Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.

Abstract

Bij het genereren van transgene planten, in het algemeen is het doel is om stabiele uitdrukking van een transgenic. Dit vereist een enkele, intact integratie van de transgenic, zoals multicopy integraties vaak aan gene zwijgen onderworpen zijn. De Gateway-compatibele binaire vector gebaseerd op bacteriële kunstmatige chromosomen (pBIBAC-GW), zoals andere derivaten van pBIBAC, kan het inbrengen van single-kopie transgenen met een hoog rendement. Als een verbetering van de oorspronkelijke pBIBAC, heeft een Gateway-cassette gekloond in pBIBAC-GW, zodat de sequenties van belang nu worden gemakkelijk in de overdracht van de vector DNA (T-DNA) door Gateway klonen opgenomen kunnen. Algemeen, de transformatie met pBIBAC-GW leidt tot een efficiëntie van 0,2 – 0,5%, waarbij de helft van de transgenics dragen een intact integratie van de enkel-kopie van T-DNA. De pBIBAC-GW vectoren zijn beschikbaar met weerstand tegen glufosinaatammonium of DsRed fluorescentie in zaad jassen voor selectie in planten en weerstand tegen kanamycine als een selectie in bacteriën. Hier, een reeks van protocollen die de lezer door het proces leiden van het genereren van transgene planten met behulp van pBIBAC-GW is gepresenteerd: vanaf samenvoegen van de sequenties van belang in de pBIBAC-GW vector van keuze, te planten transformatie met Agrobacterium, selectie van de transgenics, en het testen van de planten naar INTACTHEID en kopie van de tussenvoegsels gebruikend DNA bevlekken. Aandacht besteed aan het ontwerpen van een strategie voor het Bevlekkende van DNA om te herkennen van single - en multi - kopie integraties op enkelvoudige en meervoudige loci.

Introduction

Bij het genereren van transgene planten, meestal is het doel is om de geïntegreerde transgene(s) stabiel uitgedrukt. Dit kan worden bereikt door intact één exemplaar integraties van een transgenic. Meerdere integraties kunnen leiden tot verhoogde uitdrukking van een transgenic, maar ook gene zwijgen. Zwijgen van transgenen is meer waarschijnlijk als ingevoegde sequenties zijn gerangschikt in tandem of omgekeerde herhalingen1,,2,,3,4. Binaire vectoren worden gebruikt als shuttles in Agrobacterium-gemedieerde transformatie experimenten te leveren van de sequenties van belang in bedrijf genomen. Het aantal integraties in het genoom van een plant is afhankelijk van het exemplaaraantal van de binaire vector in Agrobacterium tumefaciens5,6. Veel gebruikte binaire vectoren zijn hoge kopiëren vectoren, en daarom een hoge gemiddelde transgenic exemplaaraantal opleveren: 3.3 tot en met 4.9 exemplaren in Arabidopsis5.

Het aantal T-DNA integraties kan worden verlaagd met behulp van binaire vectoren hebben een lage exemplaaraantal in A. tumefaciens, zoals BIBAC7, of door de lancering van een T-DNA van de A. tumefaciens chromosoom5. Het gemiddelde aantal transgenic integraties in dergelijke gevallen lager is dan 25,-8,-9,10. Te wijten aan één-kopie in A. tumefaciens, en ook in Escherichia coli, BIBAC-derivaten kunnen onderhouden en leveren van constructies zo groot als 150 kb11.

GW-compatibele BIBAC vectoren10,12 kunnen gemakkelijk binnenbrengen van genen van belang: de vector met Gateway klonen. Het gebruik van Gateway technologie vereenvoudigt de klonen procedure, maar overwint ook gemeenschappelijke problemen in verband met grote lage exemplaaraantal vectoren13,14, zoals een lage opbrengst van DNA en een beperkte selectie van unieke beperking sites beschikbaar voor het klonen van de7,11. De pBIBAC-GW-derivaten zijn beschikbaar met hetzij weerstand tegen glufosinaatammonium (pBIBAC-BAR-GW) of DsRed fluorescentie in zaad jassen (pBIBAC-RFP-GW) voor selectie in planten (Figuur 1)10,12. Voor beide vectoren, wordt een kanamycine resistentie gen gebruikt als de markering van selectie bij bacteriën.

De pBIBAC-GW vectoren combineren: (1) gemakkelijk design en genetische manipulatie in E. coli, en (2) intact single-kopie integraties in planta op hoog rendement. Het rendement van de vectoren pBIBAC-GW op gemiddeld 1,7 integraties in Arabidopsis met ongeveer de helft van de transgene planten dragen een honkslag geïntegreerd T-DNA10.

Stabiele uitdrukking van transgenen is een vereiste voor de meeste transgenics gegenereerd. Stabiele transgenic expressie kan worden bereikt door intact, single-kopie integraties. Werken met transgene planten intact, single-kopie integraties uitvoering is echter nog belangrijker als bijvoorbeeld het doel is om de efficiëntie van chromatine gebaseerde processen, zoals mutagenese, recombinatie, of reparatie en de afhankelijkheid van deze studie processen op de genomic locatie en de structuur van de chromatine op de site van de invoegpositie. Voor ons belang, om te bestuderen van de afhankelijkheid van oligonucleotide geregisseerd mutagenese (ODM) op de lokale genomic context, was een reeks van verslaggever lijnen met intact, single-kopie integraties van een gen mutagenese verslaggever gegenereerde (Figuur 2)10. Met deze set van regels, werd aangetoond dat de efficiëntie ODM varieert tussen transgene loci geïntegreerd op verschillende genomic locaties, ondanks de transgenic expressie niveaus vrij gelijkaardig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. het invoegen van sequenties van belang in binaire Vector

