Summary
Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.
Abstract
Los macrófagos alveolares son macrófagos terminalmente diferenciados, residente de pulmón de origen prenatal. Los macrófagos alveolares son únicos en su larga vida y su importante papel en el desarrollo pulmonar y función, así como sus respuestas localizadas del pulmón a la infección y la inflamación. Hasta la fecha, ningún método unificado para la identificación, aislamiento y manejo de los macrófagos alveolares de los seres humanos y ratones existe. Este método es necesario para estudios sobre estas importantes células inmunitarias innatas en varias configuraciones experimentales. El método descrito aquí, que puede ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio, es un enfoque simplificado para cosechar los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar o de tejido pulmonar y mantenimiento in vitro. Porque los macrófagos alveolares se presentan principalmente como células adherentes en los alvéolos, el enfoque de este método es el desalojo antes de la cosecha y la identificación. El pulmón es un órgano altamente vascularizado, y varios tipos de células de origen mieloide y linfoide habitan, interactúan y son influenciados por el microambiente del pulmón. Utilizando el conjunto de marcadores de superficie que se describe aquí, los investigadores pueden fácilmente y sin ambigüedades distinguir los macrófagos alveolares de otros leucocitos y purificarlos para aplicaciones posteriores. El método de cultivo desarrollado en este documento apoya a ambos humanos y ratón macrófagos alveolares para el crecimiento in vitro y es compatible con los estudios celulares y moleculares.
Introduction
El microambiente del pulmón es un ecosistema único complejo con un conducto de aire elaborado y vasculatura. El aire inhalado viaja a través de la tráquea y numerosas ramificaciones de bronquios y bronquiolos antes de llegar a los alvéolos, donde ocurre el intercambio de gases sangre aire. Debido a la interacción directa con la atmósfera, la superficie respiratoria requiere protección contra los efectos potencialmente perjudiciales de partículas en suspensión y contaminantes. Un número de barreras físicas, químicas e inmunológicas protege a los pulmones. En particular, el despliegue de los fagocitos en la superficie respiratoria sirve un sistema importante de primera línea de defensa. Los macrófagos alveolares (AMs) son un tipo de fagocitos reside en el pulmón, y constituyen la inmensa mayoría de la piscina de macrófagos del pulmón. Como su nombre lo indica, AMs se localizan sobre todo a la luz alveolar y se presentan como células sésiles que constantemente muestra la atmósfera ambiente y comunican con el epitelio alveolar1. En estado estacionario los pulmones, más del 95% de los fagocitos en el espacio alveolar son AMs2, cuya composición puede alterar debido a inflamación, infección o exposición crónica a contaminantes.
AMs participan en una amplia gama de funciones que pueden ser locales a los pulmones o de importancia sistémica. Por ejemplo, AMs son esencial en el desarrollo y el óptimo funcionamiento de los pulmones; vigilancia inmune; y la separación de los desechos celulares, invasión de patógenos y partículas inhalado3,4,5,6,7. Agotamiento objetivo del AMs es conocido por afectar la separación de virus respiratorios y bacterias4,8. Además de su papel como los fagocitos y los defensores de una primera línea de la homeostasis pulmonar, AMs se conocen para funcionar como células presentadoras de antígeno en obtención de T de la célula de inmunidad9, potenciando la eficacia de la vacuna intranasal10 y influir en la restricción pulmonar autoinmunidad después de trasplante de pulmón11,12. Deficiencia en la función de AM se ha relacionado con la proteinosis alveolar pulmonar (PAP), una condición que resulta de una mutación genética, malignidad o infección que impide la separación de surfactantes pulmonares13,14. Trasplante de AMs ahora se está estudiando como un enfoque terapéutico para el tratamiento del PAP 15,16.
AMs se sabe que se originan durante la embriogénesis y a persistir en los pulmones durante toda la vida sin sustituidos por circular leucocitos2,17. Aunque, AM es indetectable en los pulmones homeostáticos, diferentes niveles de volumen de AM se han divulgado en ciertas condiciones clínicas, incluyendo infección por el influenza virus4, myeloablative irradiación18, exposición a endotoxinas 19y20de la tercera edad. AMs se cree que uno mismo-renovar vía una baja proliferación17,21, pero algunos estudios recientes afirman que los monocitos pueden dar lugar a una población de22,de macrófagos intravasculares pulmonares23 bajo condiciones experimentales, pero la funcionalidad de estos macrófagos pulmonares recién convertidos todavía tienen que definirse en enfermedades pulmonares. Por otra parte, entender el umbral de estímulo en el contexto de activación de AM es un área potencialmente interesante, como el pulmón trata de conservar un equilibrio entre las señales inflamatorias y los mecanismos inmunoreguladores.
