Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Generering af transgene planter med enkelt-kopi indrykninger ved hjælp af BIBAC-GW binære vektor

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

Ved hjælp af en pBIBAC-GW binære vektor gør skabe transgene planter med intakt enkelt-kopi indsættelser, en nem proces. Her, præsenteres en række protokoller som guide læseren gennem processen med at generere gensplejsede Arabidopsis planter, og test planter til handelsformer, og kopierer antallet af indsætter.

Abstract

Når du genererer transgene planter, generelt er målet at have stabile udtryk for en transgen. Dette kræver en enkelt, intakt integration af transgenet, som multi kopi integrationer udsættes ofte for genhæmning. Gateway-kompatible binære vektor baseret på bakteriel kunstige kromosomer (pBIBAC-GW), ligesom andre pBIBAC derivater, giver mulighed for isætning af enkelt-kopi transgener med høj effektivitet. Som en forbedring af den oprindelige pBIBAC, er en Gateway kassette blevet klonet i pBIBAC-GW, så at sekvenser af interesse kan nu let integreres i vektor overførsel DNA (T-DNA) af Gateway kloning. Almindeligt, transformation med pBIBAC-GW resulterer i en effektivitet på 0,2-0,5%, hvorved halvdelen af transgenics bære en intakt enkelt-kopi integration af T-DNA. PBIBAC-GW vektorer fås med resistens over for ammoniumglufosinat eller DsRed fluorescens i frø frakker til udvalg i planter og modstand mod kanamycin som en markering i bakterier. Her, en række protokoller er præsenteret som guide læseren gennem processen til oprettelse af transgene planter ved hjælp af pBIBAC-GW: start fra rekombinerer sekvenser af interesse i pBIBAC-GW vektor af valg, at plante transformation med Agrobacterium, udvalg af transgenics, og test planter til handelsformer og kopier række indsætter ved hjælp af DNA blotting. Opmærksomhed er givet til at designe en DNA blotting strategi at genkende single og multi kopi integrationer på enkelt- og flersidede loci.

Introduction

Når du genererer transgene planter, er normalt målet at have integreret transgeners stabilt udtrykt. Dette kan opnås ved intakt enkelt kopi integrationer af en transgenet. Flere integrationer kan føre til øget udtryk for en transgen, men også til genhæmning. Hæmning af transgener er mere sandsynlige, hvis indsatte sekvenser er arrangeret i tandem eller omvendt gentagelser1,2,3,4. Binære vektorer bruges som transport i Agrobacterium-medieret transformation eksperimenter for at levere sekvenser af interesse i anlægget genomer. Antallet af integrationer i en plante genom er afhængig af kopi antallet af den binære vektor i Agrobacterium tumefaciens5,6. Mange almindeligt anvendte binær vektorer er høj kopi vektorer, og derfor give en høj gennemsnitlig transgen kopi nummer: 3.3 til 4,9 eksemplarer i Arabidopsis5.

Antallet af T-DNA integrationer kan sænkes ved hjælp af binær vektorer, der har en lav-kopi nummer i A. tumefaciens, såsom BIBAC7, eller ved at lancere en T-DNA fra A. tumefaciens kromosom5. Det gennemsnitlige antal af transgenet integrationer i sådanne tilfælde er under 25,8,9,10. På grund af er enkelt-kopi i A. tumefaciens, og også i Escherichia coli, BIBAC-derivater kan vedligeholde og levere konstruktioner så stor som 150 kb11.

GW-kompatible BIBAC vektorer10,12 tillader nem indførelsen af gener af interesse vektor bruger Gateway kloning. Brugen af Gateway teknologi forenkler proceduren for kloning, men også overvinder almindelige problemer i forbindelse med store lav-kopi-nummer vektorer13,14, såsom et lavt DNA udbytte og et begrænset udvalg af unikke begrænsning sites tilgængelige for kloning7,11. PBIBAC-GW derivater er tilgængelige med enten resistens over for ammoniumglufosinat (pBIBAC-BAR-GW) eller DsRed fluorescens i frø frakker (pBIBAC-RFP-GW) for udvalg i planter (figur 1)10,12. For begge vektorer bruges et kanamycin resistens gen som udvalg markør i bakterier.

PBIBAC-GW vektorer kombinere: (1) let design og genmanipulation i E. coli, (2) intakt enkelt-kopi integrationer og planta på høj effektivitet. PBIBAC-GW vektorer udbytte på gennemsnit 1,7 integrationer i Arabidopsis med ca. halvdelen af de transgene planter bærer en enkelt integreret T-DNA10.

Stabil udtryk af transgener er et krav for de fleste transgenics genereret. Stabil transgen udtryk kan opnås ved intakt, enkelt-kopi integrationer. Arbejde med transgene planter bærer intakt, enkelt-kopi integrationer er imidlertid endnu vigtigere, hvis for eksempel, formålet er at undersøge effektiviteten af kromatin-baserede processer, såsom mutagenese, rekombination, eller reparation og afhængighed af disse processer på lokationen genomisk og kromatin struktur på indsættelsesstedet. For vores interesse for at studere afhængighed af oligonukleotid instrueret mutagenese (ODM) på den lokale genomiske kontekst, blev et sæt reporter linjer med intakt, enkelt-kopi integrationer af en mutagenese reporter gen genereret (figur 2)10. Bruger dette sæt af linjer, blev det vist, at ODM effektivitet varierer mellem transgene loci integreret på forskellige genomisk steder, trods de transgene udtryk niveauer er temmelig lignende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indsætte sekvenser af interesse i binære vektor