  1. De ingang van de Gateway en de binaire vectoren te bereiden.
    1. Isoleren van de vector van de Gateway item met een fragment van DNA of gen van belang met behulp van een mini prep kit volgens de suggesties van de leverancier.
      Opmerking: BIBAC-GW vectoren vereisen het gebruik van kanamycine (Km) voor selectie in bacteriën, daarom, een vector vermelding gebruiken met een andere weerstand marker in plaats van kanamycine. Bijvoorbeeld, is de pENTR-gm-vector, uitvoering een gentamicine resistentie gen, een goede keuze12.
    2. Uitdragen en isoleren van de BIBAC-GW vector van belang. Gebruik een E. coli -stam die resistent is tegen de toxiciteit van de ccdB gen aanwezig binnen de Gateway-cassette. Isoleren BIBAC-vectoren met behulp van protocollen of kits speciaal ontworpen voor grote plasmiden volgens de suggesties van de leverancier.
  2. Verrichten van een Gateway-reactie.
    1. Bereiden de LR recombinatie reactie volgens de suggesties van de leverancier. Meng de volgende onderdelen in een tube microcentrifuge 1,5 mL bij kamertemperatuur (RT): 100-300 ng post kloon (supercoiled), 300 ng van BIBAC-GW vector, LR Clonase reactie buffer (eindconcentratie: 1 x). Stel het volume van het mengsel 16 µL met TE (10 mM Tris, 1 mM van EDTA, pH 8,0). Ten slotte voeg 4 µL van LR Clonase enzym mix, en meng door vortexing. Incubeer het mengsel bij 25 ° C gedurende 1 uur.
    2. Het beëindigen van de LR-reactie door 2 µL van proteïnase K-oplossing (2 µg/µL) toe te voegen aan het mengsel bereid in stap 1.2.1. Meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
  3. Tover E. coli met het reactiemengsel Gateway door electroporation.
    1. Desalt het reactiemengsel LR vóór electroporation.
      Opmerking: Deze stap is cruciaal voor succesvolle electroporation. Hieronder een dialyse methode is beschreven, maar andere methoden zoals precipitatie met natriumacetaat en ethanol kan ook worden gebruikt.
      1. De installatie voorbereiden filter dialyse van de LR-reactie. 20 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water giet in een steriele petrischaal. Plaats een membraan filter schijf (porie grootte = 0,025 µm) op het wateroppervlak.
      2. Pipetteer van de gehele LR reactie zorgvuldig op de top van het membraan en laat het mengsel gedurende 1 uur bij RT dialyze.
    2. Toevoegen 5 µL van de desalted LR mix electro-bevoegde DH10B cellen in een cuvet electroporation (0,1 cm). Electroporate de cellen (1,5 V/cm, weerstand 200 Ω, capaciteit 25 µF), en 1 mL voorverwarmde Super optimale omzettingsproducten onderdrukking (SOC) medium onmiddellijk toe te voegen aan de cellen, gevolgd door incubatie bij 37 ° C voor 45 min, 180 rpm. (SOC medium, 1 L: 20 g Bacto trypton, 5 g gist extract, 0,5 g NaCl, 2,5 mL 1M KCl, 20 mL van de 1 M filter-gesteriliseerd Glucose).
      Opmerking: DH10B cellen kunnen worden vervangen voor andere cellen van E. coli die grote plasmiden stabiel te houden.
      Opmerking: De optimale electroporation voorwaarden zijn afhankelijk van het apparaat van de electroporation gebruikt.
    3. Pellet bacteriën bij maximumsnelheid voor 30 s met behulp van een microcentrifuge, Verwijder overtollige SOC en resuspendeer de pellet in ongeveer 50-100 µL van Luria Bertani (LB) medium. Verspreiding van de bacteriën op kanamycine-LB (Km-LB) platen (Km concentratie, 40 µg/mL) en Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts. (LB medium, 1 L: 10 g Bacto trypton, 5 g gist extract, 10 g NaCl. Voor vast medium toevoegen agar, 15 g/L).
  4. Identificeren van het gerecombineerde BIBAC-GW-derivaten en plasmide DNA te isoleren.
    1. Om te kunnen groeien op Km-LB platen, moeten de E. coli -cellen bevatten het gerecombineerde plasmide van BIBAC-GW waarin de ccdB -reeks is vervangen door de gewenste invoegen. Kolonie Polymerase Chain Reaction (PCR)15 gebruiken om te controleren als de bacteriën kolonies op de plaat de juiste plasmiden bevatten, hebben de BIBAC-GW backbone en het invoegen van belang.
      1. Ter identificatie van de pBIBAC-BAR-GW ruggengraat, het uitvoeren van een PCR15 reactie met de inleidingen DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 "en DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3". Deze primer set versterkt een 563 bp fragment van de bar -gen.
      2. Om te controleren op de aanwezigheid van de ruggengraat BIBAC-RFP-GW, het uitvoeren van een PCR15 reactie, met behulp van primers M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 "en M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3". Deze primer combinatie versterkt een 791 bp fragment overlapping van de promotor en rfp -reeks van cruciferin.
      3. Uitvoeren van PCR15 reacties met behulp van gen-specifieke primers te controleren op de aanwezigheid van het invoegen van belang.
    2. Een enkele positieve kolonie in 2 – 5 LB opslagmedium met kanamycine (40 µg/mL) voor DNA isolatie16mL beënten. Incubeer bij 37 ° C op een roteerschudapparaat 180-rpm 's nachts.
    3. Het plasmide DNA te isoleren (zie stap 1.1.2).

2. voorbereiding van A. tumefaciens Floral onderdompelen van Arabidopsis

  1. BIBAC-GW derivaten aan A. tumefacienstransformeren.
    1. Bereiden electro-bevoegde cellen van A. tumefaciens stam C58C1 uitvoering van de pCH32 helper plasmide7. Bacteriën in aanwezigheid van tetracycline (5 µg/mL) en rifampicine (100 µg/mL) te selecteren voor pCH32 en op de groei van alleen Agrobacterium cellen groeien.
    2. Toevoegen van 0,25 – 0,5 µg DNA van een afgeleide van de pBIBAC-GW, vooraf in 10 – 20 µL steriele ultrazuiver gedeïoniseerd water opgeloste naar 20 µL bevoegde Agrobacterium cellen in electroporation cuvettes (0,1 cm). Houd cellen op ijs.
    3. Electroporate de cellen (1,5 V/cm, weerstand 400 Ω, capaciteit 25 µF). Onmiddellijk na electroporation, voeg 1 mL voorverwarmde (28 ° C) SOC medium aan de bacteriën en Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 60-90 min.
    4. Verspreiden van 100 µL en de rest van de bacteriën op afzonderlijke LB platen met kanamycine (40 µg/mL), rifampicine (100 µg/mL) en tetracycline (5 µg/mL) en incubeer in het donker bij 28 ° C gedurende 1-2 dagen.
  2. Maak de Agrobacterium suspensie.
    1. Controleren door PCR een paar van de A. tumefaciens kolonies van de plaat bereid in stap 2.1.4, voor de aanwezigheid van de juiste vector (zie stap 1.4.1).
    2. Streep een één kolonie bevestigd te bevatten van de binaire vector met de juiste invoegen op een LB-plaat met antibiotica (zie stap 2.1.4). Groeien bij 28 ° C's nachts.
    3. Herhaal de strepen met een één kolonie in stap 2.2.2 verkregen.
    4. Inoculeer een één kolonie in 2.5 mL LC voedingsbodem aangevuld met antibiotica (zie stap 2.1.4) voor preculture. Incubeer bij 28 ° C gedurende ten minste 8 uur of 's nachts, bij 180 t/min. (LC medium, 1 L: 10 g Bacto trypton, 5 g gist extract, 0,5 g NaCl, 2,5 g van MgSO4 · 7 H2O, 2 g Maltose).
    5. De preculture uit stap 2.2.4 toevoegen. tot 250 mL LC aangevuld met antibiotica (zie stap 2.1.4) en groeien bij 28 ° C, 180-rpm 's nachts.
    6. Pellet de cultuur door spinnen bij 5.500 x g gedurende 12 min. resuspendeer de pellet in 100 mL oplossing 5 gewichtspercenten sacharose, 0.05% Silwet L-77, 0,5 x MS. Pour de schorsing in een steriele container voor floral dompelen van de planten.

