL koncentration), 1 mM natrium pyruvat, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic syra (HEPES) och 1 x penicillin/streptomycin (tillval)]. Likaså Omsuspendera mus AMs i 1 mL mus AM odlingsmedium [DMEM kompletteras med 10% FBS, 20% L-929 kultur supernatant (som en källa till M-CSF, 100 U/mL koncentration), 1 mM natrium pyruvat, 10 mM HEPES och 1 x penicillin/streptomycin (tillval )].
- Räkna upp de trypan blå-exklusive viabla cellerna i en cell-disk och justera livskraftig cellkoncentrationen på6/1 x 10 ml.
Obs: Helst upp till 5 x 105 AMs kan isoleras från BAL-vätska som samlas in från en 8-10 vecka gammal C57BL/6 manliga mus. AM avkastningen från mus lung digest är variabel och kan vara något mindre än mus BAL-vätska. AM avkastning från mänskliga BAL vätska beror på volymen av BAL vätska, den totala mängden saltlösning används i lavage och patientens kliniska tillstånd. - Baserat på avkastning och experimentella nödvändighet, utsäde cellerna i kammaren diabilder, kultur rätter eller kultur kolvar. Idealiskt, utsäde AMs på 1 x 105/ml med 10 mL medium i en T25 vävnadsodling kolv.
- Inkubera cellerna i en 37 ° C befuktade inkubator med 5% CO2 atmosfär.
Obs: AMs kommer att växa som vidhäftande celler och växer mycket långsamt (fördubbling tid > 7 dagar). - 24 timmar efter sådd, AMs bör vara anhängare och kommer inte tas bort av en varsam förändring av odlingsmedium. Ta bort mediet genom aspiration från ena änden och fylla på med färskt medium pre värmas till 37 ° C.
Obs: Cellerna kan nu användas för att bedöma AM fysiologi eller effekterna av stimuli. AMs odlas i kammaren diabilder bekvämt kan färgas med lämpliga antikroppar och är idealiska för mikroskopiska visualisering. För flöde flödescytometrisk utvärdering skördas AMs genom inkubation med icke-enzymatiska cell separera lösning. - Sug ut odlingsmediet och lägga till separera lösning nog att täcka kultur ytan (ca 2 mL per T25 kolv) och inkubera vid 37 ° C i 5-10 minuter. Ingen skrapning blir nödvändigt, och det rekommenderas inte att skrapa cellerna mekaniskt. Knacka försiktigt på sidorna, tillsätt 1-2 mL flöde/sortering buffert och Pipettera försiktigt upp och ned för att lossa flertalet vidhäftande celler.
- För RNA studier, lyse celler direkt kultur skålen genom att lägga till lyseringsbuffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den flöde flödescytometrisk metoden att identifiera musen AMs visas i figur 1. Detta inkluderar analys av en minimiuppsättning av ytmarkörer nödvändigt skilja AMs från andra lung-bosatt eller lung-infiltrera fagocyter. Differentierad analys krävs för att identifiera AMs från interstitiell makrofager, dendritiska celler, neutrofiler, monocyter och monocyt-derived pulmonell makrofager som förekommer i lungorna. Följande schema av yta markörer kan användas för att lätt skilja dessa celltyper från varandra där AMs är CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+, I-Ab +/-, F4/80-, CD11b- ; Interstitiell makrofager är CD45+, CD11b+, I-Ab +, CD64+, CD24-, CD11b + Dendritiska celler är CD45+, CD11b+, CD11c+, I-Ab +, CD24+, CD64-, CD103 + Dendritiska celler är CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+, I-Ab +, CD11b-, Dess Dendritic celler är CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+, I-Ab -, neutrofiler är CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- , I-Ab -Ly - 6 C–och monocyter är CD45+, CD64+/-, Ly - 6 C+ /-, I-Ab -. AM befolkningen markeras i rött (CD11cHej och Siglec-FHej) och kricka (CD11cHej, Siglec-Fint), respektive representera konventionella AMs (större befolkning) och monocyt-derived pulmonell makrofager ( smärre befolkningen) som förekommer i det alveolära utrymmet. Flow sortering av CD45+, CD11cHej, Siglec-FHej celler avkastning renad mus AMs. Figur 2 illustrerar cell yta markörer behövs för en exakt identifiering och isolering av mänskliga AMs. De mänskliga AMs identifieras positivt för att vara CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, och CD206+ BAL celler, och kan vara flöde sorterade för nedströms tillämpningar.