  1. Forberede Gateway indrejse og binære vektorer.
    1. Isolere Gateway post vektor indeholdende en DNA fragmenter eller gen af interesse ved hjælp af en mini prep kit efter forslag af leverandøren.
      Bemærk: BIBAC-GW vektorer kræver brug af kanamycin (Km) til valg i bakterier, derfor, bruge en løsning vektor med en anden modstand markør i stedet for kanamycin. For eksempel, er pENTR-gm vektor, bærer en Gentamicin resistens gen, et godt valg12.
    2. Udbrede og isolere BIBAC-GW vektor af interesse. Bruge en E. coli -stamme, der er resistente over for toksicitet af ccdB gen findes inden for Gateway kassette. Isoleres BIBAC-vektorer ved hjælp af protokoller eller kits, specialdesignet til store plasmider efter forslag af leverandøren.
  2. Udføre en Gateway reaktion.
    1. Forberede LR rekombination reaktion efter forslag af leverandøren. Bland de følgende komponenter i 1,5 mL microcentrifuge rør ved stuetemperatur (RT): 100-300 ng post klon (supercoiled), 300 ng af BIBAC-GW vektor, LR Clonase reaktion buffer (endelig koncentration: 1 x). Justering af lydstyrken for blandingen til 16 µL med TE (10 mM Tris, 1 mM af EDTA, pH 8,0). Endelig, tilføje 4 µL af LR Clonase enzym mix og mix af vortexing. Inkuber blanding ved 25 ° C i 1 time.
    2. Opsige LR reaktion ved at tilføje 2 µL af Proteinase K løsning (2 µg/µL) til blandingen forberedt i trin 1.2.1. Blandes og inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
  3. Transformer E. coli med Gateway reaktionsblanding af elektroporation.
    1. Desalt LR reaktionsblandingen før elektroporation.
      Bemærk: Dette trin er afgørende for vellykket elektroporation. Nedenfor en dialyse metode er beskrevet, men andre metoder såsom nedbør med natriumacetat og ethanol kan også bruges.
      1. Forberede filter dialyse af LR reaktion opsætningen. Hæld 20 mL i ultrarent deioniseret vand i en steril petriskål. Placer en membran filter disk (pore størrelse = 0,025 µm) på vandoverfladen.
      2. Afpipetteres hele LR reaktionen omhyggeligt oven på membranen og lad blandingen dialyze på RT for 1 h.
    2. Tilføj 5 µL af afsaltet LR mix til electro-kompetente DH10B celler i en elektroporation kuvette (0,1 cm). Electroporate celler (1,5 V/cm, modstand 200 Ω, kapacitans 25 µF), og straks tilføje 1 mL pre varmede Super Optimal Catabolite undertrykkelse (SOC) medium til celler, efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 45 min, 180 rpm. (SOC medium, 1 L: 20 g Bacto trypton, 5 g gær extract, 0,5 g NaCl, 2,5 mL 1M KCl, 20 mL 1 M filter-steriliseret glukose).
      Bemærk: DH10B celler kan erstattes af andre E. coli celler, der stabilt opretholde store plasmider.
      Bemærk: Optimale elektroporation betingelser er afhængige af elektroporation enheden bruges.
    3. Pellet bakterier ved maksimal hastighed for 30 s ved hjælp af en microcentrifuge, fjerne overskydende SOC, og resuspenderes i ca 50-100 µL af Luria-Bertani (LB) medium. Sprede bakterier på kanamycin-LB (Km-LB) plader (Km koncentration, 40 µg/mL), og Inkuber plader ved 37 ° C natten over. (LB medium, 1 L: 10 g Bacto trypton, 5 g gær extract, 10 g NaCl. Solid medium tilføje agar, 15 g/L).
  4. Identificere rekombineret BIBAC-GW derivater og isolere plasmid DNA.
    1. Hvis du vil være i stand til at vokse på Km-LB plader, bør E. coli celler indeholder den rekombineret BIBAC-GW plasmid hvor ccdB sekvens er erstattet med den ønskede indsætte. Bruge koloni Polymerase Chain Reaction (PCR)15 til at kontrollere, hvis bakterier-kolonier på pladen indeholde de korrekte plasmider, har BIBAC-GW rygraden og indsætte af interesse.
      1. For at identificere pBIBAC-BAR-GW rygraden, udføre en PCR15 reaktion med primere DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'og DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Denne primer sæt forstærker en 563 bp fragment af bar -genet.
      2. Til at kontrollere tilstedeværelsen af BIBAC-RFP-GW rygraden, udføre en PCR15 reaktion, ved hjælp af primere M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'og M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Denne primer kombination forstærker en 791 bp fragment overlappende cruciferin promotor og rfp sekvens.
      3. Udføre PCR15 reaktioner ved hjælp af gen-specifikke primere til check for tilstedeværelse af Indsæt af interesse.
    2. Podes en enkelt positiv koloni i 2-5 mL af LB medium indeholdende kanamycin (40 µg/mL) for DNA isoleret16. Der inkuberes ved 37 ° C på en orbitalryster på 180 rpm, natten over.
    3. Isolere plasmid DNA (Se trin 1.1.2).

2. forberedelse af A. tumefaciens for blomstermotiver dypning af Arabidopsis

  1. Omdanne BIBAC-GW derivater til A. tumefaciens.
    1. Forberede electro-kompetente celler af A. tumefaciens stamme C58C1 med pCH32 helper plasmid7. Vokse bakterier tetracyklin (5 µg/mL) og rifampicin (100 µg/mL) til at vælge for pCH32 og sikre vækst kun Agrobacterium celler.
    2. Tilføje 0,25-0,5 µg DNA af et pBIBAC-GW derivat, pre opløst i 10 – 20 µL sterilt ultrarent ionbyttet vand, 20 µL kompetente Agrobacterium celler i elektroporation kuvetter (0,1 cm). Hold celler på is.
    3. Electroporate celler (1,5 V/cm, modstand 400 Ω, kapacitans 25 µF). Umiddelbart efter elektroporation, tilsættes 1 mL pre varmede (28 ° C) SOC medium for bakterier og der inkuberes celler ved 28 ° C i 60-90 min.
    4. Sprede 100 µL og resten af bakterier på separate LB plader der indeholder rifampicin (100 µg/mL), tetracyklin (5 µg/mL) og kanamycin (40 µg/mL), og der inkuberes i mørke ved 28 ° C i 1-2 dage.
  2. Forberede Agrobacterium suspension.
    1. Check af PCR et par af A. tumefaciens kolonier fra pladen forberedt i trin 2.1.4, for tilstedeværelsen af den korrekte vektor (Se trin 1.4.1).
    2. Streak en enkelt koloni bekræftet til at indeholde de binære vektor med passende indsætte på en LB-plade, der indeholder antibiotika (Se trin 2.1.4). Vokse på 28 ° C natten over.
    3. Gentag striber med en enkelt koloni fremstillet i trin 2.2.2.
    4. Podes en enkelt koloni i 2,5 mL af LC medium suppleret med antibiotika (Se trin 2.1.4) for preculture. Inkuber ved 28 ° C i mindst 8 timer eller natten over, på 180 rpm. (LC medium, 1 L: 10 g Bacto trypton, 5 g gær extract, 0,5 g NaCl, 2,5 g af MgSO4 · 7 H2O, 2 g Maltose).
    5. Tilføj preculture fra trin 2.2.4. 250 mL LC suppleret med antibiotika (Se trin 2.1.4) og vokse ved 28 ° C, på 180 rpm, natten over.
    6. Pellet kultur af spinning på 5.500 x g i 12 min. genopslæmmes pellet i 100 mL opløsning indeholdende 5% saccharose, 0,05% Silwet L-77, 0,5 x MS. Pour suspension i en steril beholder til floral dip af planterne.