Las alteraciones fisiológicas o patológicas que conducen a la pérdida de regulación inmune están importantes para evaluar en diversos contextos clínicos (p. ej., infecciones respiratorias, enfermedad inflamatoria pulmonar y enfermedad pulmonar fibrótica). Sin embargo, AMs son cada vez más reconocido como indicadores o incluso determinantes de la salud pulmonar11,24. Actualmente, no están disponibles para la recolección, caracterización y mantenimiento AMs de seres humanos y modelos preclínicos murinos protocolos unificados. Falta de un consenso sobre precursores de AM y fenotipos y la ausencia de una metodología detallada han sido la gran barricada en descifrar funciones de AM en la enfermedad y la salud pulmonar. El siguiente protocolo ofrece una identificación definitiva, aislamiento y en vitro cultura estrategia que mucho avanzar en la comprensión del comportamiento de AM y facilitar estudios diagnóstico y terapéuticos orientada a AM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y la Junta de revisión institucional (IRB) en el Hospital y centro médico de San José.
1. aislamiento de AMs del líquido murino el lavado broncoalveolar (BAL)
- Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.
- Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con preparación almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.
- Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.
- Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.
- Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.
- Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.
- Inyectar 10 mL helado tamponada fosfato salino (PBS) en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Absorber el flujo de sangre con almohadillas de algodón absorbente. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y entonces están listos para el lavado.
- Suavemente abrir la piel y del músculo en el cuello para exponer la vía aérea. Suprimir cuidadosamente los músculos adyacentes, cartílagos y tejido graso sin dañar la tráquea.
- Hacer una pequeña incisión (< 2 mm) en la tráquea a la laringe posterior. Esta incisión debe ser lo suficiente como para insertar un catéter en mientras que la tráquea está todavía unida a la laringe. Insertar un catéter de 22G de 1 pulgada sin aguja dentro de la tráquea hacia los pulmones. Asegurar el catéter con una sutura de seda trenzada (4-0; no absorbible) con un nudo cuadrado.
Nota: El catéter debe recortarse según el tamaño del ratón. Catéteres muy cortos o largos tienden a tener fugas o romper la vía aérea durante el lavado. Longitud del catéter debe ser tal que cuando introduce completamente los restos de punta bien dentro de la tráquea y no llegar a los bronquios primarios. - Conecte una jeringa de 1 mL con tampón BAL helada (Ca2 + y Mg2 + libre PBS + 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético, EDTA) con el catéter e infundir lentamente el búfer en los pulmones. Esto inflará los pulmones. Mantenga la jeringa atada catéter durante cinco segundos y luego aspirar el líquido del lavado tirando suavemente el pistón. Esto desinfla los pulmones. Recoger el líquido en un tubo cónico de 15 mL a hielo.
- Repita paso 1.10 para nueve veces más y el líquido del lavado de la piscina. No exceda 1 mL de tampón por descarga, exceda la capacidad del pulmón y provocar su ruptura.
- Eutanasia el ratón con sobredosis de CO2 por protocolo de IACUC aprobado.
- Centrifugar el líquido 10 mL BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células del BAL.
PRECAUCIÓN: El pellet puede ser muy pequeño, así que tenga cuidado al aspirar el sobrenadante. - Resuspender las células en 100 μL de buffer (PBS + 2% suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) + 1 mM EDTA 25 mM de ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)) de flujo/clasificación del BAL.
- Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc añadiendo bloques de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.
- Realizar tinción con fluorescencia menos uno (FMO) del anticuerpo y solo mancha controla11,25. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por análisis de citometría de Flujo unicelular software de análisis apropiado (véase Tabla de materiales).
- Aislar AMs por un celular activado por fluorescencia clasificador (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Como alternativa, tipo AMs en 1 mL de tampón de lisis (véase Tabla de materiales) suplementado con 10 μL/mL β-mercaptoetanol para extracción de RNA.
2. aislamiento de AMs de pulmón de ratón, suspensión unicelular
- Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.
- Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.
- Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.
- Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.
- Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.
- Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.
- Inyectar 10 mL PBS helado en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y están listos para la cosecha.
- Diseccionar a los pulmones por cortar la tráquea, vasos sanguíneos y ligamentos en un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de frío medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM). Mantener en hielo hasta el siguiente paso.
- Eutanasia el ratón con sobredosis de CO2 por protocolo de IACUC aprobado.
- Transferir los pulmones perfundidos en una placa de cultivo estéril y libre de pirógenos de 60 mm con 3 mL DMEM. Con ayuda de fórceps de disección embromar hacia fuera de las vías respiratorias y otros materiales de tejido pulmonar no duro, si está presente. Pique el tejido pulmonar con un bisturí para < tamaño 1 mm.
- Añadir 300 μg/mL TL somatométrica y 5 U/mL DNasa I, mezclar mediante pipeteo e incubar a 37° C en una incubadora durante 25 minutos. Mezclar suavemente una vez transfiriendo después de 10 minutos.
- Pasar los pulmones disociados a través de un tamiz de célula μm 100 instalado en un tubo cónico de 50 mL. Use la parte posterior de un émbolo de la jeringa de 1 mL para hacer puré de grumos de células en el filtro. Lavar el filtro con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA).
- Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 20 mL de tampón de lavado.
- Repita los pasos 2.12 y 2.13 dos veces, cambiando el filtro y el tubo cada vez. Previo remojo el filtro en tampón de lavado durante más de cinco minutos aumenta la producción de AM. Preparar suspensión unicelular mediante la adición de 100 μL de buffer para el precipitado de células de flujo/clasificación.
- Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor de Fc al agregar bloque de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.
- Realizar coloración junto con FMO y controles solo mancha11,25del anticuerpo. Evaluar el pulmón células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.
- AMs de tipo por un clasificador de célula (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Por otra parte, clasificar AMs en 1 mL de tampón de lisis con β-mercaptoetanol de 10 μL/mL para la extracción de RNA.
3. aislamiento de AMs de humano líquido del BAL
- Organizar la transferencia del líquido del BAL humano de la clínica al laboratorio a 4 ° C.
- Centrifugar el líquido del BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células de BAL11.
- Lavar el precipitado con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA) y centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- Resuspender las células del BAL son en 100 μL de buffer de flujo/clasificación (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES).
- Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc agregando bloque Fc humano (clon Fc1.3070, 25 μg/mL) y de incubación en hielo durante 20 minutos.
- Realizar anticuerpos coloración junto con FMO y controles solo mancha11,24. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.
- AMs de tipo por un clasificador de células (véase Tabla de materiales) directamente en el medio de cultivo 1 mL humano AM o 1 mL de tampón de lisis suplementado con 10 μL/mL de β-mercaptoetanol.
4. in vitro cultura de AMs
- Siguiendo la clasificación de la célula, recoger las células por centrifugación a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- AMs humanos de resuspender en 1 mL medio de cultivo de humanos AM [Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultivo sobrenadante (como fuente de factor (M-CSF), concentración final de 100 U/mL estimulante de colonias de macrófagos), piruvato de sodio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Del mismo modo, resuspender ratón AMs en 1 mL ratón AM medio de cultivo [DMEM suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como una fuente de M-CSF, concentración final de 100 U/mL), 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM HEPES y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional )].
- Enumerar el trypan azul excepto células viables por un contador celular y ajustar la concentración de células viables en 1 x 106/ml.
Nota: Idealmente, por a 5 x 105 AMs puede ser aislado de líquido del BAL de un ratón macho de 8-10 semanas viejo C57BL/6. La producción de AM de la recopilación de pulmón de ratón es variable y puede ser ligeramente menor que el líquido del BAL del ratón. Rendimiento de AM de líquido del BAL humano depende del volumen del líquido del BAL, el volumen total de solución salina que se utiliza en el lavado y condición clínica del paciente. - Basado en el rendimiento y la necesidad experimental, las células en portaobjetos de la cámara, platos de cultura o frascos de cultivo de la semilla. Idealmente, la semilla las AMs a 1 x 105/ml con medio de 10 mL en un matraz de cultivo de tejidos T25.
- Incubar las células en una incubadora humidificada de 37 ° C con 5% CO2 ambiente.
Nota: AMs crecerá como células adherentes y son de crecimiento extremadamente lento (tiempo de duplicación > 7 días). - A las 24 horas post siembra, AMs debe ser adherente y no ser separado por un suave cambio de medio de cultivo. Quitarlo del medio por la aspiración de un extremo y llenar con medio fresco, previamente calentado a 37 ° C.
Nota: Las células pueden utilizarse ahora para evaluar AM fisiología o los efectos de los estímulos. AMs en diapositivas de la cámara pueden ser convenientemente teñidas con anticuerpos apropiados y son ideales para la visualización microscópica. Para la evaluación de la citometría de flujo, AMs son cosechado por la incubación con no enzimática celular disociación solución. - Aspire el medio de cultivo y añadir solución de disociación lo suficiente para cubrir la superficie de cultivo (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incube a 37 ° C durante 5-10 minutos. No raspar será necesario, y no se recomienda para raspar las células mecánicamente. Golpee ligeramente los lados, añadir 1-2 mL buffer de flujo/clasificación y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para retirar la mayoría de las células adherentes.
- Estudios de RNA, lyse las células directamente en la placa de cultivo mediante la adición de tampón de lisis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El enfoque de citometría de flujo para identificar ratón AMs se muestra en la figura 1. Esto incluye el análisis de un conjunto mínimo de marcadores de superficie necesarios distinguir AMs de otros fagocitos reside en el pulmón o infiltración pulmonar. Análisis diferencial es necesaria para identificar positivamente a AMs de intersticiales macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monocitos y macrófagos derivados de monocitos pulmonares que se producen en los pulmones. El siguiente esquema de marcadores de superficie se puede emplear fácilmente distinguir estos tipos de células entre sí donde AMs son CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+-Ab +-, F4/80-, CD11b- ; Los macrófagos intersticiales son CD45+, CD11b+-Ab +, CD64+, CD24–; CD11b + Las células dendríticas son CD45+, CD11b+, CD11c+-Ab +, CD24+, CD64–; CD103 + Las células dendríticas son CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+-Ab +, CD11b–; Las células dendrítica plasmocitoide son CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6C+-Ab -, neutrófilos son CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab -Ly - 6C–y monocitos CD45 son+, CD64+/-, Ly - 6C+-,-Ab -. Las poblaciones de AM resaltadas en rojo (CD11cHola y Siglec-FHola) y teal (CD11cHola, Siglec-Fint), respectivamente, representan AMs convencionales (población mayor) y (derivados de monocitos macrófagos pulmonares menor población) que se producen en el espacio alveolar. De flujo clasificación de CD45+, CD11cHola, Siglec-FHola células rendimientos purificado ratón AMs. La figura 2 ilustra los marcadores de superficie celular necesarios para una precisa identificación y aislamiento de AMs humanos. El AMs humanos se identifican positivamente por ser CD45+, CD11b+, HLA-DR-+, CD163+, CD169+y CD206+ BAL cells y puede ser flujo clasificado para aplicaciones posteriores.
Figura 1 : El análisis cytometric del flujo representativo del ratón AMs. (A) localización anatómica de la AMs en una sección de tejido de pulmón de ratón (hematoxilina y eosina). AMs se indican con las flechas y la barra de escala es 60 μm. Citometría de flujo representativo de (B) compuerta estrategia para identificar el ratón AMs en las células del BAL. Las muestras fueron evaluadas por un analizador celular y datos abajo muestrearon 500 eventos para la comparación por el software de análisis. Rojo (CD11cHola y Siglec-FHola) y teal (CD11cHola, Siglec-Fint), respectivamente, es AMs convencionales (población mayor) y monocitos-macrófagos derivados de pulmonares (menor población). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : El análisis cytometric del flujo representante de AMs humanos. (A) compuerta estrategia para identificar AMs humanos de líquido del BAL de un recipiente del trasplante del pulmón humano. (B) micrografía de campo brillante de AMs humanos a los siete días de la cultura. La barra de escala es 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMs son macrófagos de pulmón-residente de larga vida que pueblan los pulmones comienza al nacer y perdurable sobre la vida entera26. Sus funciones en la fisiología pulmonar Patología de7 y12 y su potencial para predecir de autoinmunidad pulmonar24 han sido reconocidos. Porque AMs tiene una presencia a largo plazo en los pulmones11,27 y participan en la activación y la progresión de respuestas inmunes11,24, sus funciones en otro pulmón crónico inflamatorio y fibrótico enfermedades deben ser evaluados. Históricamente, AMs tenía una identidad confusa y eran a menudo identificado erróneamente. Con marcadores fenotípicos recientemente adoptado25,28, ahora es factible distinguir humano y ratón AMs de otros fagocitos pulmonares (por ejemplo, los macrófagos intersticiales pulmonares células dendríticas y monocitos derivado de los macrófagos pulmonares). Los métodos aquí descritos han sido optimizados para el aislamiento y para el cultivo en vitro de ratón y humanos AMs. Aunque estos protocolos pueden ser ampliamente adoptados para AMs de otras especies, determinación fenotípica apropiada debe realizarse para establecer un conjunto de marcadores de superficie "mínimamente necesaria" para la completa caracterización.
Para el aislamiento de AMs murinos por lavado, inclusión de (es decir, EDTA) agente quelante y pre-enfriar el búfer de BAL fueron encontrados para ser importante en el estudio actual. Porque son AMs adherente a la pared alveolar, uso de PBS solo era ineficaz en desalojar las células y produce un rendimiento significativamente más bajo. Asegurar la instalación de la sonda en la tráquea es un paso crítico. Debe tenerse cuidado para asegurar un accesorio hermético que reduce al mínimo la pérdida de líquido del BAL. Se necesita PRECAUCIÓN mientras doble-lumen un ratón más joven (< 6 semanas de edad), como la delicadeza estructural de la tráquea puede causar lagrimeo o fugas durante el lavado. Instalar dos suturas no superpuestas consecutivas a menudo garantiza una fijación segura del catéter y previene fugas. Aunque disociación no enzimática (es decir., con un buffer quelante suplido) fue realizado para el aislamiento de AM en este estudio, es posible que la disociación enzimática con colagenasa durante lavado pulmonar puede producir un mejor rendimiento de AM.
La producción de AM humano de líquido del BAL es variable. AMs constituyen casi el 10% de todas las células del BAL recogidas de los receptores de trasplante de pulmón humano en Instituto torácico de Norton durante carta recordativa rutinaria post-pulmonar trasplante, y la producción total de AM depende de varias variables. Tales variables incluyen la condición clínica del paciente, el volumen de solución salina que se utiliza en el lavado y el volumen de líquido del BAL procesada para el aislamiento de AM. Procedimientos de lavado previo (por ejemplo, las biopsias de la aguja) que provocar microhemorragias alteran la composición celular de las células del BAL; sin embargo, la aplicación de marcadores fenotípicos permite una clara detección y caracterización de la piscina de AM humana (figura 2).
Uso de L-929 acondicionado medio (una fuente de M-CSF) fue necesario para el mantenimiento en vitro de AMs. Es nuestra creencia que la suplementación de M-CSF purificada sería suficiente para sostener las AMs en la cultura; sin embargo, una concentración optimizada debe elaborarse para ambos humanos y AMs del ratón. El puede de células cultivadas utilizado para estudios sobre la endocitosis, la respuesta a la inflamación, presentación del antígeno, estado de maduración/activación o cualquier otro ensayo que requiere mantenimiento de células vivas para un análisis de tiempo-curso11,24 . En el curso de este estudio, no se intentó mantener AMs como una línea continuamente cultivada y sólo estudios terminales a corto plazo (< 30 días desde la cosecha) fueron realizados. Por lo tanto, una limitación obvia de este método es la falta de unas datos a largo plazo de la cultura, especialmente en la estabilidad de las células (es decir, si AMs puede crecer como un finito o continua la línea, la respuesta de AMs a crioprotectores y criopreservación, y fenotípica o genotípica deriva) después de la cultura actual. AMs son largo las células vivas en vivo, y se espera cierto grado de variación entre las células aisladas de pulmones sanos y de los sometidos a infección respiratoria o las respuestas inflamatoria, autoinmune.
En general, el método presentado aquí documentos un enfoque simplificado para aislar, caracterizar y mantenimiento de humano y ratón AMs en un cultivo celular. Aunque este protocolo puede optimizarse aún más en base a necesidades experimentales individuales, puede servir como protocolo de un principiante a diseccionar la relevancia funcional de AMs en las enfermedades respiratorias y medicina pulmonar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Clare Prendergast ayuda con editar el manuscrito. DKN es apoyada por una investigación conceder (#2095) de la Fundación Flinn y TM es apoyado por becas de institutos nacionales de salud (R01HL056643 y R01HL092514). DKN desarrolló los métodos, diseñó el estudio y escribió el manuscrito; OM con los estudios en animales y obtención de la muestra clínica; SB asistida con análisis cytometric del flujo y separación celular; TM bajo la supervisión de los estudios y revisaron el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