Figur 1 : Representativa flöde flödescytometrisk analys av mus AMs. (A) anatomiska läge av AMs i ett mus lunga vävnad avsnitt (hematoxylin och eosin). AMs anges med pilar och skalstapeln är 60 μm. (B) representativa flödescytometri gating strategi för att identifiera musen AMs i BAL celler. Prover utvärderades av en cell analyzer och data var ner ingick i urvalet till 500 evenemang för jämförelse av programvaran analys. Röd (CD11cHej och Siglec-FHej) och kricka (CD11cHej, Siglec-Fint), respektive är konventionella AMs (större befolkning) och monocyt-derived pulmonell makrofager (mindre befolkning). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa flöde flödescytometrisk analys av mänskliga AMs. (A) Gating strategi för att identifiera mänskliga AMs från BAL vätska från en mänsklig lung transplantation mottagare. (B) ljusa fält Mikrograf av mänskliga AMs på sju dagar av kultur. Skalstapeln är 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMs är långlivade lung-bosatta makrofager som befolkar lungorna börjar vid födseln och bestående över den hela livslängd26. Deras roller i pulmonell fysiologi7 och patologi12 och deras potential att förutsäga pulmonell autoimmunitet24 har erkänts. Eftersom AMs har en långsiktig närvaro i lungorna11,27 och eftersom de är inblandade i aktiveringen och progression av immunsvar11,24, deras roller i andra kroniska inflammatoriska och fibrotiska lung sjukdomar måste utvärderas. Historiskt, AMs hade en förvirrad identitet och var ofta feltolkat. Med nyligen antagna fenotypiska markörer25,28är det nu möjligt att särskilja mänskliga och musen AMs från andra pulmonell fagocyter (t.ex. interstitiell makrofager, pulmonell dendritiska celler och monocyt härledd pulmonell makrofager). Metoderna som beskrivs här har optimerats för isolering och för in vitro- kultur av mus och mänskliga AMs. Även om dessa protokoll kan antas i stort sett för AMs från andra arter, bör lämplig fenotypiska bestämning utföras för att fastställa en uppsättning ”minimalt krävs” yta markörer för noggrann karakterisering.
För isolering av murina AMs av lavage, införandet av kelatbildare (dvsEDTA) och före kylning BAL bufferten befanns vara viktigt i den aktuella studien. Eftersom AMs är anhängare till den alveolära väggen, användning av PBS ensam var ineffektiva i lossnar celler och producerade en betydligt lägre avkastning. Säkra installation av katetern till luftstrupen är ett annat viktigt steg. Att säkerställa en läckagesäker bifogad som minimerar förlust av BAL vätska bör du vara försiktig. Extra försiktighet krävs samtidigt lavaging en yngre mus (< 6 veckor gamla), eftersom den strukturella delikatessen av luftstrupen kan resultera i sönder eller läckage under lavage. Installera två på varandra följande icke-överlappande suturer ofta säkerställer en säker fastsättning av katetern och förhindrar läckage. Även om icke-enzymatiska dissociation (dvs., med kelator kompletteras buffert) var endast utföras AM isolering i denna studie, är det möjligt att enzymatisk dissociation med kollagenas under lung magsköljning kan producera bättre AM avkastning.
Avkastningen av mänskliga AM från BAL vätska är variabel. AMs utgör nästan 10% av alla BAL celler samlas in från human lung transplantation mottagare på Norton bröst Institutet under rutinmässiga efter lungtransplantation uppföljning, och den totala AM avkastningen är beroende av flera variabler. Sådana variabler inkluderar patientens kliniska tillstånd, volymen av saltlösning används i lavage och volymen av BAL vätska bearbetas för AM isolering. Före lavage förfaranden (t.ex. nålen biopsier) som resulterar i microhemorrhage ändra cellulära sammansättningen av BAL celler; dock tillåter genomförandet av fenotypiska markörer för en entydig identifiering och karakterisering av mänskliga AM poolen (figur 2).
Användning av L-929 luftkonditionering medium (en källa av M-CSF) var nödvändigt för in vitro- underhåll av AMs. Det är vår övertygelse att tillskott av renat M-CSF skulle vara tillräcklig för att upprätthålla AMs i kultur; en optimerad koncentration måste dock utarbetas för både mänskliga och musen AMs. Den odlade celler kan användas för studier på endocytos, svar på inflammation, antigen-presentation, mognad/aktiveringsstatus eller någon annan analysmetod som kräver underhåll av levande celler för en tid-kursen analys11,24 . Under loppet av denna studie, var det inte försökte upprätthålla AMs som ett kontinuerligt odlade linje och endast terminal korttidsstudier (< 30 dagar sen skörd) utfördes. En uppenbar begränsning med denna metod är därför saknas ett långsiktigt kultur, särskilt på stabiliteten i cellerna (dvs. om AMs kan växa som en ändlig eller kontinuerlig linje, AMs svar på cryoprotectants och frysförvaring, och fenotypiska och genotypiska drift) efter pågående kultur. AMs är långa levande celler in vivo och viss grad av variation förväntas mellan celler isolerade från friska lungor och från dem som genomgår luftvägsinfektion eller inflammatoriska/autoimmuna svar.
Sammantaget presenteras metoden här dokument en förenklad metod att isolera, karakterisera, och upprätthålla mänskliga och mus AMs i ett cellodlingssystem. Även om detta protokoll kan optimeras ytterligare baserat på individuella experimentella behov, kan det tjäna som en nybörjares protokoll att dissekera den funktionella betydelsen av AMs i luftvägssjukdomar och lungmedicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Clare Prendergast för hjälp med redigering manuskriptet. DKN stöds av en forskning ger (nr 2095) från stiftelsen Flinn och TM stöds genom bidrag från National Institutes of Health (R01HL056643 och R01HL092514). DKN utvecklat metoder, designat studien och skrev manuskriptet; OM bistod med djurstudier och kliniska prov upphandling. SB bistod med flöde flödescytometrisk analys och cell sortering; TM övervakade studierna och granskade manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