3. Arabidopsis Transformation

  1. Forberede Arabidopsis planter til transformation.
    1. Vokse Arabidopsis planter i et drivhus eller klima kontrollerede vækst kammer, indtil de er blomstringen (12 Potter med 9 planter pr. dypning).
    2. Klip de første bolte til at tillade flere sekundære bolte til at dukke op. Planterne er klar til dip 4-6 dage efter klipning, når planterne har mange umodne blomsterhoveder og ikke mange befrugtede siliques.
  2. Floral dypning
    1. Dyp blomsterstande til 5 – 10 s i Agrobacterium suspension forberedt i trin 2.2.6. Brug blide agitation.
    2. Wrap de overjordiske plantedele i plastfolie til at holde luftfugtigheden høj, og dække urtepotter med en boks til at holde planterne i mørke. Inkuber planterne i 2 dage i et drivhus/vækst kammer.
    3. Fjern boksen og klamre film og vokse planter til modenhed i en sal, drivhus/vækst.
      Bemærk: For at øge effektiviteten af transformation, de samme planter kan være re dyppet 7 dage efter den første dypning.
    4. Høste frø. Samle og analysere frø (T1) af planter, transformeret med den samme konstruktion, som et enkelt sæt.
  3. Skærm for transgene planter.
    1. For at screene for transgene planter omdannet med et pBIBAC-RFP-GW derivat, analysere frøene ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. For at afsløre DsRed udtryk i frø frakker, image frø på en excitation af 560 nm og emission af 600-650 nm. Adskille de fluorescerende frø fra ikke-fluorescerende modparter med pincet.
    2. For at screene for transgene planter omdannet med et pBIBAC-BAR-GW derivat, så frøene i bakker fyldt med jord (~ 2.500 frø/0,1 m2). For at sikre en selv sprede frø over bakker, suspendere frø i 0,1% agar i 0,5 x Murashige Skoog medium (MS) og spredes frøene ved hjælp af 1 mL pipette.
      Bemærk: For at stimulere frø til at spire i en synkron måde, inkuberes frøene i mindst 2 dage ved 4 ° C. Dette kan ske før eller efter såning af frø.
      1. Spray udplantningsplanterne med 0,5% ammoniumglufosinat løsning 2 uger og 3 uger efter såning i skufferne. Bruge 500 mL af ammoniumglufosinat løsning pr. 1 m2.
      2. Overføre bevarede planteforædlingsmateriale til enkelte Potter. Et typisk billede af en bakke med frøbedsplanter før og efter (anden) ammoniumglufosinat behandling er vist i figur 3.
      3. Analysere de glufosinat-ammonium-resistente planter af PCR for tilstedeværelsen af konstruktionen af interesse (Se trin 1.4.1. for primere).
        1. Isolere genomisk plante DNA i PCR ved hjælp af metoden beskrevet af Edwards et al. 17

4. kendetegner Transgenics nummer og integritet af T-DNA integrationer

  1. Strategi for begrænsning digestions
    Bemærk: Bestem antallet af T-DNA integrationer og deres integritet af DNA blotting ved hjælp af restriktionsenzymer. Denne metode gør det muligt for at identificere enkelt, men også gentaget integrationer på de samme eller forskellige loci i genomet.
    1. Brug en række begrænsninger digestions til at identificere de forskellige integration mønstre muligt:
      1. Vælg et enzym, der skærer en gang midt i T-DNA, at uafhængigt sonde sekvenser opstrøms og nedstrøms for webstedet begrænsning (figur 4A og Figur 7A-C). Se figur 4A, og figur forklaringen til de forventede resultater og fortolkning.
      2. Vælg en enzym eller kombination af enzymer skære ud hele sekvensen af interesse på en gang (figur 4B og figur 7A-D). Enhver afvigelse fra den kendte længde angiver trunkering af den integrerede kassette.
        Bemærk: sørge for at kun bruge restriktionsenzymer, der ikke er følsomme over for cytosin methylering.
  2. Forberede de genomisk DNA-prøver.
    1. Isolere genomisk DNA fra planter bærer konstruktion af interesse. En CTAB DNA miniprep metode kan bruges til DNA isoleret18. For DNA duppes analyse af Arabidopsis DNA, 2-2,5 µg genomisk DNA er nødvendig. Opløse DNA i 50 µL af TE.
    2. Kontroller DNA integriteten af gel elektroforese16. Intakt genomisk DNA trækker som en diskret bandet på toppen af gelen. DNA nedbrydning kan anerkendes som tilstedeværelsen af en smøre. For at undgå DNA skader forårsaget af gentagne frysning-optøning, opbevares genomisk DNA-prøver ved 4 ° C.
    3. Fordøje det genomisk DNA (2-2,5 µg for Arabidopsis genomisk DNA) i en samlet maengde paa 50 µL, natten, ved hjælp af buffer betingelser foreslået af enzymet leverandør.
      1. Mix 2-2,5 µg Arabidopsis genomisk DNA, 5 µL 10 x begrænsning buffer og 5 U begrænsning enzym i alt 50 µL ultrarent deioniseret vand i et reagensglas.
    4. Tilføje lastning farvestof (1 x slutkoncentration) til begrænsning prøverne før pålæsning på en gel. For god visuel tracking, bruge en af følgende: comigrating med små fragmenter (Bromophenol blå, 350-400 bp), eller comigrating med større fragmenter (Cylene cyanol, 3 – 4 kbp).
  3. Køre DNA gel.
    1. Forberede en lang (20 cm) 0,5 x TBE Agarosen gel19. Procent af Agarosen i gelen afhænger fragment størrelser forventes. 0,8 – 1% optimalt adskiller fragmenter > 1 kb i størrelse. Brug 1-1,5% Agarosen for fragmenter < 1 kb. Læg ikke ethidiumbromid gel. (5 x TBE, 1 L: 54 g Trizma base, 27,5 g borsyre, 3.75 g af EDTA).
      Bemærk: For at forhindre DNA-kontaminering, brug gel bakker, der ikke er vant til fractionate plasmid og PCR forstærket DNA.
    2. Indlæse prøver på gel19.
    3. Tilføje DNA markører til gel, der er i området størrelse af de forventede fragmenter. Læg ca 1 µg af markør (50-250 ng af forskellige størrelse fragment) på gel til at tillade visualisering af UV-lys.
    4. Størrelse-fractionate DNA ved en lav spænding (40-50 V/500 mA) natten over.
  4. Forberede overførsel af DNA fra agarosegel til nylon membran.
    1. Overføre gel til en separat skuffe, og bejdse det i 20-25 min i 0,5 x TBE indeholdende ethidiumbromid (5 µg/mL) ved at dreje på 40 rpm på en orbitalryster.
    2. Visualisere gel på en UV transilluminator. Kontrollér størrelsen adskillelse af genomisk DNA, herunder synlighed af diskrete satellit bands (figur 5A). En smear mod lavere molekylvægt størrelser angiver DNA nedbrydning.
    3. På UV transilluminator, lægge en gennemsigtighed over gelen, og Markér positionen af slots og markør bands med en tusch (figur 5B). Dette vil lette fastsættelse af størrelsen af de hybridiserede fragmenter senere, i tilfælde af markør sekvenser ikke krydse sig specifikt med sonden DNA. Ved angivelse af markør fragmenter på dette trin, er det muligt at spore størrelsen af de hybridizing fragmenter.
    4. Placere gel tilbage i skuffen og skyl med laves deioniseret vand nedsænke det i 0,25 M HCl i 15 min. til fragmentize DNA i gelen. Vask med laves deioniseret vand. Brug nok HCl og vand til at dække gel i skuffen, og rotere bakken med den undersøiske gel på 40 rpm på en orbitalryster.
    5. Inkuber gel i denaturering buffer i 30 min. vask med laves deioniseret vand. Brug nok buffer og vand til at dække gel i skuffen, og rotere bakken med den undersøiske gel på 40 rpm på en orbitalryster. (Denaturering buffer: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl).
    6. Inkuber gel i neutralisering buffer i 30 min. vask med laves deioniseret vand. Brug nok buffer og vand til at dække gel i skuffen, rotere bakke med neddykket gel på 40 rpm på en orbitalryster. (Neutralisering buffer: 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Overføre DNA til en nylon membran.
    1. Forberede opsætningen for kapillær overførsel af genomisk DNA. Placer en plastik plade (ca størrelsen af gel eller større) over en bakke fyldt med 20 x saltvand-natrium citrat (SSC). Fold et stykke af tyk filtrerpapir over bakken, således at begge dets ender hænger i den videnskabelige Styringskomité. Skære en gel-størrelse stykke af positivt ladede nylon membran Hybond N + og 2 stykker tyk filtrerpapir. (20 x SSC: 3 M NaCl, natriumcitrat 0.3 M).
    2. Forberede den blotting setup (figur 6) ved at placere gel, slots ned på toppen af filtrerpapir på den plastplade. Placer en Hybond N+ membran på toppen, efterfulgt af 2 lag filtrerpapir. Pre våd hvert lag i 20 x SSC før du tilføjer dem til forsamlingen. Sørg for at fjerne eventuelle luftbobler mellem lag som disse hæmmer DNA overførsel.
    3. Dække forsamling med et tykt lag af silkepapir. Placer en plastik plade med en vægt, som en lille flaske på toppen. Kontroller, at presset er ligeligt fordelt over gelen. Dette vil sikre korrekt overførsel af DNA.
      Bemærk: Vægt bør være omkring 200-300 g; tunge vægte hæmmer DNA overførsel.
    4. Dække området omkring den forsamling, herunder udsatte filtrerpapir, med plastfolie (figur 6) for at undgå fordampning af 20 x SSC buffer og målet for kapillær styrker mod nylon membran. DUP natten over.
    5. Markér positionen af slots, navn og/eller dato oven på membranen med blyant, og fjerne membranen fra forsamlingen. Bemærk at den nederste side, der har været i kontakt med gel, bærer DNA.
    6. Umiddelbart lave DNA til membranen af UV-bestråling (2.400 µJ/m2) ved hjælp af en UV-Crosslinker.
      Bemærk: Crosslinking betingelser afhænger af typen af membran bruges.
      Bemærk: på dette tidspunkt membranen kan opbevares ved-20 ° C og anvendes til hybridisering med en sonde senere. Skyl crosslinked membran i 2 x SSC og forsegle det i pre foldet varme-forsegles polyethylen slanger før du placerer det på-20 ° C.
  6. Forbered sondens for hybridisering.
    1. Forstærke sekvens anvendes som sonden for DNA blotting af PCR20. 50-100 ng af et 250 bp-2 kbp PCR fragment er brugt som en sonde. To separate sonder, en hybridizing til højre kant proksimale region og den anden til den venstre kant proksimale region i T-DNA, kan bruges til at vurdere tilstedeværelsen af den hele T-DNA (figur 4A og figur 7).
    2. Fortyndet 50-100 ng af PCR produkt i 24 µL ultrarent deioniseret vand i et reagensglas.
    3. Denaturere det fortyndede PCR produkt ved kogning det i 5 min i et bægerglas med vand eller varme blok, så cool direkte på is.
    4. Tø premade GCT-mix på is. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (alle 0,5 mM), tilfældige hexamers 43.2 ng/µL, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM af β-mercaptoethanol, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6,8, 17 mM MgCl).
    5. Tilføje 21 µL af GCT-mix og 2 U af Klenow fragment PCR-produkt.
    6. Tilføj 2 µL af [32P] ATP til mix og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
      Advarsel: Alle skridt involverer [32P] ATP skal udføres i et miljø, der er udpeget for radioaktivt arbejde mens du bruger en passende beskyttelse.
      Bemærk: Sørg for [32P] ATP er friske (ikke mere end 1 halv-tid har bestået).
    7. Forberede en Sephadex G-50 (grove eller medium) kolonne21 til rensning af mærket sonden fra selskabsform (radioaktive) nukleotider. Tag en 2 mL sprøjte, og dække forretningen med en lille kreds af tyk filtrerpapir. Tilføj 2 mL af Sephadex G-50 opløst i TE ind i sprøjten, og fjerne alle væske fra kolonnen ved spinning.
    8. Placere kolonnen i en 15 mL plastik rør, indlæse mærket sonden på kolonnen og spin ved stuetemperatur (Indstil centrifugen på 750 x g, tillade rpm at øge indtil 750 x g er nået, derefter stoppe centrifugen og give mulighed for rotation til at falde til 0 x g) at eluere sonden. Tilføje 200 µL af TE kolonne og spin at eluere resterende sonden; Gentag én gang. Under disse omstændigheder mærket DNA fragmenter er udelukket fra Sephadex matrix og elueres, mens gratis nukleotider forbliver i kolonnen.
    9. Bruge 300 µL af mærket sonden pr. hybridisering tube. Holde den resterende mærket sonden ved-20 ° C til senere brug. Men husk den halve tid af [32P] ATP på.
  7. Krydse DNA skamplet.
    1. Heat 2 x SSC og hybridisering buffer (15 mL pr. hybridisering tube, højst 2 blots pr tube) til 65 ° C. (Hybridisering buffer: 10% dextran sulfat, 1% SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, opløses ved 65 ° C, holde alikvoter ved-20 ° C).
    2. Før varme hybridisering ovn til 65 ° C.
    3. Placer nylon mesh i en bakke med en lille smule opvarmet (65 ° c) 2 x SSC til at dække bakken. Placer DNA skamplet på toppen af trådnet, med DNA side op. Rul skamplet sammen med trådnet og indsætte rullen i en hybridisering tube. Hæld de overskydende 2 x SSC.
    4. I et microcentrifuge rør, koge 150 µL af laks sæd DNA (koncentration 10 mg/mL) per hybridisering røret i 5 min (Se også trin 4.6.3). Cool straks på isen og tilføje til forvarmet hybridisering bufferen.
    5. Tilføje hybridisering buffer-laks Sperm løsning til røret med skamplet. Pre krydse på 65 ° C i mindst 1 time i et roterende hjul på 12 rpm.
    6. Når præ-inkubation i trin 4.7.5. er næsten færdig, mærket sonden i 5 min. Kog 300 µL (Se også trin 4.6.3) og straks tilføje til skamplet efter inkubation.
    7. Krydse sig natten over i den roterende hjul på 63 ° C, 12 rpm. Ikke afpipetteres sonde direkte på skamplet, men i hybridisering buffer-laks Sperm løsning.
  8. Vaske skamplet.
    1. Forvarm vask løsninger (1 x SSPE, 0,1% SDS og 0,1 x SSPE, 0,1% SDS) til 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7,0).
    2. Afhænde hybridisering løsning og tilføje omkring 100-150 mL af 1 x SSPE, 0,1% SDS løsning til hybridisering rør, lukke røret, og drej i hånden. Hæld hybridisering og vask løsning i den passende flydende radioaktivt affald.
    3. Tilsættes ca 100-150 mL 1 x SSPE, 0,1% SDS løsning til rør, lukke, og Inkuber tube for 15 min til 63 ° C i den roterende hjul, 12 rpm. Kassér vask løsning korrekt.
    4. Tilføje omkring 100-150 mL af 0,1 x SSPE, 0,1% SDS løsning til hybridisering rør, lukke og dreje røret i 5 min på 63 ° C, 12 rpm. Kassér vask løsning korrekt.
    5. Tag skamplet ud af røret og Placer den i en bakke, der indeholder tilstrækkelige forvarmet 0,1 x SSPE, 0,1% SDS og gungre i 3 min. i en rystende vandbad på 65 ° C. I mellemtiden, skyl trådnet i en bakke, fyldt med vand.
    6. Tegne skamplet, placere den i mellem pre foldede plast (polyethylen slanger), omhyggeligt aftørre overskydende væske og lad den skamplet tørre kort. Bemærk, at væsken vil ødelægge skærmbilledet phosphorimager.
    7. Forsegle skamplet i plast på tre sider. Fjerner alle overskydende væske omkring skamplet, og luk den plastikrør ved forsegling den fjerde side. Afbrød overskud af plast. Kontroller den forseglede skamplet ikke er utæt og at Plasten er tør på ydersiden.
  9. Udsætte skærmen phosphorimager.
    1. Placer den lukkede skamplet i et phosphorimager kassettebånd, med phosphorimager skærmen mod DNA af skamplet. Luk kassetten og orlov til ± 2-4 dage, afhængigt af styrken af den radioaktive mærkning og følsomheden af phosphorimager.
    2. Skan phosphorimager skærmen ved hjælp af en phosphorimager. Sørge for at udsætte skærmen så lidt som muligt til lys før scanning. Gemme billedet. Slette skærmen fra signal ved at udsætte den for lys.
  10. Analysere skamplet.
    1. Analysen afhænger den restriktion strategi, der anvendes i trin 4.1. Når du analyserer den skamplet, tilberedt efter strategien vist taktfast 4.1.1.1 (figur 4A), tælle antallet af fragmenter blev fundet. I denne strategi refererer antallet af hybridiserede fragmenter til antallet af T-DNA integrationer.
      1. Sammenligne antallet af fragmenter blev fundet med en sonde til venstre (figur 7B) og højre (figur 7C) del af T-DNA.
        Bemærk: Hvis et forskelligt antal hybridizing fragmenter er opdaget, derefter enten i) flere T-DNA-kopier, (enten i omvendt eller direkte orientering) eller ii) ufuldstændigt integreret T-DNAs er til stede.
      2. Vurdere størrelser af hybridiserede fragmenter på skamplet baseret på størrelsen af markør bands, og sammenligne størrelserne af hybridiserede fragmenter med den forventede fragment størrelser beregnet baseret strategi for begrænsning af tandem indsætninger (figur 4A) identificere mulige tandem arrangement af T-udpegede nationale myndigheder. Bruge figur 4A som en guide til at beregne størrelsen af forventede fragmenter.
        Bemærk: Hvis størrelsen af hybridiserede fragmenter ikke er enig med beregnede dem, sandsynligvis en af de nuværende integrationer er ikke komplet.
    2. Når du analyserer den skamplet, tilberedt efter strategi vist taktfast 4.1.1.2 (figur 4B), anslår størrelsen af det hybridizing fragment på den skamplet, baseret på størrelsen af markør bands, og sammenligne det med den forventede størrelse. En intakt indsættelse udbytter en enkelt fragment med en definerede længde. Enhver afvigelse af den forventede længde angiver ufuldstændige integration (figur 7 d).
  11. Strip skamplet for fornyet hybridisering (valgfrit).
    Bemærk: Den samme skamplet kan blive hybridiseret fortløbende med forskellige sonder. Før du fortsætter med en ny sonde, fratage en tidligere hybridiserede sonde fra skamplet.
    1. Hvis du vil fjerne sonden fra skamplet, placere skamplet i en bakke med dens DNA-side vender nedad. Hæld et overskud på 0,5% SDS i skuffen. Kog membran for 2-5 min. Varigheden af behandlingen afhænger af størrelse og GC-indhold af sonden anvendes. Længere og GC-rigere sonder har brug for en længere behandling.
    2. Efter stripning, krydse skamplet med en anden sonde, eller forsegle og opbevares ved-20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af BIBAC-GW system, blev reporter konstruktioner for at studere ODM i planterne genereret10. Konstruktioner blev designet i Gateway post vektor pENTR-gm12 og indsat i pBIBAC-BAR-GW (figur 1) ved hjælp af Gateway LR rekombination reaktion.

Arabidopsis blev omdannet med pDM19, en BIBAC-BAR-GW plasmid med en mTurquoise-eYFP reporter transporterer en translationel stop codon i rammen eYFP læsning på position 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (figur 2)10. I alt blev 126 Arabidopsis planter transformeret (9 planter pr. pot, 14 Potter). Frøene af disse planter var samlet, sået på bakker med jord, og lov til at vokse til to uger før behandling med ammoniumglufosinat løsning. Kun kimplanter udtrykker bar genet (findes i BIBAC-BAR-GW) overleve ammoniumglufosinat behandling (figur 3). I alt blev der identificeret 11 transgenics omdannet med pDM19, svarende til en transformation effektivitet på 0,02% af frøene analyseret.

For de 11 transgenics isoleret, blev DNA blotting brugt til at bestemme antallet af T-DNA integrationer. Til dette formål, genomisk DNA blev skåret ned med enten BglII eller Scajeg (strategi som udtænkt på figur 4A). Begge disse restriktionsenzymer skæres kun én gang i T-DNA-sekvens (figur 7A). Hybridisering med sonder anerkende bar og eYFP kodende regioner tilladt registrering af antallet af respektive DNA fragmenter.

Antallet af individuelle DNA fragmenter på blots tilladt for estimering af antallet af T-DNA indsættelser i reporter linjer (tabel 1). Enkelt hybridizing fragmenter med både Bar og eYFP sonde angivet tilstedeværelsen af en enkelt T-DNA integration. Fra de 11 transgenics analyseres, gennemført seks enkelt integrationer. Det gennemsnitlige antal integrationer var 1.2.

For 6 linjer bærer en enkelt T-DNA integration, blev integriteten af de indsatte reporter konstruktion testet ved hjælp af DNA blotting (strategi som udtænkt på figur 4B). Genomisk DNA blev skåret med BglII og Pcijeg at frigive en 5,5 kb fragment indeholdende både Bar og mTurquoise-eYFP fusion genet (figur 7A). En sonde mod eYFP blev brugt til at registrere den forventede fragment. Alle planter testet foretaget en intakt fragment. Bemærk, at fragmentet undersøgt udelukker venstre og den højre T-DNA grænse, og derfor undersøge ikke integriteten af hele T-DNA, men kun den del der indeholder transgener af interesse.

Udtryk for det fluorescerende reporter gen blev fastsat i uafhængige enkelt-kopi transgene linjer afviger kun genomisk placeringen af T-DNA. Relative udskrift niveauer af CaMV 35S promotor-drevet mTurquoise-eYFP reporter blev målt ved RT-qPCR i fire DM19 reporter linjer transporterer intakt, enkelt-kopi integrationer som den genomiske holdning var fast besluttet på10. Variationen i reporter gen expression niveauer mellem linjerne var mindre: den maksimale forskel i mTurquoise-eYFP RNA niveauer var 2-fold (figur 8A).

Næste, ODM blev udført i disse reporter linjer. Tre af de fire uafhængige reporter linjer viste noget lignende ODM effektivitetsfordele (fig. 8B). Dog, en linje, DM19 [4] 1, givet en meget lav ODM effektivitet i forhold til de andre linjer. Disse resultater viser, at ODM er påvirket af den lokale genomiske kontekst. På hvilken måde den lokale genomisk forbindelse med T-DNA integration i DM19 [4] 1 afviger fra i de øvrige linjer forbliver kan identificeres. Analyse af tilgængelige datasæt på aktive og inaktive kromatin mærker i genomisk T-DNA integration steder i ikke-transgene planter ikke give et svar10.

Figure 1
Figur 1: funktionelle kort pBIBAC-GW vektorer. pBIBAC-GW derivater er tilgængelige med enten modstand mod glufosinat (bar) eller DsRed fluorescens i frø frakker (DsRed) som udvalg markør i planter. For begge vektorer er et kanamycin resistens gen udvælgelse markør i bakterier. Gateway ccdB kassette er vist mellem grønne pilespidser repræsenterer rekombination sites attR1 og attR2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: mutagenese journalist konstruere. MTurquoise-eYFP reporter gener er drevet af CaMV 35S promotor. MTurquoise kodende region er sammenvoksede til en eYFP kodende region transporterer en C-en mutation på nukleotid position 120, hvilket resulterer i en tidlig translationel stop codon TAA, og for tidlig afslutning af oversættelsen af fusion protein. 3 ' Nopaline Synthase (3' nos) polyadenylation signal bruges til at afslutte transskription af construct22. Nukleare lokalisering signal (NLS) bruges til at målrette de oversatte proteiner til kernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: bakke fyldt med Arabidopsis frøplanter før og efter ammoniumglufosinat behandling. Frøplanter ikke udtrykker bar -genet, som findes i pBIBAC-BAR-GW T-DNA dør efter at være sprøjtet med ammoniumglufosinat løsning. Billederne viser den samme bakke af stiklinger (A) før sprøjtning med ammoniumglufosinat, 14 dage efter såning, og (B) 10 dage senere, efter der sprøjtes to gange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: generelle DNA begrænsning strategi til at identificere antallet og handelsformer af indsat T-DNAs. (A) en begrænsning site (R) i midten af T-DNA tillader uafhængige sondering af venstre (rød L) og højre del af T-DNA (grøn Rasmussen). Tegnefilm til højre viser, at afhængigt af enkelt - eller multi kopi T-DNA integrationer, forskellige banding mønstre er fremstillet med DNA blotting. Bands er markeret med en * har en defineret længde, mens andre bands længde afhænger af på webstedet nærmeste begrænsning i flanken genomisk DNA. Enkelt Indsæt: L og R sonde begge give en uafhængig fragment. Den forventede gennemsnitlige fragment størrelse kan beregnes baseret på hyppigheden af webstedet begrænsning i genomet. Den minimale størrelse er afstanden fra webstedet begrænsning til venstre kant (LB) eller højre kant (RB), afhængigt af hvilken ende af integration er bliver aftestede, og hvis T-DNA'ET er intakt. Tandem repeat: Sonder til L og R give begge to fragmenter; for hver enkelt sonde blandt fragmenterne omfatter flankerende genomisk DNA, det andet fragment har en forventet størrelse og er identificeret ved begge sonder. Inverted repeat: Afhængigt af retningen af den integrerede kassette, kan enten én L og to R fragmenter, eller to L og en R identificeres. Individuelle enkelt indsætninger: Resultatet er en række uafhængige fragmenter, og antallet af fragmenter svarer til antallet af integrationer. (B) softwarebegrænsning websteder i yderpunkterne af T-DNA tillade bestemmelse af integriteten af fragment mellem begrænsning websteder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: et agarosegel med begrænsning mønster og matchende gennemsigtigheden. (A) på agarosegel, genomisk DNA fordøjes med EcoRI er vist. Den ordentlig fordøjelse af DNA er illustreret ved tilstedeværelsen af diskrete satellit bands. (B) mærkning placeringen af slots og markør bands på en gennemsigtighed gør det muligt at senere let beregne størrelsen af hybridizing fragmenter. Her, MRC Holland markører (blå og rød) er anvendt, angives af M. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Setup for kapillær blotting. I en kapillær blotting setup, anbringes filterpapir på en plastik plade med enderne af papiret hængende i 20 x SSC buffer. Papiret er fugtet med 20 x SSC, og en agarosegel, placeret på toppen, efterfulgt af en nylon membran, filtrerpapir og en stak af væv. En letvægts placeres på toppen. Care er taget til at fjerne luftbobler mellem gel, papir og membran. Plastfolie anvendes for at undgå udtørring af opsætningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: eksempel på DNA blotting strategi og eksperimentelle resultat. (A) DNA blotting strategi til at bestemme antallet af og handelsformer af T-DNA integrationer. Skæring placeringer af de valgte restriktionsenzymer inden for T-DNA er angivet med lodrette bjælker. De eYFP og bar sonder anvendes til hybridisering med fordøjet genomisk DNA er angivet ved hjælp af en linje med den terminal prik under T-DNA. (B-D) Eksempel DNA blotting. Genomisk DNA blev skåret med Scajeg og skamplet var probed med både en bar og eYFP sonde (B og C). Genomisk DNA blev skåret med BglII og Pciog aftestede med en bar sonde. Intakt fragmenter er 5,5 kbp i størrelse (D). Bemærk at sættet af prøver i D adskiller sig fra dem, der vises i B og C. * angiver den forventede fragment størrelse; M, markør. I B, C og D anvendes den samme størrelse markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: mTurquoise-eYFP udtryk niveauer og ODM effektivitetsgevinster i uafhængige mTurquoise-eYFP reporter linjer. (A) Relative mTurquoise-eYFP udskrift niveau målt ved RT-qPCR DM19 reporter linjer. For normalisering blev udskrift niveauer af Actin brugt. (B) ODM effektivitet målt i DM19 reporter linjer. For A og B, barer angiver gennemsnittet af mindst fem biologiske replikater. Fejllinjer angive SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Type af T-DNA locus Nr af T-DNA integrationer Reporter linje Antal fragmenter blev fundet Integritet
Akut hjertestop Jeg BGL II BGL II/PciI
bar eYFP bar eYFP eYFP
Enkelt locus integrationer 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2] -5 1 1 1 1 +
1 19 [2] -9 1 1 1 1 +
1 19 [2] -11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
2, inverteret Gentag 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, ufuldstændig integration 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Flere locus integrationer 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND-ikke bestemmes.

Tabel 1: Resumé af DNA blotting data for transgenics isoleret efter transformation med pDM19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritisk til at generere transgenics med enkelt, intakt integrationer af en transgen er valget af den binære vektor, der anvendes. BIBAC familie vektorer har været brugt til at levere sekvenser af interesser mange plante arter23,24,25,26,27,28. BIBAC vektorer, herunder BIBAC-GW, give enkelt-kopi integrationer med høj effektivitet: det gennemsnitlige antal indrykninger pr. linje er 1,5 til 2, i forhold til 3 eller højere for mest almindeligt anvendte binær vektorer5,9, 29. som en stor forbedring i forhold til andre BIBAC vektorer, med BIBAC-GW vektorer, sekvenser af interesse kan nemt indsættes ved hjælp af Gateway rekombination websteder12. De modificerede vektorer overvinde de generelle problemer med BIBAC vektorer når de anvendes i konventionelle kloning strategier: i) et meget begrænset antal unikke begrænsning websteder og ii) en lav DNA udbytte. Gateway rekombination websteder gør BIBAC-GW vektorer et attraktivt alternativ til andre binære vektorer for at skabe transgene planter.

Her er en række protokoller, genererer BIBAC-GW derivater indeholdende sekvenser af interesse, for at plante transformation og DNA duppes analyse for antallet og handelsformer af transgene sekvenser beskrevet. Flere af protokollerne, rapporterede i dette papir, Gateway kloning, elektroporation af bakterier og plante transformation, er almindelig praksis i mange laboratorier og kan også gennemføres med mindre ændringer. Det er vigtigt at vide, at BIBAC-GW er en enkelt-kopi vektor i E. coli og A. tumefaciens. Derfor, når isolere DNA, udbyttet er lavt; Det anbefales at skalere op proceduren isolation.

I transgenics bærer flere T-DNA integrationer, indførte transgener udsættes ofte for genhæmning1,2,4,30, og bør derfor for de fleste applikationer undgås. For at identificere transgene planter med enkelt, intakt integrationer, anbefales det at bruge DNA skamplet analyse. Mens andre metoder end DNA blotting kan anvendes til bestemmelse af T-DNA kopi nummer og integritet af T-DNAs i transgene linjer (segregation analyse, hale-PCR, kvantitativ PCR (qPCR) og digital droplet PCR), selv om labor intensiv, DNA blotting er ofte den foretrukne metode. Segregation analyse er ikke i stand til at skelne mellem flere og single T-DNA integrationer på enkelt loci. HALE-PCR ofte under skøn kopien nummer, især hvis mere end én T-DNA integration er nuværende31, og qPCR behov udarbejde optimering for pålidelige resultater31,32. Digital dråbe PCR er en temmelig præcis metode til kopi nummer påvisning, hvis det nødvendige udstyr er tilgængelige31. Den ekstra fordel af DNA blotting er letkøbt påvisning af trunkerede T-DNAs, som er let savnet i alle PCR-baserede teknikker.

Med DNA skamplet analyse skal de hybridizing fragmenter på skamplet godt kan identificeres i signal og størrelse. Flere faktorer er kendt for at påvirke resultatet af DNA blotting. Ud over et passende udvalg af restriktionsenzymer (strategi fremgår af figur 4) og størrelse markører, tilstrækkelig DNA af god kvalitet er nødvendige. Mindre end 2 µg af genomisk Arabidopsis DNA vil ikke give godt identificerbare fragmenter. Når der beskæftiger sig med større genomer, er flere DNA påkrævet. For at opnå tilstrækkelige mængder af Arabidopsis DNA, kan floral væv eller 1 - uge gamle planter bruges. Et parti af planter dyrket på en petriskål udbytter 2 – 8 µg af DNA. For at undgå DNA forringelse under isolering, bør pleje tages til at behandle det hurtige plantemateriale. Derudover genomisk DNA bør genopslemmes i Tris-EDTA reducere dets nedbrydningsprodukter af nukleaser og opbevares ved 4 ° C snarere end-20 ° C til at forhindre DNA nicking skulle gentages frysning-optøning cyklusser. Hvis du er usikker at alle DNA-prøver er fordøjet helt, foreslås det for at rehybridize DNA skamplet med en sonde anerkende en endogen, unikke genomisk region. Når du vælger sonde sekvenser til at identificere transgene eller endogene sekvenser, er det afgørende at kun vælge unikke sekvenser. For at være i stand til præcist bestemme størrelsen af hybridiserede fragmenter, holdninger af DNA gel slots og DNA markør bands skal være mærket på en transparent (figur 5B) når visualisere en ethidiumbromid-farvede gel (figur 5A) på et UV transilluminator. I tilfælde af markør sekvenser ikke krydse sig med sonden DNA, eller hybridisering er delvis, er det den eneste måde at spore ned på størrelse med hybridizing fragmenter.

Når pleje er taget til at opnå god hybridisering signal og skøn over fragment størrelse, er fortolkningen af blotting resultaterne ligetil. Når ved hjælp af kun én begrænsning enzym, og hybridizing med forskellige sonder påvisning af enten den venstre eller højre del af T-DNA, afspejler antallet af fundne fragmenter antallet af T-DNA indsættelser. For eksempel, figur 7B, C viser den samme DNA skamplet, hybridiseret med forskellige sonder, bar (figur 7B) og forbedrede gul fluorescerende proteiner (eYFP) (figur 7C), ved hjælp af den strategi, der er vist i figur 7A. Alle baner, undtagen 4, Vis et lige stort antal fragmenter på begge blots: to fragmenter til linje 6 og en enkelt fragment for alle andre linjer. Antallet af fundne fragmenter er antallet af T-DNA indsættelser.

Når antallet af fragmenter blev fundet med sonder bindende enten venstre eller højre del af T-DNA adskiller sig (som i figur 7BC, linje 4), enten ufuldstændige indsættelser er til stede, eller T-DNAs har indsat i tandem arrangement. Tandem indsætninger vise ikke-tilfældige fragment længde for et af T-DNA fragmenterne (figur 4A, højre panel) og kan identificeres ved at sammenligne størrelsen hybridiserede fragment med hvad der forventes baseret strategi for begrænsning. En yderligere blotting strategi kan være nødvendigt at bekræfte arrangementet tandem T-DNA indsætninger. I eksemplet vist på linje 4 (figur 7B, C), er to indsættelser arrangeret i et inverted repeat orientering.

Når estimering handelsformer et T-DNA, eller en del af det, kan længden af det hybridizing fragment beregnes baseret strategi for begrænsning. Enhver afvigelse fra den forventede størrelse indikerer tilstedeværelsen af en ufuldstændig indsættelse. For eksempel, i figur 7 dtrækker i lane 4, en hybridizing fragment på 8 kbp, (i stedet for den forventede 5,5 kbp) med angivelse af et større fragment størrelse på grund af manglende begrænsning steder.

BIBAC-GW vektorerne er fremragende værktøjer til generering af enkelt-kopi intakt integrationer i en række plantearter. Protokollen rapporteret her giver en pålidelig procedure for at identificere planter med enkelt, intakt integrationer af en transgen af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskning er støttet af den hollandske teknologi Foundation STW (12385), som er en del af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO), og som er delvis finansieret af Ministeriet for økonomiske anliggender (OTP Grant 12385 til MS).  Vi takker Carol M. Hamilton (Cornell University, USA) for at give pCH20, rygraden i BIBAC-GW vektorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Tags

Genetik sag 133 binære vektor BIBAC Gateway kompatible binære vektor plante transformation enkelt integration genhæmning DNA blotting sydlige blotting
Generering af transgene planter med enkelt-kopi indrykninger ved hjælp af BIBAC-GW binære vektor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter