Summary
La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.
Abstract
I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all'infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l'identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.
Introduction
Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell'aria elaborata e sistema vascolare. L'aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l'atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi alveolari (ma) sono un tipo di polmone-residente fagociti, e che costituiscono la stragrande maggioranza della piscina del macrofago polmonare. Come suggerisce il nome, AMs sono principalmente localizzati al lume del alveolare e si presentano come cellule sessile che costantemente assaggiare l'atmosfera ambiente e comunicano con l' epitelio alveolare1. In stato stazionario polmoni, oltre il 95% dei fagociti nello spazio alveolare sono AMs2, cui composizione può alterare a causa di infiammazione, infezione o l'esposizione cronica alle sostanze inquinanti.
AMs è partecipare a una vasta gamma di funzioni che possono essere locali ai polmoni e/o di importanza sistemica. Ad esempio, AMs sono essenziali per lo sviluppo e il funzionamento ottimale dei polmoni; sorveglianza immune; e liquidazione dei detriti cellulari, invadendo gli agenti patogeni e particelle inalate3,4,5,6,7. Lo svuotamento mirato di AMs è conosciuto per alterare la clearance del virus respiratori e batteri4,8. Oltre il loro ruolo di fagociti e un difensori di prima linea dell'omeostasi polmonare, AMs sono noti per funzionare come cellule presentanti l'antigene in suscitamento T delle cellule dell'immunità9, rafforza l'efficacia del vaccino intranasale10 e influenzare autoimmunità polmone-limitati dopo trapianto del polmone11,12. Carenza nella funzione di AM è stata collegata a proteinosi alveolare polmonare (PAP), una circostanza derivando da una mutazione genetica, la malignità o l'infezione che altera la clearance di surfattanti polmonari13,14. Trapianto di AMs è ora in fase di studio come un approccio terapeutico per il trattamento di PAP 15,16.
AMs sono noti per provenire durante l'embriogenesi e persistono nei polmoni per tutta la vita senza essere sostituiti facendo circolare i leucociti2,17. Sebbene, fatturato AM è rilevabile nei polmoni omeostatici, diversi livelli di fatturato AM sono stati segnalati in determinate condizioni cliniche compresa l'infezione da influenza virus4, myeloablative irradiazione18, esposizione all'endotossina 19e20di vecchiaia. AMs sono creduti per auto-rinnovarsi tramite un basso grado di proliferazione17,21, ma alcuni studi recenti sostengono che i monociti possono dar luogo ad una popolazione di intravascolare polmonare macrofagi22,23 sotto condizioni sperimentali, ma la funzionalità di questi macrofagi polmonari appena convertiti devono ancora essere definiti nelle malattie polmonari. Inoltre, comprendere la soglia di stimolo nel contesto di attivazione è una zona potenzialmente interessante, come il polmone tenta di mantenere un equilibrio tra segnali infiammatori ed il macchinario immunoregulatory.
Le alterazioni fisiologiche o patologiche che portano alla perdita della regolazione immune sono importanti per valutare in varie regolazioni cliniche (ad es., infezioni respiratorie, malattie infiammatorie polmonari e malattia polmonare fibrotica). Tuttavia, AMs sono sempre più riconosciuti come indicatori o anche determinanti di salute polmonare11,24. Attualmente, non esistono Nessun protocollo unificato disponibile per la raccolta, la caratterizzazione, e/o mantenimento AMs da esseri umani e preclinici modelli murini. Mancanza di un consenso sui precursori AM e fenotipi e l'assenza di una metodologia dettagliata era stato l'ostacolo importante nel decifrare uno o più ruoli di AM in malattia e salute polmonare. Il seguente protocollo offre una definitiva identificazione, isolamento e in vitro cultura strategia che permette di avanzare la comprensione del comportamento di AM e facilitare AM-mirati studi diagnostici e terapeutici.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center.
1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL)
- Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.
- Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con prep tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.
- Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.
- Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.
- Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.
- Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.
- Iniettare 10 mL ghiacciata tamponato fosfato salino (PBS) nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Assorbire il flusso di sangue con tamponi di cotone assorbente. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e quindi sono pronti per il lavaggio.
- Delicatamente tagliare aperto la pelle e muscolo del collo per esporre le vie respiratorie. Asportare con cura i muscoli adiacenti, cartilagini e tessuti grassi senza danneggiare la trachea.
- Praticare una piccola incisione (< 2 mm) sulla trachea posteriore alla laringe. Questa incisione deve essere appena sufficiente per inserire un catetere nella mentre la trachea è ancora attaccata alla laringe. Inserire un catetere 22g 1-inch senza ago nella trachea verso i polmoni. Fissare il catetere con una sutura seta intrecciata (4-0; non assorbibili) con un nodo quadrato.
Nota: Il catetere deve essere tagliata sulla base delle dimensioni del mouse. Cateteri estremamente brevi o lunghi tendono a fuoriuscire e/o strappare le vie respiratorie durante il lavaggio. Lunghezza catetere deve essere tale che, quando inserito completamente i resti di punta ben all'interno della trachea e non raggiungere i bronchi primari. - Attaccare una siringa 1 mL riempita con gelida buffer di BAL (Ca2 + e Mg2 + gratis PBS + 1 mM acido etilendiamminotetracetico, EDTA) per il catetere e infondere lentamente il buffer nei polmoni. Questo si gonfia i polmoni. Tenere la siringa collegata al catetere per cinque secondi e quindi aspirare il fluido di lavaggio tirando delicatamente il pistone. Questo si sgonfierà i polmoni. Raccogliere il liquido in una provetta conica da 15 mL posizionato su ghiaccio.
- Ripetere i passaggio 1.10 per nove volte di più e il fluido di lavaggio della piscina. Non superare 1 mL di tampone per ogni svuotamento, che può superare la capacità polmonare e portare alla sua rottura.
- Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.
- Centrifugare il liquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL.
Attenzione: Il pellet può essere molto piccolo, quindi prestare attenzione quando aspirare il supernatante. - Risospendere le cellule di BAL in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato siero bovino fetale (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM acido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)).
- Bloccare il grippaggio non specifico dell'anticorpo al ricevitore di Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
- Eseguire anticorpo che macchia insieme a fluorescenza meno uno (FMO) e single-macchia controlli11,25. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono dall'analisi di citometria a flusso di cella singola da software di analisi appropriato (Vedi Tabella materiali).
- AMs di isolare da una fluorescenza-attivato delle cellule sorter (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, sorta di AMs in 1 mL di tampone di lisi (Vedi Tabella materiali) completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.
2. isolamento di AMs dal polmone del topo, cella singola sospensione
- Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.
- Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.
- Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.
- Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.
- Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.
- Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.
- Iniettare 10 mL di PBS ghiacciata nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e sono pronti per il raccolto.
- Sezionare i polmoni da recidere la trachea, vasi sanguigni e legamenti in una provetta conica da 15 mL con 5 mL di freddo esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM). Mantenere il ghiaccio fino al passaggio successivo.
- Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.
- Trasferire i polmoni irrorati in una piastra di coltura sterile e apirogeno 60 mm con 3 mL DMEM. Con l'aiuto del forcipe di dissezione tirarne fuori le vie respiratorie e altro materiale di tessuto polmonare non duro, se presente. Tritare il tessuto polmonare con un bisturi per < dimensione di 1 mm.
- Aggiungere 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL dnasi I, Miscelare pipettando e incubare a 37° C in un incubatore per 25 minuti. Mescolare delicatamente una volta pipettando dopo 10 minuti.
- Passare i polmoni dissociati attraverso un colino di cella µm 100 installato in una provetta conica da 50 mL. Utilizzare il retro di uno stantuffo dalla siringa da 1 mL per mash up del cellulare ciuffi sul filtro. Lavare il filtro con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA).
- Centrifugare a 500 x g a 4 ° C per 5 minuti. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di tampone di lavaggio.
- Ripetere i passaggi 2.12 e 2.13 due volte, cambiando il filtro e il tubo ogni volta. Pre-ammollo il filtro nel tampone di lavaggio per più di cinque minuti aumenta il rendimento di AM. Preparare la sospensione unicellulare aggiungendo 100 μL flusso/ordinamento buffer per il pellet cellulare.
- Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
- Eseguire anticorpo che macchia insieme a FMO e singolo-macchia controlli11,25. Valutare il polmone cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.
- AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, è possibile ordinare AMs in 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.
3. isolamento di AMs da umano liquido di BAL
- Organizzare il trasferimento del fluido BAL umano dalla clinica al laboratorio a 4 ° C.
- Centrifugare il liquido di BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL11.
- Lavare la pallina con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA) e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti.
- Risospendere le cellule di BAL sono in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).
- Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo umana Fc blocco (clone di Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
- Eseguire anticorpo che macchia insieme FMO e singolo-macchia controlli11,24. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.
- AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel terreno di coltura umana AM da 1 mL o 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo.
4. in vitro cultura di AMs
- In seguito l'ordinamento delle cellule, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
- Risospendere umano AMs in 1ml terreno di coltura umana AM [Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di fattore (M-CSF), una concentrazione finale di 100 U/mL di stimolazione della Colonia del macrofago), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM acido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicillina/streptomicina (facoltativa)]. Allo stesso modo, risospendere mouse AMs in 1ml mouse AM terreno di coltura [DMEM completati con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di M-CSF, una concentrazione finale di 100 U/mL), 1 mM sodio piruvato, 10 mM HEPES e 1x penicillina/streptomicina (opzionale )].
- Enumerare il trypan blu-escludendo cellule vitali di un contatore di cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali a 1 x 106/ml.
Nota: Idealmente, fino a 5 x 105 AMs può essere isolato dal liquido di BAL raccolto da un topo maschio di 8-10 settimane vecchio C57BL/6. La resa di AM dal digest di polmone del mouse è variabile e può essere leggermente inferiore a quella del fluido del mouse BAL. Rendimento AM da umano liquido di BAL dipende dal volume di liquido di BAL, il volume totale di soluzione salina utilizzata per il lavaggio e condizioni cliniche del paziente. - Basato sul rendimento e sulla necessità sperimentali, seme le cellule in camera diapositive, piastre di coltura o matracci di cultura. Idealmente, seme l'AMs a 1 x 105/ml con 10 mL di terreno in un matraccio di cultura del tessuto T25.
- Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 ambiente.
Nota: AMs crescerà come cellule aderenti e sono estremamente a crescita lenta (tempo di raddoppiamento > 7 giorni). - 24 ore post-semina, AMs deve essere aderente e non verranno disconnessi da un delicato cambiamento del terreno di coltura. Rimuovere il supporto dall'aspirazione da un'estremità e saziatevi con medium fresco pre-riscaldato a 37 ° C.
Nota: Le cellule possono ora utilizzabile per valutare la fisiologia AM o gli effetti di stimoli. AMs cresciuto nelle diapositive di camera può essere convenientemente macchiato con gli anticorpi adatti e sono ideali per la visualizzazione al microscopio. Per la valutazione cytometric di flusso, AMs vengono raccolte tramite incubazione con non-enzimatica delle cellule dissociazione della soluzione. - Aspirare il terreno di coltura e aggiungere dissociazione soluzione abbastanza per coprire la superficie di cultura (circa 2 mL per fiaschetta T25) e incubare a 37 ° C per 5-10 minuti. Non raschiare sarà necessario, e non è consigliabile per raschiare le cellule meccanicamente. Picchiettare delicatamente i lati, aggiungere 1-2 mL di buffer di flusso/ordinamento e pipettare delicatamente su e giù per staccare la maggior parte delle cellule aderenti.
- Per gli studi di RNA, lisare le cellule direttamente sulla piastra di coltura con l'aggiunta di tampone di lisi.
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Representative Results
L'approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l'analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verificano nei polmoni. Il seguente schema degli indicatori di superficie può essere impiegato per distinguere facilmente questi tipi di cellule da altro dove AMs sono CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+,-Ab + /-, F4/80-, CD11b- ; I macrofagi interstiziali sono CD45+, CD11b+,-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Le cellule dendritiche sono CD45+, CD11b+, CD11c+,-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Le cellule dendritiche sono CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+,-Ab +, CD11b-; Le cellule del plasmacytoid dendritica sono CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+,-Ab -, i neutrofili sono CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab -, Ly - 6C–e monociti sono CD45+, CD64+ /-, Ly - 6C+ /-,-Ab -. Le popolazioni di AM evidenziate in rosso (CD11cCiao e Siglec-FCiao) e teal (CD11cCiao, Siglec-Fint), rispettivamente, rappresentano convenzionale AMs (principali della popolazione) e monocito-derivate macrofagi polmonari ( minore popolazione) che si verificano nello spazio alveolare. L'ordinamento di CD45 del flusso+, CD11cCiao, Siglec-FCiao cellule rese purificata del mouse AMs. La figura 2 illustra gli indicatori di superficie delle cellule necessari per una precisa identificazione e isolamento di AMs umano. L'AMs umano è identificato per essere CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+e CD206+ BAL celle e può essere ordinato per applicazioni a valle del flusso.
Figura 1 : Analisi cytometric di flusso rappresentativi del mouse AMs. (A) posizione anatomica di AMs in una sezione di tessuto polmonare di mouse (ematossilina ed eosina). AMs sono indicate con le frecce e la barra della scala è 60 μm. (B) rappresentante flusso cytometry gating strategia per identificare mouse AMs in cellule di BAL. I campioni sono stati valutati da un analizzatore di cella e dati giù sono stati provati a 500 eventi per confronto dal software di analisi. Rosso (CD11cCiao e Siglec-FCiao) e teal (CD11cCiao, Siglec-Fint), rispettivamente, sono convenzionali AMs (principali della popolazione) e macrofagi polmonari monocito-derivate (popolazione secondaria). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi citofluorimetrica rappresentativo delle umane AMs. (A) Gating strategia per identificare umano AMs da liquido di BAL da un destinatario del trapianto del polmone umano. (B) Micrografo campo luminoso di AMs umana alle sette giorni di cultura. La barra della scala è di 400 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l' intero ciclo di vita26. Loro ruolo nella fisiologia polmonare7 e patologia12 e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare24 è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni11,27 e perché sono coinvolti nell'attivazione e nella progressione di risposte immunitarie11,24, loro ruoli in altri polmonare cronica infiammatoria e fibrotica malattie deve essere valutata. Storicamente, AMs ha avuto un'identità confusa e sono stati spesso erroneamente identificato. Con marcatori fenotipici recentemente adottato25,28, ora è fattibile per distinguere l'umano e il mouse AMs da altri fagociti polmonari (ad es., interstiziale macrofagi, cellule dendritiche polmonare e del monocito derivato di macrofagi polmonari). I metodi descritti qui sono stati ottimizzati per l'isolamento e per la coltura in vitro di mouse e AMs umano. Anche se questi protocolli possono essere largamente adottati per AMs da altre specie, adeguata determinazione fenotipica dovrebbe essere condotti per stabilire un insieme di marcatori di superficie "minimamente necessaria" per la caratterizzazione completa.
Per l'isolamento di AMs murino tramite il lavaggio, l'inclusione di chelatazione agente (cioè, EDTA) e pre-agghiacciante il buffer di BAL sono stati trovati per essere importante nello studio corrente. Perché AMs sono aderente alla parete alveolare, uso di PBS da solo era inefficace a sloggiare le cellule e prodotto un rendimento significativamente più basso. Protezione installazione del catetere alla trachea è un altro passo fondamentale. Prestare la massima attenzione per garantire un allegato di tenuta che minimizza la perdita di liquido di BAL. È necessario prestare particolare attenzione mentre lavaging un mouse più giovane (< 6 settimane di vita), come la delicatezza strutturale della trachea può provocare strappi o perdite durante il lavaggio. L'installazione di due consecutive non sovrapposte SUTURE spesso assicura un fissaggio sicuro del catetere e previene perdite. Anche se dissociazione non enzimatica (cioè., con un buffer di chelante completati) era solo eseguita per l'isolamento di AM in questo studio, è possibile che la dissociazione enzimatica con collagenasi durante il lavaggio del polmone può produrre una migliore resa di AM.
La resa di umano AM da liquido di BAL è variabile. AMs costituiscono quasi il 10% di tutte le cellule di BAL raccolti dai destinatari del trapianto di polmone umano presso Istituto toracico Norton durante il follow-up di routine post-trapianto, e la resa totale di AM dipende da diverse variabili. Tali variabili includono condizioni cliniche del paziente, il volume di soluzione fisiologica utilizzato nel lavaggio e il volume di liquido di BAL elaborato per l'isolamento di AM. Le procedure di pre-lavaggio (ad esempio, le biopsie dell'ago) che si traducono in microhemorrhage alterano la composizione cellulare delle cellule di BAL; Tuttavia, implementazione di marcatori fenotipici consente una diagnosi inequivocabile e caratterizzazione della piscina AM umana (Figura 2).
Uso di L-929 condizionata medium (una fonte di M-CSF) è stato necessario per il mantenimento in vitro di AMs. È nostra convinzione che il completamento di M-CSF purificato sarebbe sufficiente a sostenere l'AMs nella cultura; Tuttavia, una concentrazione ottimale deve essere funzionato sia per umani e mouse AMs. La latta di cellule coltivate utilizzata per studi di endocitosi, risposta all'infiammazione, presentazione dell'antigene, lo stato di maturazione/attivazione o qualsiasi altri test che necessita di manutenzione delle celle in tensione per un tempo corso analisi11,24 . Nel corso di questo studio, non è stato tentato di mantenere AMs come una linea continuamente coltivata e solo a breve termine studi terminali (< 30 giorni dal raccolto) sono stati effettuati. Di conseguenza, un'evidente limitazione di questo metodo è la mancanza di un dati di cultura a lungo termine, in particolare sulla stabilità delle cellule (cioè, se AMs possono crescere come un essere finito o continuo linea, la risposta di AMs di crioprotettori e crioconservazione, e drift fenotipica e/o genotipica) dopo coltura in corso. AMs sono lunga vita delle cellule in vivo e certo grado di variazione è previsto tra le cellule isolate da polmoni sani e da quelli in fase di infezione delle vie respiratorie o risposte infiammatorie/autoimmuni.
Nel complesso, il metodo presentato qui documenti un approccio semplificato per isolare, caratterizzare e mantenendo umana e mouse AMs in un sistema di coltura cellulare. Anche se questo protocollo può essere ulteriormente ottimizzato basato sulle esigenze individuali, sperimentale, essa può servire come protocollo di un principiante di sezionare la rilevanza funzionale di AMs in medicina polmonare e malattie respiratorie.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Clare Prendergast per assistenza con il manoscritto di editing. DKN è supportato da una ricerca concedere (n. 2095) della Fondazione di Flinn e TM è supportato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN ha sviluppato i metodi, progettato lo studio e ha scritto il manoscritto; OM assistito con gli studi sugli animali e gli acquisti di campioni clinici; SB assistita con analisi cytometric di flusso e ordinamento delle cellule; TM sotto la supervisione degli studi e il manoscritto è esaminata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
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