3. Arabidopsis transformatie

  1. Bereiden de Arabidopsis planten voor transformatie.
    1. Arabidopsis planten groeien in een kas of klimaat gecontroleerde groei kamer totdat ze zijn bloei (12 potten met 9 planten per dompelen).
    2. Illustraties van de eerste bouten zodat meer secundaire bouten naar voren. Planten zijn klaar voor het dompelen van 4 – 6 dagen na knippen, wanneer de planten veel onrijpe bloemknoppen en niet veel hebben siliques bevrucht.
  2. Floral dompelen
    1. Dompel bloeiwijzen voor 5-10 s in Agrobacterium suspensie bereid in stap 2.2.6. Gebruik zachte agitatie.
    2. Wikkel de bovengrondse delen van de planten in cling film te houden van de hoge luchtvochtigheid, en betrekking hebben op de potten van de plant met een doos te houden van de planten in het donker. Incubeer de planten voor 2 dagen in een zaal van broeikasgassen/groei.
    3. Verwijder het vak en de zelfklevende film en de planten groeien naar volwassenheid in een zaal van broeikasgassen/groei.
      Opmerking: Het vergroten van de efficiëntie van transformatie, de dezelfde planten kunnen worden opnieuw gedimde 7 dagen na de eerste dompelen.
    4. De zaden oogst. Bundelen en analyseren van de zaden (T1) van planten, getransformeerd met de dezelfde constructie, als een enkele set.
  3. Scherm voor transgene planten.
    1. Analyseren om te screenen op transgene planten getransformeerd met een afgeleide van de pBIBAC-RFP-GW, de zaden met behulp van fluorescentie microscopie. Oog op de opsporing van DsRed expressie in zaad jassen, het imago van de zaden in een excitatie van 560 nm en emissie van de 600-650 nm. De fluorescerende zaden te scheiden van niet-belichting fluorescerende tegenhangers met pincet.
    2. Om te screenen op transgene planten getransformeerd met een afgeleide van de pBIBAC-BAR-GW, zaaien in bakjes gevuld met bodem (~ 2500 zaden/0,1 m2). Om ervoor te zorgen een zelfs verspreiding van zaden over dienbladen, schorten zaden in 0,1% agar in 0,5 x Murashige Skoog medium (MS), en verspreiden de zaden met behulp van een precisiepipet 1 mL.
      Opmerking: Om de zaden te ontkiemen op synchrone wijze te stimuleren, de zaden Incubeer gedurende ten minste 2 dagen bij 4 ° C. Dit kan worden gedaan vóór of na het zaaien de zaden.
      1. Spray de zaailingen met 0,5% glufosinaatammonium oplossing 2 weken en 3 weken na het zaaien in bakken. Gebruik 500 mL glufosinaatammonium oplossing per 1 m2.
      2. Overlevende zaailingen overbrengen naar afzonderlijke potten. Een typisch beeld van een lade met zaailingen voor en na (tweede) glufosinaatammonium behandeling zijn afgebeeld in Figuur 3.
      3. Analyseren van de tot-ammonium-resistente planten door PCR voor de aanwezigheid van de constructie van belang (zie stap 1.4.1. voor inleidingen).
        1. Het DNA van genomic plant voor PCR methode beschreven door Edwards et al. isoleren 17

4. karakterisering van Transgenics voor het aantal en de integriteit van T-DNA integraties

  1. Strategie van de spijsvertering van de beperking
    Opmerking: Bepaal het aantal T-DNA integraties en hun integriteit door DNA bevlekken met behulp van restrictie-enzymen. Deze methode maakt het mogelijk om het identificeren van één, maar ook herhaald integraties op de dezelfde of andere loci in het genoom.
    1. Gebruik een aantal van de spijsvertering van de beperking te identificeren van de verschillende integratie-patronen mogelijk:
      1. Selecteer een enzym dat eenmaal in het midden van de T-DNA snijdt, om zelfstandig sonde sequenties bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts van de beperkingsplaats (figuur 4A en Figuur 7A-C) te kunnen. Zie figuur 4Aen de legende van de figuur voor de verwachte resultaten en de interpretatie.
      2. Selecteer een enzym of combinatie van enzymen uitsnijden van de gehele opeenvolging van belang tegelijk (figuur 4B en figuur 7A-D). Elke afwijking van de bekende lengte geeft truncatie van de geïntegreerde cassette.
        Opmerking: zorg voor alleen gebruik maken van de enzymen van de beperking die niet gevoelig zijn voor cytosine methylering.
  2. Bereiden de genomic DNA-monsters.
    1. Isoleer genomic DNA uit planten die de constructie van belang. Een CTAB DNA miniprep methode kan worden gebruikt voor DNA isolatie18. Voor DNA analyse van Arabidopsis DNA van de vlek, 2 – 2,5 µg genomic DNA is nodig. Het DNA in 50 µL van TE ontbinden.
    2. Controleer de integriteit van DNA door gel elektroforese16. Intact genomic DNA migreert als een discrete band aan de bovenkant van de gel. Aantasting van het DNA kan worden herkend als de aanwezigheid van een uitstrijkje. Om te voorkomen dat DNA-schade als gevolg van herhaalde bevriezen-ontdooien, worden genomic DNA-monsters bewaard bij 4 ° C.
    3. Verteren de genomic DNA (2-2,5 µg in het geval van Arabidopsis genomic DNA) in een totaal volume van 50 µL, 's nachts, buffer voorwaarden voorgesteld door het enzym leverancier gebruiken.
      1. Meng in een reageerbuis, 2 – 2,5 µg Arabidopsis genomic DNA, 5 µL 10 x beperking buffer en 5 U restrictie-enzym in een totaal van 50 µL ultrazuiver gedeïoniseerd water.
    4. Laden kleurstof (1 x eindconcentratie) toevoegen aan de beperking monsters vóór het laden op een gel. Voor goede visuele volgen, gebruik een van de volgende: comigrating met kleine fragmenten (Bromophenol blauw, 350 – 400 bp), of comigrating met grotere fragmenten (Cylene cyanol, 3-4 kbp).
  3. Stel de DNA-gel.
    1. Een lange (20 cm) 0,5 x TBE agarose gel19voor te bereiden. Het percentage van agarose in de gel, is afhankelijk van de grootte van de fragment verwacht. 0,8-1% optimaal scheidt fragmenten > 1 kb in grootte. 1 – 1,5% agarose gebruiken voor fragmenten < 1 kb. Voeg geen Ethidium Bromide aan de gel. (5 x TBE, 1 L: 54 g van Trizma baseren, 27.5 g boorzuur, 3,75 g EDTA).
      Opmerking: Om te voorkomen dat besmetting van DNA, gebruik gel laden dat niet gewend bent aan het fractionate van de plasmide en PCR vergroot DNA.
    2. Laden van de monsters op gel19.
    3. DNA-merkers aan de gel die in het bereik van de grootte van de verwachte fragmenten toevoegen. Laden van ongeveer 1 µg marker (50-250 ng van verschillende grootte fragment) op de gel om visualisatie onder UV licht.
    4. Grootte-fractionate het DNA op een laagspanning (40-50 V/500 mA) 's nachts.
  4. Overdracht van het DNA van het agarose gel naar het nylon membraan voorbereiden.
    1. De gel overbrengen in een aparte lade en vlek het gedurende 20-25 min. in 0,5 x TBE met Ethidium Bromide (5 µg/mL) door het draaien van 40 toeren per minuut op een roteerschudapparaat.
    2. Visualiseren van de gel op een UV-transilluminator. Controleer of de scheiding van de grootte van de genomic DNA, met inbegrip van de zichtbaarheid van afzonderlijke satelliet bands (figuur 5A). Een uitstrijkje naar lager molecuulgewicht maten geeft aan DNA afbraak.
    3. Leg een transparantie over de gel op de UV-transilluminator, en de positie van de "slots" en de marker bands markeren met een viltstift (figuur 5B). Dit vergemakkelijkt het bepalen van de grootte van de gehybridiseerde fragmenten later in het geval dat de marker sequenties doen niet kruisen specifiek met de sonde DNA. Door het aangeven van de fragmenten van de markering bij deze stap, is het mogelijk om bij te houden van de grootte van de hybridizing fragmenten.
    4. Plaats de gel terug in de lade, met ultrazuiver gedeïoniseerd water afspoelen, en het onderdompelen in 0,25 M HCl voor 15 min te fragmentize het DNA binnen de gel. Wassen met ultrazuiver gedeïoniseerd water. Gebruik voldoende water en HCl ter dekking van de gel in de lade, en draai de lade, met de verzonken gel van 40 toeren per minuut op een roteerschudapparaat.
    5. Incubeer de gel in denaturatie buffer voor 30 min. Wash met ultrazuiver gedeïoniseerd water. Gebruik voldoende water en buffer ter dekking van de gel in de lade en draaien van de lade, met de verzonken gel van 40 toeren per minuut op een roteerschudapparaat. (Denaturatie buffer: 0,5 M NaOH, 1.5 M NaCl).
    6. Incubeer de gel in de neutralisatie buffer voor 30 min. Wash met ultrazuiver gedeïoniseerd water. Gebruik genoeg buffer water en dekking van de gel in de lade te draaien van de lade, met verzonken gel van 40 toeren per minuut op een roteerschudapparaat. (Neutralisatie buffer: 0.5 M Tris, 1.5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Het DNA overbrengen in een nylon membraan.
    1. Bereid de installatie voor capillaire overdracht van de genomic DNA. Plaats een kunststof plaat (ongeveer de grootte van de gel of groter) boven een lade gevuld met 20 x saline-Natriumcitraat (SSC). Vouw een stukje dikke filtreerpapier over de lade, zodat beide uiteinde zijn opknoping in de wetenschappelijke stuurgroep. Snij een stuk gel middelgrote positief geladen nylon membraan Hybond N +, en 2 stuks dikke filtreerpapier. (20 x SSC: 3 M NaCl, Natriumcitraat 0,3 M).
    2. Bereiden de Bevlekkende setup (Figuur 6) door het plaatsen van de gel, "slots" naar beneden op de bovenkant van het filtreerpapier op de kunststof plaat. Plaats een Hybond N+ membraan op de top, gevolgd door 2 lagen filtreerpapier. Vooraf NAT elke laag in 20 x SSC voordat u deze toevoegt aan de vergadering. Zorg ervoor dat alle luchtbellen tussen lagen verwijderen als deze de DNA-overdracht belemmeren.
    3. Dekking van de vergadering met een dikke laag van papieren zakdoekje. Plaats een kunststof plaat met een gewicht, zoals een klein flesje, op de top. Zorg ervoor dat de druk is gelijk verdeeld over de gel. Dit garandeert een goede overdracht van het DNA.
      Opmerking: Het gewicht moet ongeveer 200-300 g; zware gewichten belemmeren de DNA-overdracht.
    4. Betrekking hebben op de omgeving van de vergadering, met inbegrip van blootgestelde filtreerpapier, met zelfklevende film (Figuur 6) om te voorkomen dat de verdamping van de 20 x SSC buffer en target die de capillaire naar de nylon membraan krachten. Blot's nachts.
    5. Markeer de positie van de "slots", naam en/of datum op de top van het membraan met potlood, en verwijder het membraan van de vergadering. Merk op dat de onderzijde die al in contact met de gel, draagt het DNA.
    6. Onmiddellijk vast het DNA aan de membraan door UV-bestraling (2.400 µJ/m2) met behulp van een UV-Crosslinker.
      Opmerking: Crosslinking voorwaarden afhankelijk van het soort membraan gebruikt.
      Opmerking: op dit punt het membraan kan worden opgeslagen bij-20 ° C en later gebruikt voor hybridisatie met een sonde. Spoel de kruisverwijzende membraan in 2 x SSC en zegel het gevouwen in pre heat-sealable polyethyleen slang alvorens het bij-20 ° C.
  6. Bereiden de sonde voor hybridisatie.
    1. Versterken de volgorde moet worden gebruikt als de sonde voor DNA door PCR20bevlekken. 50-100 ng van een 250 bp-2 kbp PCR fragment wordt gebruikt als een sonde. Twee aparte sondes, een kwekers op de rechterrand proximale regio en de andere op de proximale regio van de linkerrand van het T-DNA, kunnen worden gebruikt ter beoordeling van de aanwezigheid van de hele T-DNA (figuur 4A en Figuur 7).
    2. Verdun 50-100 ng van PCR product in 24 µL van ultrazuiver gedeïoniseerd water in een reageerbuis.
    3. Het denatureren van de verdunde PCR-product door het koken voor 5 min in een bekerglas van water of warmte blok, dan koel direct op ijs.
    4. Ontdooi premade GCT-mix op ijs. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (alle 0,5 mM), willekeurige hexamers 43.2 ng/µL, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM van β-mercaptoethanol, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6.8, 17 mM MgCl).
    5. 21 µL van de GCT-mix en 2 U van Klenow fragment toevoegen aan het PCR-product.
    6. 2 µL van [32P] ATP toevoegen aan de mix en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
      Let op: Alle stappen waarbij [32P] ATP moeten worden uitgevoerd in een omgeving die aangewezen voor radioactieve werk tijdens het gebruik van de gepaste bescherming.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de [32P] ATP is verse (niet meer dan 1 helft van de tijd is verstreken).
    7. Voorbereiden op een Sephadex G-50 (grof of middellange) kolom21 zuiveren van de gelabelde sonde van designated (radioactieve) nucleotiden. Neem een 2 mL spuit, en dekking van de uitlaat met een kleine kring van dikke filtreerpapier. Voeg 2 mL Sephadex G-50 opgelost in TE in de spuit, en alle vloeistof uit de kolom verwijderen door spinnen.
    8. Plaats van de kolom in een plastic tube van 15 mL, de gelabelde sonde op de kolom te laden en draaien op kamertemperatuur (de centrifuge vastgesteldop 750 x g, toestaan de rpm te verhogen tot 750 x g is bereikt, dan stoppen de centrifuge en toestaan dat de rotatie te dalen tot 0 x g) te elueren de sonde. 200 µL voor TE voegen aan de kolom en de spin naar elueer de resterende sonde; eenmaal herhaald. In deze omstandigheden, met labels DNA-fragmenten zijn uitgesloten van de Sephadex matrix en elueer, terwijl gratis nucleotiden in de kolom blijven.
    9. Gebruik 300 µL van de gelabelde sonde per kruising buis. Houd de resterende gelabelde sonde bij-20 ° C voor later gebruik. Echter Houd de helft van de tijd van [32P] ATP in gedachten.
  7. De DNA-vlek te vermengen.
    1. Serie 2 x SSC en kruising buffer (15 mL per kruising buis, maximaal 2 blots per buis) tot 65 ° C. (Kruising buffer: 10% dextran (II) sulfaat, 1% SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, ontbinden bij 65 ° C, aliquots bij-20 ° C te houden).
    2. Verwarm de oven voor hybridisatie tot 65 ° C.
    3. Nylon gaas plaats in een lade met een beetje verwarmd (65 ° C) 2 x SSC ter dekking van de lade. Plaats de DNA-vlek op de top van de Maas, met de DNA-kant boven. Rol van de vlek samen met de Maas en het broodje invoegen een kruising buis. Giet af de overtollige 2 x SSC.
    4. In een microcentrifuge buis, kook 150 µL van zalm sperma DNA (concentratie 10 mg/mL) per kruising buis gedurende 5 minuten (Zie ook stap 4.6.3). Koel onmiddellijk af op ijs en toevoegen aan de voorverwarmde hybridisatie buffer.
    5. Voeg de kruising buffer-zalm sperma oplossing aan de buis met de vlek. Vooraf bij 65 ° C gedurende ten minste 1 uur in een roterend wiel, 12 rpm te vermengen.
    6. Wanneer de pre-incubatie in stap 4.7.5. is bijna klaar, kook 300 µL van de gelabelde sonde voor 5 min (Zie ook stap 4.6.3) en voeg onmiddellijk aan de vlek na de incubatie.
    7. 'S nachts in het draaiende wiel bij 63 ° C, 12 rpm te vermengen. Niet Pipetteer de sonde rechtstreeks op de vlek, maar in de kruising buffer-zalm sperma oplossing.
  8. De vlek wassen.
    1. Verwarm de oplossingen wassen (1 x SSPE, 0,1% SDS en 0,1 x SSPE, 0,1% SDS) tot 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7,0).
    2. Vervreemden van de kruising oplossing en voeg ongeveer 100-150 mL 1 x SSPE, 0,1% SDS oplossing aan de hybridisatie buis, sluit u de buis en met de hand draaien. Giet de kruising en wassen van de oplossing in het juiste vloeibaar radioactief afval.
    3. Voeg ongeveer 100-150 mL 1 x SSPE, 0,1% SDS oplossing voor de buis, sluiten, en de buis gedurende 15 minuten staan bij 63 ° C in het draaiende wiel, 12 rpm uit te broeden. Gooi de oplossing wassen op de juiste manier.
    4. Voeg ongeveer 100 – 150 mL 0,1 x SSPE, 0,1% SDS oplossing aan de hybridisatie buis, sluiten en draaien van de buis gedurende 5 minuten bij 63 ° C, 12 rpm. Gooi de oplossing wassen op de juiste manier.
    5. Neem de vlek uit de buis en plaats het in een lade met voldoende voorverwarmde 0.1 x SSPE, 0,1% SDS en schud gedurende 3 minuten in een schudden waterbad van 65 ° C. Ondertussen, spoel de Maas in een lade gevuld met water.
    6. Neem de vlek uit, plaatst u deze tussen vooraf gevouwen kunststof (polyethyleen slang) zorgvuldig veeg overtollige vloeistof af en laat de vlek drogen kort. Merk op dat de vloeistof het phosphorimager scherm ruïneren zal.
    7. Het zegel van de vlek in kunststof op de drie zijden. Verwijder alle overtollige vocht rond de vlek en sluit de plastic buis door het afdichten van de vierde zijde. Het overschot van plastic afgesneden. Controleer of de verzegelde vlek niet lekt en dat het plastic droog aan de buitenkant is.
  9. Het scherm van de phosphorimager bloot.
    1. Plaats de verzegelde vlek in een cassette phosphorimager met het scherm van de phosphorimager geconfronteerd met de DNA-kant van de vlek. Sluit de cassette en laat gedurende ± 2-4 dagen, afhankelijk van de sterkte van de radioactieve labeling en gevoeligheid van de phosphorimager.
    2. Scannen van het scherm van de phosphorimager met behulp van een phosphorimager. Zorg om het scherm zo weinig mogelijk aan het licht bloot voordat u gaat scannen. Sla de afbeelding op. Wissen van het scherm van signaal door blootstelling aan fel licht.
  10. Het analyseren van de vlek.
    1. De analyse is afhankelijk van de strategie van de beperking in stap 4.1 gebruikt. Bij de analyse van de vlek die is bereid volgens de strategie weergegeven in stap 4.1.1.1 (figuur 4A), het aantal de fragmenten gedetecteerd. In deze strategie verwijst het aantal gehybridiseerde fragmenten naar het aantal T-DNA integraties.
      1. Vergelijk de waarde van de fragmenten met een sonde voor links (figuur 7B) en het rechterdeel (Figuur 7 c) van de T-DNA ontdekt.
        Opmerking: Als een verschillend aantal kwekers fragmenten is gedetecteerd, vervolgens beide i) T-DNA kopieën (hetzij in omgekeerde of directe richting) of ii) onvolledig geïntegreerd T-ANI's aanwezig zijn.
      2. De grootte van gehybridiseerde fragmenten op de vlek op basis van de grootte van de markering bands, en vergelijk de afmetingen van gehybridiseerde fragmenten met het verwachte fragment maten berekend op basis van de strategie van de beperking van tandem inlassingen (figuur 4A) te schatten het identificeren van mogelijke tandem rangschikking van de T-Ani. De figuur 4A als leidraad gebruiken voor het berekenen van de grootte van de verwachte fragmenten.
        Opmerking: Als de grootte van gehybridiseerde fragmenten niet eens is met de berekende degenen, waarschijnlijk een van de huidige integraties is niet compleet.
    2. Bij de analyse van de vlek bereid volgens strategie weergegeven in stap 4.1.1.2 (figuur 4B), schatten van de omvang van het hybridizing fragment op de vlek op basis van de grootte van de markering bands, en vergelijken met de verwachte grootte. Intact sluissymbool levert een één fragment met een gedefinieerde lengte. Elke afwijking van de verwachte duur wijst op onvolledige integratie (figuur 7D).
  11. Strip de vlek voor opnieuw hybridisatie (optioneel).
    Opmerking: De zelfde vlek kan achter elkaar gekruist worden met verschillende sondes. Voordat u verdergaat met een nieuwe sonde, strip een vorige gehybridiseerde sonde van de vlek.
    1. Als u wilt verwijderen van de sonde van de vlek, plaats de vlek in een lade met zijn DNA-kant naar beneden. Giet een overschot van 0,5% SDS in de lade. Kook het membraan voor 2-5 min. De duur van de behandeling hangt af van de grootte en de GC-inhoud van de sonde gebruikt. Langer en GC-rijker sondes een langere behandeling nodig hebben.
    2. Na het strippen, kruisen de vlek met een ander sonde, of zegel en opslaan bij-20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van het systeem van BIBAC-GW, waren verslaggever constructies voor ODM studeren in planten gegenereerde10. Constructies werden ontworpen in de Gateway Entry vector pENTR-gm12 en pBIBAC-BAR-GW (Figuur 1) met behulp van de Gateway LR recombinatie reactie ingevoegd.

Arabidopsis werden omgevormd met pDM19, een plasmide BIBAC-BAR-GW met een verslaggever van de mTurquoise-eYFP die een translationeel stop codon in het leesraam van eYFP op positie 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (Figuur 2)10. In totaal werden 126 Arabidopsis planten getransformeerd (9 planten per pot, 14 potten). Zaden van deze planten werden gebundeld, gezaaid op schaaltjes met bodem en toegestaan om te groeien gedurende twee weken voorafgaand aan de behandeling met glufosinaatammonium oplossing. Alleen de zaailingen die de bar -gen uitdrukt (aanwezig in BIBAC-BAR-GW) overleven glufosinaatammonium behandeling (Figuur 3). In totaal werden 11 transgenics getransformeerd met pDM19 geïdentificeerd, overeenkomt met een efficiëntie van de transformatie van 0,02% van de zaden geanalyseerd.

Voor de 11 transgenics geïsoleerd, werd DNA bevlekken gebruikt om te bepalen van het aantal T-DNA integraties. Voor dat doel, werd genomic DNA gesneden met BglII of Scaik (strategie bedacht op figuur 4A). Beide van deze enzymen van de beperking slechts eenmaal in de opeenvolging van T-DNA (figuur 7A) gesneden. Kruising met sondes herkennen van de bar en de eYFP regio's codering toegestaan detectie van het aantal respectieve DNA-fragmenten.

Het aantal afzonderlijke DNA fragmenten op de vlekken toegestaan voor het schatten van het aantal T-DNA inserties in de verslaggever lijnen (tabel 1). Kwekers fragmenten met zowel de Bar en de eYFP sonde aangegeven de aanwezigheid van een enkele T-DNA-integratie. Van de 11 transgenics geanalyseerd, uitgevoerd zes één integraties. Het gemiddelde aantal integraties was 1.2.

Voor 6 lijnen met een enkele T-DNA-integratie, werd de integriteit van de constructie van de ingevoegde verslaggever getest met behulp van DNA bevlekken (strategie bedacht op figuur 4B). Genomic DNA werd gesneden met BglII en PciI bij het vrijgeven van een fragment van de 5.5 kb met zowel de Bar en de mTurquoise-eYFP fusion gen (figuur 7A). Een sonde tegen eYFP werd gebruikt voor het detecteren van het verwachte fragment. Alle planten getest droeg een intact fragment. Merk op dat het fragment onderzocht sluit de linker- en de grens rechts T-DNA, en onderzoekt daarom niet de integriteit van het gehele T-DNA, maar alleen het gedeelte met de transgenen van belang.

De expressie van het fluorescerende verslaggever gen werd vastgesteld in onafhankelijke single-kopie transgene regels verschillen alleen door de genomic locatie van het T-DNA. Relatieve transcript niveaus van de CaMV-35S promotor-gedreven mTurquoise-eYFP-verslaggever werden gemeten door RT-qPCR in vier DM19 verslaggever lijnen uitvoering intact, single-kopie integraties waarvan de genomic positie bepaald10was. De variatie in verslaggever gen expressie niveaus tussen de lijnen was klein: het maximale verschil in mTurquoise-eYFP RNA niveaus was 2-fold (figuur 8A).

Vervolgens werd de ODM uitgevoerd in deze verslaggever lijnen. Drie van de vier zijden van de onafhankelijke verslaggever toonde eerder soortgelijke ODM efficiëntie (Figuur 8). Echter, een lijn, DM19 [4] 1, leverde een zeer lage ODM efficiëntie ten opzichte van de andere lijnen. Deze resultaten wijzen erop dat de ODM wordt beïnvloed door de lokale genomic context. Op welke wijze de lokale genomic context van de integratie van T-DNA in DM19 [4] 1 verschilt van die in de andere lijnen moet nog worden geïdentificeerd. Analyse van de beschikbare datasets op actieve en inactieve chromatine merken aan de genomic T-DNA integratie sites in niet-transgene planten hebben geen verstrekt een antwoord10.

Figure 1
Figuur 1: functionele kaarten van pBIBAC-GW vectoren. pBIBAC-GW derivaten zijn beschikbaar met hetzij weerstand tegen tot (bar) of DsRed fluorescentie in zaad jassen (DsRed) als een marker van de selectie in planten. Voor beide vectoren is een kanamycine resistentie gen de markering van selectie bij bacteriën. De Gateway ccdB cassette is aangetoond tussen groene pijlpunten recombinatie vertegenwoordigen sites attR1 en attR2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: mutagenese verslaggever construct. De mTurquoise-eYFP-reporter genen worden gedreven door de promotor 35S-CaMV. De mTurquoise regio codering is gesmolten tot een eYFP regio uitvoering een C-A-mutatie op nucleotide positie 120, wat resulteert in een voortijdige translationeel stop codon TAA en voortijdige beëindiging van de vertaling van de fusieproteïne codering. De 3 ' Nopaline Synthase (nos 3') polyadenylatie signaal wordt gebruikt voor het beëindigen van de transcriptie van de constructie22. Nucleaire localisatie signaal (NLS) wordt gebruikt om de vertaalde eiwitten aan de kern. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Tray gevuld met Arabidopsis zaailingen voor en na behandeling glufosinaatammonium. Zaailingen die niet de bar -gen uitdrukt dat aanwezig is in de pBIBAC-BAR-GW T-DNA sterven na wordt gespoten met glufosinaatammonium oplossing. De foto's tonen de dezelfde lade van zaailingen (A) voor het spuiten met glufosinaatammonium, 14 dagen na het zaaien, en (B) 10 dagen later, na tweemaal wordt gespoten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: algemene DNA beperking strategie om te identificeren, het aantal en de intactheid van ingevoegd T-Ani. (A) een beperkingsplaats (R) in het midden van de T-DNA kan onafhankelijke sonderen van de linker (rode L)- en rechter gedeelte van het T-DNA (groene R). De cartoons hiernaast blijkt afhankelijk van enkel - of multi - kopie T-DNA integraties, banding kruisbare worden verkregen met DNA bevlekken. Bands gemarkeerd met een * hebben een gedefinieerde lengte, terwijl de lengte van de andere bands hangt af van de dichtstbijzijnde beperkingsplaats in het begeleidende genomic DNA. Één invoegen: De L en R sonde beide geven een onafhankelijke fragment. De verwachte gemiddelde fragment grootte kan worden berekend op basis van de frequentie van de beperkingsplaats in het genoom. De minimale grootte is de afstand van de beperkingsplaats naar de linker rand (LB) of rechts rand (RB), afhankelijk van welke einde van de integratie is wordt gesondeerd, en als de T-DNA is intact. Tandem repeat: De sondes voor L en R geven beide twee fragmenten; voor elke sonde een van de fragmenten bevat flankerende genomic DNA, het tweede fragment heeft een verwachte grootte en wordt aangeduid met beide sondes. Inverted herhalen: Afhankelijk van de directionaliteit van de geïntegreerde cassette, kunnen ofwel één L en twee R fragmenten, of twee L en een R worden geïdentificeerd. Individuele één invoegingen: Het resultaat is een aantal onafhankelijke fragmenten en het aantal fragmenten waarin komt overeen met het aantal integraties. (B) beperking sites op de uiteinden van de T-DNA kunnen bepalen van de integriteit van het fragment tussen de beperkingsplaatsen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: een agarose gel met beperking patroon en de overeenkomende transparantie. (A) op de agarose gel, verteerd genomic DNA met EcoRik wordt weergegeven. De goede spijsvertering van DNA wordt geïllustreerd door de aanwezigheid van discrete satelliet bands. (B) markering de positie van de "slots" en marker bands op een transparantie maakt het mogelijk om later gemakkelijk Bereken de grootte van de kwekers van fragmenten. Hier, MRC Holland markeringen (blauw en rood) gebruikt, aangeduid met M. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Setup voor het capillaire bevlekken. In een capillair bevlekken setup, wordt filterpapier geplaatst op een kunststof plaat met de uiteinden van het papier opknoping in 20 x SSC buffer. Het papier is wordt bevochtigd met 20 x SSC en een agarose gel geplaatst op de top, gevolgd door een nylon membraan, filtreerpapier en een stapel van weefsels. Een licht gewicht wordt geplaatst bovenop. Zorg is genomen om te verwijderen van luchtbellen tussen de gel-, papier- en membraan. Cling-film wordt gebruikt om te voorkomen dat het drogen uit de setup. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: voorbeeld van DNA bevlekken strategie en experimentele resultaten. (A) DNA bevlekken strategie om te bepalen van het aantal en de intactheid van T-DNA integraties. De locaties van het snijden van de geselecteerde restrictie-enzymen in de T-DNA worden aangegeven met de verticale balken. De eYFP en bar probes voor hybridisatie met verteerd genomic DNA gebruikt worden aangegeven met een lijn met de RD Session Host stip onder de T-DNA. (B-D) Voorbeeld DNA vlekken. Genomic DNA werd gesneden met Scaik en de vlek was gesondeerd met zowel een bar en een eYFP -sonde (B en C). Genomic DNA was met BglII en Pciik gesneden en peilden met een bar -sonde. Intact fragmenten zijn 5.5 kbp in grootte (D). Opmerking dat de set voor samples in D van die in B en C. verschilt * geeft aan dat de verwachte fragment grootte; M, marker. In de B, C en D wordt de dezelfde grootte markering gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: mTurquoise-eYFP expressie niveaus en ODM efficiëntie in onafhankelijke mTurquoise-eYFP verslaggever lijnen. (A) relatieve mTurquoise-eYFP transcript niveaus gemeten door RT-qPCR in DM19 verslaggever lijnen. Voor normalisatie werden transcript niveaus van actine gebruikt. (B) ODM efficiëntie gemeten in de DM19 verslaggever lijnen. Voor A en B, bars geven het gemiddelde van ten minste vijf biologische replicatieonderzoeken. Foutbalken geven SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Type van T-DNA locus Nr van T-DNA integraties Verslaggever lijn Aantal fragmenten gedetecteerd Integriteit
SCA Ik BGL II BGL II/PciI
Bar eYFP Bar eYFP eYFP
Interne locus integraties 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2] -5 1 1 1 1 +
1 19 [2] -9 1 1 1 1 +
1 19 [2] -11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
2, omgekeerde herhalen 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, onvolledige integratie 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Meerdere locus integraties 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND – niet bepaald.

Tabel 1: Samenvatting van de DNA gegevens voor transgenics geïsoleerd na transformatie met pDM19 bevlekken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cruciaal belang voor het genereren van transgenics met enkele, intact integraties van een transgenic is de keuze van de binaire vector gebruikt. BIBAC familie vectoren zijn gebruikt om het leveren van sequenties van belangen aan veel plant soorten23,24,25,26,27,28. BIBAC vectoren, met inbegrip van BIBAC-GW, single-kopie integraties met een hoog rendement opleveren: het gemiddelde aantal toevoegingen per regel is 1,5 tot 2, vergeleken met 3 of hoger voor de meest gebruikte binaire vectoren5,9, 29. als een belangrijke verbetering ten opzichte van andere BIBAC vectoren, met de BIBAC-GW vectoren, de sequenties van belang kunnen worden gemakkelijk ingevoegd met behulp van Gateway recombinatie sites12. De algemene problemen van BIBAC vectoren wanneer gebruikt in conventionele klonen strategieën te overwinnen door de gemodificeerde vectoren: i) een zeer beperkt aantal unieke beperkingsplaatsen en ii) een lage DNA opleveren. De Gateway recombinatie sites maken BIBAC-GW vectoren een aantrekkelijk alternatief voor andere binaire vectoren voor het genereren van transgene planten.

Hier wordt een aantal protocollen, van het genereren van BIBAC-GW derivaten die bevatten sequenties van belang, plantenziekterisico transformatie, en DNA analyse van de vlek voor nummer en intactheid van de transgene sequences beschreven. Verscheidene van de protocollen gemeld in dit document, klonen, Gateway electroporation van bacteriën, en plant de transformatie, zijn gebruikelijk in veel laboratoria en ook met kleine aanpassingen kan worden uitgevoerd. Het is belangrijk om te weten dat BIBAC-GW een single-kopie vector in E. coli en A. tumefaciens is. Isoleren van DNA, is de opbrengst dan ook bij lage; het is raadzaam aan schaal omhoog de isolatie-procedure.

In transgenics uitvoering van meerdere T-DNA integraties, geïntroduceerde transgenen zijn vaak onderworpen aan gene silencing1,2,4,30, en moet daarom voor de meeste toepassingen worden vermeden. Om te identificeren transgene planten met enkele, intact integraties, is het aanbevolen om het gebruik van DNA vlekkenanalyse. Terwijl andere methoden dan DNA bevlekken kan worden gebruikt voor het bepalen van T-DNA exemplaaraantal en integriteit van de T-ANI in transgene lijnen (segregatie analyse, staart-PCR, kwantitatieve PCR (qPCR) en digitale druppel PCR), hoewel arbeid intensief, DNA bevlekken is vaak de methode van keuze. Segregatie analyse is niet bekwaam om te onderscheiden tussen meerdere en single van T-DNA integraties op één loci. STAART-PCR vaak gebrek schattingen de kopie nummer, vooral als meer dan één T-DNA-integratie is aanwezig31en qPCR moet uitgebreide optimalisatie voor betrouwbare resultaten31,32. Digitale druppel PCR is een vrij nauwkeurig methode voor kopie nummer detectie als het nodige materiaal beschikbaar31 is. Het extra voordeel van DNA bevlekken is facile detectie van afgeknotte T-Ani, die gemakkelijk in alle PCR-gebaseerde technieken wordt gemist.

Met de analyse van de vlek van DNA moeten de hybridizing fragmenten op de vlek goed identificeerbaar in signaal en grootte. Verschillende factoren is bekend dat de uitkomst van het DNA bevlekken beïnvloeden. Naast een juiste selectie van restrictie-enzymen (strategie aangegeven in afbeelding 4) en markeringen van de grootte, voldoende DNA van goede kwaliteit is vereist. Minder dan 2 µg genomic Arabidopsis DNA levert niet veel goed-identificeerbare fragmenten. Bij het omgaan met grotere genomen, is meer DNA vereist. Voor het verkrijgen van voldoende hoeveelheden van Arabidopsis DNA, kunnen floral weefsels of 1 - weken oude zaailingen worden gebruikt. Een batch van zaailingen geteeld op een petrischaal levert 2 – 8 µg van DNA. Om te voorkomen dat DNA afbraak tijdens isolatie, moet worden gewaakt voor het verwerken van het plantmateriaal snel. Bovendien genomic DNA moet worden geresuspendeerde in Tris-EDTA om de afbraak door nucleasen, en opgeslagen bij 4 ° C in plaats van-20 ° C om te voorkomen dat DNA plukt wijten aan herhaalde cycli bevriezen-ontdooien. Als niet zeker dat alle DNA-monsters volledig verteerd zijn, wordt voorgesteld om het rehybridize van de DNA-vlek met een sonde herkennen een endogene, unieke genomic regio. Bij het selecteren van sequenties van de sonde voor het identificeren van transgene of endogene sequenties, is het cruciaal voor alleen het selecteren van unieke reeksen. Om te kunnen precies bepalen de grootte van gehybridiseerde fragmenten, de standpunten van DNA gel "slots" en DNA marker banden moeten worden gemarkeerd op een transparantie (figuur 5B) bij het visualiseren van een gel van Ethidium Bromide gebeitste (figuur 5A) op een UV transilluminator. In het geval de marker sequenties niet te met de sonde DNA vermengen doen of kruising gedeeltelijke is, is het de enige manier om het opsporen van de grootte van de kwekers van fragmenten.

Zodra zorg is genomen om goede hybridisatie signaal en schatting van de grootte van het fragment te bereiken, is de interpretatie van de Bevlekkende resultaten eenvoudig. Bij gebruik van slechts één restrictie-enzym en kwekers met verschillende sondes opsporen van hetzij het deel van het links of rechts van de T-DNA, geeft het aantal gedetecteerde fragmenten het aantal T-DNA inserties. Bijvoorbeeld, figuur 7B, C toont de hetzelfde DNA blot, gekruist met verschillende sondes, bar (figuur 7B) en verbeterde gele Fluorescent Protein (eYFP) (Figuur 7 c), met behulp van de strategie die is weergegeven in figuur 7A. Alle rijstroken, behalve 4, Toon een gelijk aantal fragmenten op beide blots: twee fragmenten voor lijn 6 en een één fragment voor alle andere regels. Dit aantal gedetecteerde fragmenten is het getal van T-DNA inserties.

Wanneer het aantal fragmenten waarin aangetroffen met sondes bindend hetzij links of rechter gedeelte van het T-DNA (wat betreft figuur 7BC, lijn 4 verschilt), ofwel onvolledig invoegingen aanwezig zijn of de T-ANI in tandem regeling hebt ingevoegd. De tandem invoegingen non-random fragment lengte voor een van de T-DNA-fragmenten (figuur 4A, rechter paneel) weergegeven en kunnen worden geïdentificeerd door de gehybridiseerde fragment grootte vergelijken met wat verwacht op basis van de strategie van de beperking wordt er. Een extra Bevlekkende strategie kan nodig zijn om de tandem-opstelling van de T-DNA inserties bevestigen. In de steekproef getoond op regel 4 (figuur 7B, C), zijn twee invoegingen geordend in een omgekeerde herhalen oriëntatie.

Bij het schatten van de intactheid van een T-DNA, of een deel daarvan, kan de lengte van het hybridizing fragment worden berekend op basis van de strategie van de beperking. Elke afwijking van de verwachte grootte duidt op de aanwezigheid van een onvolledige invoeging. Bijvoorbeeld, in 7D van de figuurmigreert in lane 4, een hybridizing fragment op 8 kbp, (in plaats van de verwachte 5,5 kbp) onder vermelding van het bedrag van een verhoogde fragment als gevolg van het ontbreken van één van de beperkingsplaatsen.

BIBAC-GW vectoren zijn uitstekende instrumenten voor het genereren van single-exemplaar intact integraties in een aantal plantensoorten. Het protocol hier gemeld biedt een betrouwbare procedure voor de planten inleven in één, intact integraties van een transgenic van belang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit onderzoek wordt ondersteund door de Nederlandse technologie Stichting STW (12385), dat deel uitmaakt van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO), en die is deels gefinancierd door het ministerie van economische zaken (OTP Grant 12385 aan MS).  Wij danken Carol M. Hamilton (Cornell University, Verenigde Staten) voor het verstrekken van pCH20, de ruggengraat van de BIBAC-GW vectoren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Tags

Genetica kwestie 133 binaire vector BIBAC Gateway compatibel binaire vector transformatie interne integratie gene silencing DNA bevlekken Southern blotting plant
Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter