Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

Un vecteur binaire pBIBAC-GW permet de générer des plantes transgéniques avec insertions de simple copie intactes, un processus facile. Une série de protocoles est présentée ici, qui guide le lecteur à travers le processus de génération des plantes transgéniques d’Arabidopsis et tester les plantes pour l’intégrité et de copier le nombre des plaquettes.

Abstract

Lors de la génération de plantes transgéniques, en général, l’objectif est d’avoir une expression stable d’un transgène. Cela nécessite une intégration unique et intacte du transgène, copies plusieurs intégrations sont souvent victimes de silençage génique. Le vecteur binaire compatible Gateway basé sur les chromosomes artificiels bactériens (pBIBAC-GW), comme les autres dérivés de pBIBAC, permet l’insertion de transgènes exemplaire unique avec une grande efficacité. Comme une amélioration à le pBIBAC originale, une cassette de passerelle a été clonée en pBIBAC-GW, afin que les séquences d’intérêt peuvent maintenant être facilement incorporés dans l’ADN (ADN-T) de transfert de vecteur par clonage Gateway. Communément, la transformation avec pBIBAC-GW se traduit par une efficacité de 0,2 – 0,5 %, selon laquelle la moitié de la transgénèse portent une intégration simple copie intacte de l’ADN-T. Les vecteurs pBIBAC-GW sont disponibles avec résistance au Glufosinate-ammonium ou DsRed fluorescence dans les téguments de sélection dans les plantes et résistance à la kanamycine comme une sélection chez les bactéries. Ici, une série de protocoles est présentée qui guident le lecteur à travers le processus de génération de plantes transgéniques à l’aide de pBIBAC-GW : à partir de recombiner les séquences d’intérêt dans le vecteur pBIBAC-GW de choix, de planter la transformation avec Agrobacterium, sélection de la transgénèse et tester les plantes pour intact et copie le numéro des inserts utilisant l’ADN buvard. Attention est accordée à la conception d’une stratégie de transfert de l’ADN de reconnaître single - et multi - multicopies intégrations à locus unique et multiple.

Introduction

Lors de la génération de plantes transgéniques, généralement l’objectif est d’avoir les transgènes intégrés exprimée de façon stable. Ceci peut être réalisé par intégrations exemplaire intact d’un transgène. Plusieurs intégrations peuvent conduire à une augmentation de l’expression d’un transgène, mais aussi de silençage génique. Silencieux d’échappement de transgènes est plus probable si les séquences insérées sont disposées en tandem ou des séquences inversées répétées1,2,3,4. Vecteurs binaires servent de navettes à Agrobacterium-médiée par des expériences de transformation pour livrer les séquences d’intérêt dans les génomes de plantes. Le nombre d’intégrations dans un génome végétal dépend du nombre de copies du vecteur binaire à Agrobacterium tumefaciens5,6. Beaucoup de vecteurs binaires couramment utilisés sont des vecteurs d’élevé de copies et donnent donc un nombre de copies de transgènes moyenne haute : copies de 3,3 à 4,9 dans Arabidopsis5.

Le nombre d’intégrations de l’ADN-T peut être abaissé à l’aide de vecteurs binaires qui ont un certain nombre de faibles copies dans a. tumefaciens, tels que BIBAC7, ou en lançant un ADN-T de l’a. tumefaciens du chromosome5. Le nombre moyen d’intégrations de transgene dans de tels cas est inférieur à 25,8,9,10. Car elle a été exemplaire unique dans a. tumefaciens et aussi chez Escherichia coli, BIBAC-dérivés peuvent maintenir et livrer des constructions plus grandes que 150 Ko,11.

GW-compatible BIBAC vecteurs10,12 permettre une introduction facile des gènes d’intérêt dans le vecteur à l’aide de clonage Gateway. L’utilisation de la technologie de passerelle qui simplifie grandement la procédure de clonage, mais aussi permet de surmonter les problèmes communs associés à13,grands vecteurs de basse-copie-numéro14, comme un faible rendement de l’ADN et une sélection limitée de restriction uniques sites disponibles pour le clonage de7,11. Les dérivés pBIBAC-GW sont disponibles avec une résistance au Glufosinate-ammonium (pBIBAC-BAR-GW) ou DsRed fluorescence dans les téguments (pBIBAC-DP-GW) de sélection dans les végétaux (Figure 1)10,12. Pour les deux vecteurs, un gène de résistance kanamycine est utilisé comme marqueur de sélection chez les bactéries.

Combinent les vecteurs pBIBAC-GW : (1) simplifie la conception et la manipulation génétique chez e. coliet (2) intact simple copie intégrations en planta à haute efficacité. Le rendement des vecteurs pBIBAC-GW intégrations moyenne 1,7 chez Arabidopsis avec environ la moitié des plantes transgéniques portant un seul intégré l’ADN-T10.

L’expression stable de transgènes est une exigence pour la plupart transgéniques générées. Expression du transgène stable est possible par des intégrations intactes, exemplaire unique. Toutefois, travailler avec des plantes transgéniques porteuses intégrations intactes, exemplaire unique est encore plus important si, par exemple, le but est d’étudier l’efficacité des processus axés sur la chromatine, tels que la mutagénèse, recombinaison, ou la réparation et la dépendance à l’égard de ces processus sur l’emplacement de la génomique et la structure de la chromatine au site d’insertion. Pour notre intérêt, pour étudier la dépendance de la mutagénèse oligonucléotide réalisé (ODM) sur le contexte local de génomique, un ensemble de lignes de journaliste avec des intégrations intacts, de la simple copie d’un gène rapporteur de mutagenèse a été généré (Figure 2)10. À l’aide de cet ensemble de lignes, il a été démontré que l’efficacité de l’ODM varie entre locus transgéniques intégrés à différents endroits de génomiques, malgré les niveaux d’expression de transgènes plutôt semblables.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. insertion de séquences d’intérêt en vecteur binaire

  1. Préparer l’entrée de la porte d’entrée et vecteurs binaires.
    1. Isoler le vecteur d’entrée passerelle contenant un fragment d’ADN ou le gène d’intérêt à l’aide d’un kit de mini-préparent selon les suggestions du fournisseur.
      NOTE : BIBAC-GW vecteurs nécessitent l’utilisation de kanamycine (Km) pour la sélection chez les bactéries, par conséquent, utiliser un vecteur d’entrée avec un autre marqueur de résistance au lieu de la kanamycine. Par exemple, le vecteur de la pENTR-gm, portant un gène de résistance gentamicine, est un bon choix de12.
    2. Propager et isoler le vecteur BIBAC-GW d’intérêt. Utilisez une souche d’e. coli qui résiste à la toxicité du gène BCDC présente au sein de la cassette de la passerelle. Isolat BIBAC-vecteurs en utilisant des protocoles ou des kits spécialement conçu pour les grands plasmides selon les suggestions du fournisseur.
  2. Effectuer une réaction de la passerelle.
    1. Préparer la réaction de recombinaison LR selon les suggestions du fournisseur. Mélanger les composants suivants dans un tube de microtubes de 1,5 mL à température ambiante (RT) : 100 – 300 ng clone d’entrée (surenroulé), 300 ng du vecteur BIBAC-GW, tampon de réaction Clonase LR (concentration finale : 1 x). Régler le volume du mélange à 16 µL avec TE (10 mM Tris, 1 mM d’EDTA, pH 8,0). Enfin, ajoutez 4 µL de mélange enzymatique Clonase LR et mélanger au vortex. Incuber le mélange à 25 ° C pendant 1 h.
    2. Au mélange prêt à l’étape 1.2.1, décharger la réaction LR en ajoutant 2 µL de solution de protéinase K (2 µg/µL). Mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 10 min.
  3. Transformer des e. coli avec le mélange réactionnel passerelle par électroporation.
    1. Dessalement le mélange réactionnel LR avant l’électroporation.
      Remarque : Cette étape est critique pour l’électroporation réussie. Ci-dessous une dialyse méthode est décrites, mais d’autres méthodes comme la précipitation avec de l’acétate de sodium et l’éthanol peut aussi être utilisé.
      1. Préparer l’installation d’une dialyse de filtre de la réaction de LR. Verser 20 mL d’eau désionisée ultrapure dans une boîte de Petri stérile. Placer un disque de filtre de membrane (taille des pores = 0,025 µm) sur la surface de l’eau.
      2. Déposer la réaction LR ensemble soigneusement sur le dessus de la membrane et permettre le mélange de dialyser à ta pendant 1 h.
    2. Ajouter 5 µL du mélange morue dessalée LR à cellules DH10B electro dans une cuvette d’électroporation (0,1 cm). Electroporate les cellules (1,5 V/cm, résistance 200 Ω, capacité 25 µF) et immédiatement ajouter 1 mL de milieu de répression (SOC) préchauffé Super catabolique optimale aux cellules, suivies d’une incubation à 37 ° C pendant 45 min, 180 tr/min. (Moyenne SOC, extrait de 1 l : 20 g de Bacto tryptone, 5 g de levure, 0,5 g de NaCl, 2,5 mL de KCl 1M, 20 mL de 1 M stérilisée par filtration Glucose).
      Remarque : Les cellules de DH10B peuvent être substituées à autres cellules d’Escherichia coli qui maintiennent solidement les plasmides.
      Remarque : Les conditions optimales d’électroporation dépendent de l’électroporation de dispositif utilisé.
    3. Granulés de bactéries à la vitesse maximale pendant 30 s en utilisant une micro-centrifugeuse, enlever l’excès SOC et Resuspendre le culot dans environ 50-100 µL de milieu Luria-Bertani (LB). Transmettre la bactérie sur des plaques de kanamycine-LB (Km-LB) (concentration Km, 40 µg/mL) et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. (Milieu LB, 1 l : 10 g de Bacto tryptone, 5 g de levure extrait, 10 g de NaCl. Pour milieu solide ajouter agar, 15 g/L).
  4. Identifier les dérivés BIBAC-GW recombinés et isoler l’ADN de plasmide.
    1. Pour être capables de se développer sur des plaques Km-LB, les cellules d’Escherichia coli devraient contenir le plasmide recombiné de BIBAC-GW dans lequel la séquence de la BCDC est remplacée par l’insertion désirée. Colonie Polymerase Chain Reaction (PCR)15 permet de contrôler si les colonies de bactéries de la plaque contient les plasmides corrects, vu la colonne vertébrale BIBAC-GW et l’insert d’intérêt.
      1. Pour identifier la colonne vertébrale pBIBAC-BAR-GW, effectuer une réaction de15 PCR avec des amorces DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'et DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Cet ensemble d’apprêt afin d’amplifier un fragment bp 563 du gène bar .
      2. Pour vérifier la présence de la colonne vertébrale BIBAC-DP-GW, effectuer une réaction de PCR15 , à l’aide d’amorces M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'et M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Cette combinaison d’amorces afin d’amplifier un fragment de bp 791 chevauchant la séquence cruciferin de promotor et DP .
      3. Effectuer des réactions de15 de PCR utilisant des amorces spécifiques aux gènes pour vérifier la présence de l’insert d’intérêt.
    2. Ensemencer une seule colonie positive en 2 à 5 mL de milieu LB contenant la kanamycine (40 µg/mL) pour DNA isolation16. Incuber à 37 ° C dans un agitateur orbital à 180 tr/min, du jour au lendemain.
    3. Isoler l’ADN de plasmide (voir étape 1.1.2).

2. Elaboration d’a. tumefaciens Floral assaisonnée d’Arabidopsis

  1. Transformer les dérivés BIBAC-GW à a. tumefaciens.
    1. Préparer des cellules capables d’electro Helper de souche C58C1 portant le pCH32 d’a. tumefaciens plasmide7. Croissance de bactéries en présence de tétracycline (5 µg/mL) et de la rifampicine (100 µg/mL) pour sélectionner pour pCH32 et assurer une croissance de seulement les cellules Agrobacterium .
    2. Ajouter 0,25 à 0,5 µg ADN d’un dérivé de pBIBAC-GW, préalablement dissous dans 10 à 20 µL stérile ultrapure eau désionisée, à 20 cellules de Agrobacterium compétentes µL dans des cuvettes d’électroporation (0,1 cm). Garder les cellules sur la glace.
    3. Electroporate les cellules (1,5 V/cm, résistance 400 Ω, capacité 25 µF). Immédiatement après l’électroporation, ajouter 1 mL de milieu de SOC pré chauffé (28 ° C) pour les bactéries et incuber les cellules à 28 ° C pendant 60 à 90 min.
    4. Propage 100 µL et le reste de la bactérie sur des plaques LB distinctes contenant de la rifampicine (100 µg/mL), kanamycine (40 µg/mL) et la tétracycline (5 µg/mL) et incuber dans l’obscurité à 28 ° C pendant 1 à 2 jours.
  2. Préparer la suspension d’Agrobacterium .
    1. Vérifier, par PCR, un couple des colonies a. tumefaciens de la plaque préparée à l’étape 2.1.4, la présence du vecteur correct (voir étape 1.4.1).
    2. Ensemencer une seule colonie confirmée pour contenir le vecteur binaire avec l’insert approprié sur un plat de livre contenant des antibiotiques (voir étape 2.1.4). Croître à 28 ° C durant la nuit.
    3. Répétez les rayures avec une seule colonie, obtenue à l’étape 2.2.2.
    4. Ensemencer une seule colonie de 2,5 mL de milieu LC additionné d’antibiotiques (voir étape 2.1.4) pour préculture. Incuber à 28 ° C pendant au moins 8 heures ou toute la nuit, à 180 tr/min. (Moyenne de LC, 1 l : 10 g de Bacto tryptone, 5 g de levure extrait, 0,5 g de NaCl, 2,5 g de MgSO4 · 7 H2O, 2 g de Maltose).
    5. Ajouter la préculture d’étape 2.2.4. jusqu'à 250 mL LC additionné d’antibiotiques (voir étape 2.1.4) et poussent à 28 ° C, à 180 tr/min, du jour au lendemain.
    6. Pellet la culture de la filature à 5 500 g pendant 12 min. Resuspendre le culot dans 100 mL de solution contenant 5 % de sucrose, 0,05 % Silwet L-77, 0,5 x MS. Pour la suspension dans un contenant stérile pour tremper floral des plantes.

3. Transformation d’Arabidopsis

  1. Préparer les plantes Arabidopsis transformation.
    1. Faire pousser des plantes Arabidopsis dans une chambre de croissance maîtrisée à effet de serre ou du climat jusqu'à ce qu’ils sont en fleur (12 pots avec 9 plants de chaque par trempage).
    2. Clip les boulons premières pour permettre plus de boulons secondaires à émerger. Les plantes sont prêts pour tremper 4 à 6 jours après la ligature, lorsque les plantes ont de nombreux capitules immatures et pas beaucoup fécondé siliques.
  2. Plongement floral
    1. Tremper les inflorescences pour 5 à 10 s en suspension Agrobacterium préparée à l’étape 2.2.6. Utilisez l’agitation douce.
    2. Envelopper les parties hors-sol des plantes s’accrochent film pour garder l’humidité élevée et couvrir les pots de plantes avec une boîte pour conserver les plantes dans l’obscurité. Incuber les plantes pendant 2 jours dans une chambre de serre/croissance.
    3. Retirez la boîte et le film s’accrochent et cultiver les plantes à maturité dans une chambre de serre/croissance.
      Remarque : Pour augmenter l’efficacité de transformation, les mêmes plantes peuvent être re-croisement de 7 jours après le premier trempage.
    4. Récolter les graines. Piscine et analyser les graines (T1) des plantes, transformés par la construction même, comme un jeu unique.
  3. Écran pour les plantes transgéniques.
    1. Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé de pBIBAC-DP-GW, analyser les graines à l’aide de la microscopie de fluorescence. Afin de détecter les téguments expression DsRed, image les graines à une excitation de 560 nm et d’émission de 600 – 650 nm. Séparer les graines fluorescents des homologues non fluorescent avec une pincette.
    2. Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé de pBIBAC-BAR-GW, semer les graines dans des bacs remplis de terre (~ 2 500 graines/0,1 m2). Afin d’assurer une diffusion même des graines sur les plateaux, suspendre les graines dans la gélose de 0,1 % à 0,5 x milieu de Murashige Skoog (MS) et répandre les graines à l’aide d’une pipette de 1 mL.
      Remarque : Afin de stimuler les graines à germer de manière synchrone, incuber les graines pendant au moins 2 jours à 4 ° C. Cela peut être fait avant ou après le semis des graines.
      1. Pulvériser les jeunes plants avec solution de Glufosinate-ammonium 0,5 % 2 semaines et 3 semaines après le semis en caissettes. Utiliser 500 mL de solution de Glufosinate-ammonium par 1 m2.
      2. Transférer survivants semis dans des pots individuels. Une image typique d’un plateau avec des semis avant et après traitement de Glufosinate-ammonium (deuxième) sont indiquées à la Figure 3.
      3. Analyser les plantes résistant au Glufosinate-ammonium par PCR pour la présence de la construction d’intérêt (Voir l’étape 1.4.1. pour les amorces).
        1. Isoler l’ADN génomique végétale pour PCR à l’aide de la méthode décrite par Edwards et al. 17

4. caractérisation transgéniques pour le nombre et l’intégrité des intégrations de l’ADN-T

  1. Stratégie des digestions de restriction
    NOTE : Déterminer le nombre d’intégrations de l’ADN-T et leur intégrité par ADN éponger à l’aide d’enzymes de restriction. Cette méthode permet d’identifier unique, mais également les intégrations aux loci identiques ou différents dans le génome.
    1. Une série de digestions de restriction permet d’identifier les modes d’intégration différents possibles :
      1. Sélectionnez une enzyme qui coupe une fois dans le milieu de l’ADN-T, pour en sonder indépendamment des séquences en amont et en aval du site de restriction (Figure 4 a et Figure 7 a-C). Voir la Figure 4 aet la légende de la figure pour les résultats attendus et l’interprétation.
      2. Sélectionner une enzyme ou une combinaison d’enzymes en découpant la séquence entière d’intérêt à la fois (Figure 4 b et Figure 7 a-D). Tout écart par rapport à la longueur connue indique la troncation de la cassette intégrée.
        Remarque : Veillez à n’utiliser que des enzymes de restriction qui ne sont pas sensibles à la méthylation de la cytosine.
  2. Préparer les échantillons d’ADN génomiques.
    1. Isoler l’ADN génomique de plantes porteuses de la construction d’intérêt. Une méthode de miniprep CTAB ADN peut être utilisée pour l' isolement de l’ADN18. Pour l’ADN de la tache analyse d' Arabidopsis ADN, 2 – 2,5 µg d’ADN génomique est nécessaire. Dissoudre l’ADN dans 50 µL de TE.
    2. Vérifier l’intégrité de l’ADN par électrophorèse de gel de16. L’ADN génomique intact migre comme une discrète bande en haut du gel. Dégradation de l’ADN peut être reconnue comme la présence d’un frottis. Pour éviter les dommages à l’ADN en raison de gel-dégel répété, des échantillons d’ADN génomiques sont conservés à 4 ° C.
    3. Digérer l’ADN génomique (2 – 2,5 µg dans le cas de l’ADN génomique d’Arabidopsis ) dans un volume total de 50 µL, du jour au lendemain, en utilisant des conditions de tampon proposées par le fournisseur de l’enzyme.
      1. Dans un tube à essai, mélanger 2 – 2,5 µg d’ADN génomique d’Arabidopsis , 5 µL de tampon de restriction x 10 et 5 U restriction enzyme dans un total de 50 µL d’eau déionisée ultrapure.
    4. Ajouter colorant de chargement (1 x concentration finale) pour les échantillons de restriction avant du charger sur un gel. Pour le bon suivi visuel, utilisez une des valeurs suivantes : co-migre avec de petits fragments (bleu de bromophénol, bp 350 – 400), ou co-migre avec les plus grands fragments (Cylene cyanol, kbp 3 – 4).
  3. Exécutez le gel de l’ADN.
    1. Préparer un long (20 cm) 0,5 x TBE de gel d’agarose19. Le pourcentage d’agarose dans le gel dépend de la taille de fragment attendue. 0,8-1 % sépare optimale des fragments > 1 Ko de taille. Utiliser 1 – 1,5 % d’agarose pour fragments < 1 Ko. N’ajoutez pas de bromure d’éthidium dans le gel. (5 x TBE, 1 l : 54 g de Trizma base, 27,5 g d’acide borique, 3,75 g d’EDTA).
      Remarque : Pour empêcher la contamination de l’ADN, utilisation des plateaux de gel qui ne servent pas à fractionner le plasmide et PCR ADN amplifié.
    2. Charger les échantillons sur le gel de19.
    3. Ajouter des marqueurs de l’ADN au gel qui se trouvent dans la gamme de taille des fragments attendus. Charge environ 1 µg de marqueur (50-250 ng de fragments de tailles différentes) sur le gel pour permettre la visualisation par la lumière UV.
    4. Taille-fractionner l’ADN à une tension faible (40 à 50 V/500 mA) du jour au lendemain.
  4. Se préparer pour le transfert de l’ADN du gel d’agarose à la membrane en nylon.
    1. Transférer le gel dans un bac séparé et souiller pendant 20 à 25 min en 0,5 x TBE contenant du bromure d’éthidium (5 µg/mL) en tournant à 40 tr/min dans un agitateur orbital.
    2. Visualiser le gel sur un Transilluminateur UV. Vérifier la séparation de la taille de l’ADN génomique, avec visibilité des bandes discrètes satellite (Figure 5 a). Un frottis vers des tailles de poids moléculaire inférieurs indique la dégradation de l’ADN.
    3. Sur le transilluminateur UV, posez une transparence sur le gel et marquer la position des bandes de repère et les fentes avec un marqueur (Figure 5 b). Cela facilitera la détermination de la taille des fragments hybrides plus tard dans le cas où les séquences de marqueur ne s’hybrident pas spécifiquement avec la sonde ADN. En indiquant les fragments de marqueur à cette étape, il est possible de surveiller la taille des fragments qui s’hybrident.
    4. Placer le gel dans la barre d’État, rincer à l’eau déionisée ultrapure et il submerge à 0,25 M HCl pendant 15 min à la fragmentation de l’ADN dans le gel. Laver à l’eau déionisée ultrapure. Utiliser suffisamment de HCl et l’eau pour couvrir le gel dans la barre d’État et faire pivoter le plateau contenant le gel submergé à 40 tr/min dans un agitateur orbital.
    5. Incuber le gel dans le tampon de dénaturation pour 30 min. laver à l’eau désionisée ultrapure. Utiliser suffisamment de mémoire tampon et l’eau pour couvrir le gel dans la barre d’État et faire pivoter le plateau contenant le gel submergé à 40 tr/min dans un agitateur orbital. (Tampon de dénaturation : 0,5 M NaOH, 1,5 M de NaCl).
    6. Incuber le gel dans le tampon de neutralisation pour 30 min. laver à l’eau désionisée ultrapure. Utiliser suffisamment de mémoire tampon et l’eau pour couvrir le gel dans la barre d’État, de faire pivoter le plateau avec gel submergé à 40 tr/min dans un agitateur orbital. (Tampon de neutralisation : 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Transfert de l’ADN d’une membrane de nylon.
    1. Préparer l’installation de transfert capillaire de l’ADN génomique. Placez une plaque de plastique (environ la taille du gel ou plus grand) sur un plateau rempli de 20 x saline-sodium citrate (SSC). Plier un morceau de papier filtre épais sur le bac, afin que tous les deux de ses extrémités sont accrochent dans le SSC. Couper un morceau de taille gel de membrane de nylon chargé positivement Hybond N + et 2 morceaux de papier filtre épais. (20 x SSC : 3 M NaCl, Citrate de Sodium 0,3 M).
    2. Préparer l’installation de buvard (Figure 6) en plaçant le gel, fentes vers le bas sur le dessus du filtre en papier sur la plaque en plastique. Poser une membrane Hybond superisolants dessus, suivie de 2 couches de papier filtre. Pré mouillage chaque couche dans 20 x SSC avant de les ajouter à l’Assemblée. Veillez à enlever les bulles d’air entre les couches qu’elles entravent le transfert de l’ADN.
    3. Couvrir l’Assemblée d’une épaisse couche de papier de soie. Placez une plaque de plastique d’un poids, comme une petite bouteille, sur le dessus. Assurez-vous que la pression est également divisée sur le gel. Cela assurera le transfert de l’ADN.
      Remarque : Le poids doit être environ 200 à 300 g ; poids lourds entravent le transfert de l’ADN.
    4. Couvrir la zone entourant l’Assemblée, notamment exposé papier-filtre, s’accrochent film (Figure 6) pour éviter l’évaporation du 20 x SSC tampon et cible que le capillaire des forces vers la membrane de nylon. Tache du jour au lendemain.
    5. Marquer la position de la machines à sous, nom, ou la date sur le dessus de la membrane avec un crayon et retirer la membrane de l’ensemble. Notez que la partie inférieure qui a été en contact avec le gel, porte l’ADN.
    6. Immédiatement fixer l’ADN à la membrane par irradiation aux rayons UV (2 400 µJ/m2) à l’aide d’un RETICULATION UV.
      Remarque : Des conditions de réticulation dépendent du type de membrane utilisée.
      Remarque : À ce stade la membrane peut être conservée à-20 ° C et utilisée pour l’hybridation avec une sonde plus tard. Rincer la membrane réticulée dans 2 x SSC et seal il plié en avant tube polyéthylène thermosoudable avant de le placer à-20 ° C.
  6. Préparer la sonde pour l’hybridation.
    1. Amplifier la séquence à utiliser comme la sonde pour éponger de l’ADN par PCR20. 50-100 ng d’un fragment PCR de 250 bp-2 kbp est utilisé comme sonde. Deux sondes distinctes, une hybridation de la région proximale de la bordure droite et l’autre à la région proximale du bord gauche de l’ADN-T, peuvent être utilisées pour évaluer la présence de l’ADN-T entière (Figure 4 a et Figure 7).
    2. Diluer 50-100 ng du produit PCR dans 24 µL d’eau déionisée ultrapure dans un tube à essai.
    3. Dénaturer le produit PCR dilué en la faisant bouillir pendant 5 min dans un bécher d’eau ou bloc chauffant, puis refroidir sur glace.
    4. Dégelez premade GCT-mix sur la glace. (GCT-mix : avis, dCTP, dGTP dTTP (tous les 0,5 mM), aléatoire hexamères 43,2 ng/µL, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM de β-mercaptoéthanol, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6,8, 17 mM MgCl).
    5. Ajouter 21 µL du mélange GCT et 2 U de Klenow fragment du produit de PCR.
    6. Ajouter 2 µL de [32P] ATP au mélange et laisser incuber à 37 ° C pendant 1 h.
      ATTENTION : Toutes les étapes impliquant [32P] ATP nécessaire à effectuer dans un environnement désigné pour travail radioactive lors de l’utilisation d’une protection appropriée.
      Remarque : Assurez-vous que l’ATP [32P] est frais (pas plus de 1 mi-temps a réussi).
    7. Préparer un G-50 de Sephadex colonne (grossière ou moyenne)21 pour la purification de la sonde de nucléotides (radioactifs) non constituées en société. Prenez une seringue de 2 mL et couvrir la prise avec un petit cercle de papier filtre épais. Ajouter 2 mL de Sephadex G-50 dissous dans TE dans la seringue et évacuer tout le liquide de la colonne de la filature.
    8. Placer la colonne dans un tube en plastique de 15 mL, charger la sonde sur la colonne et essorer à température ambiante (définir la centrifugeuse à x 750 g, permettre la tr/min augmenter jusqu'à 750 x g est atteint, puis arrêter la centrifugeuse et permettent la rotation tomber à 0 x g) pour éluer la sonde. Ajouter 200 µL de TE à la colonne et l’essorage pour Éluer la sonde restante ; répéter une fois. Dans ces conditions, les fragments d’ADN marqués sont exclus de la matrice de Sephadex et éluer, tandis que les nucléotides libres restent dans la colonne.
    9. Utiliser 300 µL de la sonde par le tube de l’hybridation. Garder la reste de la sonde marquée à-20 ° C pour un usage ultérieur. Toutefois, n’oubliez pas la moitié du temps de l’ATP [32P].
  7. Hybrider la tache de l’ADN.
    1. Heat 2 x SSC et un tampon d’hybridation (15 mL / tube d’hybridation, maximum de 2 taches par tube) à 65 ° C. (Tampon d’hybridation : sulfate de dextran de 10 %, 1 % SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, dissoudre à 65 ° C, maintenir aliquotes à-20 ° C).
    2. Préchauffer le four d’hybridation à 65 ° C.
    3. Placer les mailles de nylon dans un plateau avec un peu de chaud (65 ° C) 2 x SSC pour couvrir le plateau. Placer la tache de l’ADN sur le dessus de la maille, avec le côté de l’ADN vers le haut. Rouler la tache avec la maille et insérer le rouleau dans un tube de l’hybridation. Égoutter l’excès 2 x SSC.
    4. Dans un tube de microcentrifuge, faire bouillir 150 µL d’ADN de sperme de saumon (concentration 10 mg/mL) par tube d’hybridation pendant 5 min (voir aussi l’étape 4.6.3). Refroidir immédiatement sur la glace et ajouter de la mémoire tampon d’hybridation préchauffée.
    5. Ajouter la solution de sperme de saumon tampon hybridation au tube avec la tache. Avant de s’hybrider à 65 ° C pendant au moins 1 h dans une roue en rotation, à 12 tr/min.
    6. Lors de l’incubation préalable à l’étape 4.7.5. est presque terminé, faire bouillir 300 µL de la sonde pendant 5 min (voir aussi l’étape 4.6.3) et ajoutez immédiatement à la tache après l’incubation.
    7. S’hybrident du jour au lendemain dans la roue en rotation à 63 ° C, 12 t/mn. Ne pas pipeter la sonde directement sur la tache, mais dans la solution de sperme de saumon tampon hybridation.
  8. Lavez la tache.
    1. Préchauffer les solutions de lavage (1 x PESS, SDS 0,1 % et 0,1 x SSPE, SDS 0,1 %) à 65 ° C. (20 x SSPE : 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7,0).
    2. Jeter la solution d’hybridation et ajouter environ 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solution SDS 0,1 % sur le tube de l’hybridation, fermer le tube et tournez à la main. Verser l’hybridation et la solution dans les déchets radioactifs liquides appropriés de lavage.
    3. Ajouter environ 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solution SDS 0,1 % dans le tube, fermer et incuber le tube à 63 ° C dans la roue en rotation, 12 t/mn pendant 15 minutes. Jeter la solution de nettoyage appropriée.
    4. Ajouter environ 100 – 150 mL de 0,1 x SSPE, solution SDS 0,1 % sur le tube de l’hybridation, fermer et faire pivoter le tube pendant 5 min à 63 ° C, 12 t/mn. Jeter la solution de nettoyage appropriée.
    5. Prenez la tache du tube et placez-le dans un bac contenant suffisamment préchauffé 0,1 x PESS, SDS 0,1 % et agiter pendant 3 min dans un bain d’eau secouer à 65 ° C. Pendant ce temps, rincez le filet dans un bac rempli d’eau.
    6. Sortez le blot, placez-le entre plastique plié à l’avance (tubes de polyéthylène), soigneusement essuyer l’excès de liquide et laisser la tache sécher brièvement. Notez que le liquide va ruiner l’écran phosphorimager.
    7. Sceller la tache en plastique sur les trois côtés. Enlever tout excès de liquide entourant la tache et fermer le tube en plastique en scellant le quatrième côté. Couper l’excédent de plastique. Assurez-vous que la tache scellée ne coule pas et que le plastique est sec à l’extérieur.
  9. Exposez l’écran phosphorimager.
    1. Placer la tache scellée dans une cassette de phosphorimager, avec l’écran de phosphorimager face à l’ADN de la tache. Fermez la cassette et laisser pendant ± 2 à 4 jours, selon la force du marquage radioactif et la sensibilité de la phosphorimager.
    2. Balayer l’écran de phosphorimager en utilisant un phosphorimager. Prendre soin d’exposer le moins possible à la lumière d’écran avant de les numériser. Enregistrer l’image. Effacer l’écran du signal en l’exposant à une lumière vive.
  10. Analyser la tache.
    1. L’analyse dépend de la stratégie de restriction utilisée à l’étape 4.1. Lorsqu’on analyse la tache préparée selon la stratégie indiquée à l’étape 4.1.1.1 (Figure 4 a), compter le nombre des fragments détecté. Dans cette stratégie, le nombre de fragments hybrides se réfère au nombre d’intégrations de l’ADN-T.
      1. Comparer le nombre des fragments détecté avec une sonde pour la gauche (Figure 7 b) et la partie de droite (Figure 7) de l’ADN-T.
        Remarque : Si un nombre différent de fragments d’hybridation est détecté, puis soit i) plusieurs copies de l’ADN-T (que ce soit en orientation inversée ou directe) ou ii) incomplètement intégré T-ADN est présents.
      2. Estimer la taille des fragments hybrides sur la tache selon la taille des bandes de marqueur et compare la taille des fragments hybridées avec le fragment attendu taille calculée basée sur la stratégie de restriction d’insertions en tandem (Figure 4 a) à identifier l’arrangement tandem possibles de l’ADN-T. Utilisez la Figure 4 a comme guide pour calculer la taille des fragments attendus.
        Remarque : Si la taille des fragments hybrides est en désaccord avec ceux calculés, puis très probablement celui des intégrations présentes n’est pas complète.
    2. Lorsqu’on analyse la tache préparée selon la stratégie indiquée à l’étape 4.1.1.2 (Figure 4 b), estimer la taille du fragment qui s’hybrident sur la tache, basée sur la taille des bandes de marquage et la comparer avec la taille attendue. Une insertion intacte donne un seul fragment d’une longueur définie. Toute déviation de la durée attendue indique intégration incomplète (Figure 7).
  11. Bande de la tache pour ré-hybridation (facultatif).
    Remarque : La même tache peut être hybridée consécutivement avec différentes sondes. Avant de poursuivre avec une nouvelle sonde, dépouiller une précédente sonde hybridée de la tache.
    1. Pour retirer la sonde de la tache, placer la tache dans un plateau avec son ADN-face vers le bas. Verser un excédent de 0,5 % SDS dans le bac. Faire bouillir la membrane pendant 2 à 5 min. La durée du traitement dépend de la taille et le contenu en GC de la sonde utilisée. Sondes longues et GC-richer besoin d’un traitement plus long.
    2. Après le décapage, la tache d’hybridation avec une autre sonde, ou sceller et conserver à-20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Grâce au système BIBAC-GW, journaliste des constructions pour l’étude des ODM dans les usines ont été généré10. Des constructions ont été conçues dans l’entrée passerelle vecteur pENTR-gm12 et insérées dans pBIBAC-BAR-GW (Figure 1) à l’aide de la réaction de recombinaison Gateway LR.

Arabidopsis ont été transformées avec pDM19, un plasmide BIBAC-BAR-GW avec un journaliste de mTurquoise-eYFP transportant un codon stop translationnelle dans la cadre de lecture d’eYFP postées sur 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (Figure 2)10. Au total, 126 plantes Arabidopsis étaient transformées (9 plantes par pot, pots de 14). Graines de ces plantes ont été mis en commun, semées sur des plateaux avec de la terre et autorisés à cultiver pendant deux semaines avant le traitement avec la solution de l’herbicide Glufosinate-ammonium. Seuls les semis exprimant le gène bar (présent dans BIBAC-BAR-GW) survivent au Glufosinate-ammonium (Figure 3). Au total, 11 organismes transgéniques transformées avec pDM19 ont été identifiés, correspondant à un rendement de transformation de 0,02 % des graines analysées.

Pour les 11 organismes transgéniques isolés, éponger d’ADN a été utilisé pour déterminer le nombre d’intégrations de l’ADN-T. À cette fin, l’ADN génomique a été coupé avec BglII ou ScaI (stratégie comme la mise au point sur la Figure 4 a). Deux de ces enzymes de restriction couper une seule fois dans la séquence de l’ADN-T (Figure 7 a). L’hybridation avec des sondes reconnaissant la barre et l’eYFP régions codantes a permis la détection du nombre de fragments d’ADN respectifs.

Le nombre d’ADN individuel des fragments sur les transferts autorisés pour estimer le nombre d’insertions d’ADN-T dans les lignes de journaliste (tableau 1). Unique fragments d’hybridation avec une sonde le Bar et l’eYFP ont révélé la présence d’une intégration de l’ADN-T unique. Depuis les 11 organismes transgéniques analysés, six porté seule intégrations. Le nombre moyen d’intégrations était de 1,2.

Pour 6 lignes transportant une intégration unique de l’ADN-T, l’intégrité de la construction de journaliste inséré a été testée avec ADN buvard (stratégie mise au point sur la Figure 4 b). L’ADN génomique a été coupé avec BglII et Pcij’ai pour libérer un fragment de 5,5 kb contenant le gène de fusion de la barre et le mTurquoise-eYFP (Figure 7 a). Une sonde contre eYFP servait à détecter le fragment attendu. Toutes les plantes étudiées porté un fragment intact. Notez que le fragment a examiné exclut la gauche et la frontière de l’ADN-T du droit et donc n’examine pas l’intégrité de l’ADN-T entier, mais seulement la partie contenant les transgènes d’intérêt.

L’expression du gène rapporteur fluorescent a été déterminée en indépendantes simple copie lignées transgéniques ne diffèrent que par l’emplacement de génomique de l’ADN-T. Niveaux de transcription relative du reporter mTurquoise-eYFP pilotée par le promoteur CaMV-35 s ont été mesurées par RT-qPCR en quatre lignes de journaliste DM19 transportant des intégrations intactes, exemplaire unique dont la position génomique a été déterminé10. La variation des niveaux d’expression de gène rapporteur entre les lignes était mineure : l’écart maximal de niveaux d’ARN mTurquoise-eYFP était 2 fois (Figure 8 a).

Ensuite, l’ODM a été réalisée dans ces lignées de journaliste. Trois sur les quatre lignes de journaliste indépendant ont montré l’efficacité ODM assez semblable (Figure 8 b). Toutefois, on line, DM19 [4] 1, a donné une très faible efficacité ODM par rapport aux autres lignes. Ces résultats indiquent que l’ODM est influencée par le contexte génomique local. De quelle manière le contexte local de génomique de l’intégration de l’ADN-T dans DM19 [4] 1 diffère de celle dans les autres lignes reste à être identifié. Analyse des données disponibles sur les marques de chromatine actifs et inactifs sur les sites d’intégration T-DNA génomiques de plantes non transgéniques n’a pas fourni une réponse à10.

Figure 1
Figure 1 : cartes fonctionnelles des vecteurs pBIBAC-GW. pBIBAC-GW dérivés sont disponibles avec une résistance au Glufosinate (bar) ou DsRed fluorescence dans les téguments (DsRed) comme marqueur de sélection chez les plantes. Pour les deux vecteurs, un gène de résistance kanamycine est le marqueur de sélection chez les bactéries. La passerelle BCDC cassette apparaît entre les pointes de flèches vertes représentant la recombinaison sites attR1 et R2 du att. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : construction de journaliste de mutagénèse. Les gènes de journaliste mTurquoise-eYFP sont pilotées par le promoteur CaMV 35 s. Le mTurquoise région codante est fusionnée à une eYFP codage région porteuse d’une mutation de C-A à la position de nucléotides 120, ayant pour résultat un codon d’arrêt translationnelle prématurée TAA et interruption prématurée de la traduction de la protéine de fusion. Le signal de polyadénylation Nopaline Synthase (nos 3') de 3′ sert à terminer la transcription de la construction de22. Signal de localisation nucléaire (SNA) est utilisé pour cibler les protéines traduites vers le noyau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : plateau rempli d’Arabidopsis semis avant et après traitement de Glufosinate-ammonium. Semis ne pas exprimant le gène de bar qui est présent dans la T pBIBAC-BAR-GW-matrice d’ADN après avoir pulvérisé avec solution de Glufosinate-ammonium. Les photos montrent le même plateau de semis (A) avant de pulvériser avec le Glufosinate-ammonium, 14 jours après le semis et (B) 10 jours plus tard, après avoir pulvérisé deux fois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : stratégie de restriction générale ADN afin d’identifier le nombre et le caractère intact d’inséré l’ADN-T. (A), un site de restriction (R) dans le milieu de l’ADN-T permet un sondage indépendant de la gauche (L rouge) et la partie droite de l’ADN-T (R vert). Les caricatures sur la droite montrent que selon les intégrations simple ou multi multicopies ADN-T, différents profils de bandes sont obtenus avec l’ADN buvard. Bandes marqués d’un * ont une longueur définie, tandis que la longueur des autres bandes dépend de site de restriction le plus proche dans l’accompagnement de l’ADN génomique. Seul insert : L et R sonder les deux donnent un fragment indépendant. La taille du fragment moyenne attendue peut être calculée basée sur la fréquence du site de restriction dans le génome. La taille minimale est la distance entre le site de restriction à la frontière de la gauche (LB) ou droite frontière (RB), selon quelle extrémité de l’intégration est étant sondée, et si l’ADN-T est intact. Répétition en tandem : Les sondes pour L et R donnent les deux deux fragments ; pour chaque sonde, un des fragments comprend flanquant l’ADN génomique, le deuxième fragment a une taille prévue et est identifié par les deux sondes. Inverted repeat : Selon la directionnalité de la cassette intégrée, soit L un et deux fragments de R, ou deux L et un R peuvent être identifiés. Individuelles insertions unique : Il en résulte un certain nombre de fragments indépendants, et le nombre de fragments correspond au nombre d’intégrations. (B) Restriction sites aux extrémités de l’ADN-T permettent de déterminer l’intégrité du fragment entre les sites de restriction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : un gel avec profil de restriction et de la transparence correspondante. (A) sur le gel d’agarose, l’ADN génomique digéré avec EcoRI est montré. La bonne digestion de l’ADN est illustrée par la présence de bandes satellites discrets. Marquage (B) la position des emplacements et des bandes de marquage sur une transparence permet par la suite facilement calculer la taille d’hybridation des fragments. Ici, les marqueurs de la MRC Holland (bleu et rouge) sont utilisés, indiquée par M. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : installation pour éponger capillaire. Dans un capillaire éponger d’installation, papier filtre est placé sur une plaque de plastique avec les extrémités du papier accroché dans 20 x SSC tampon. Le papier est humidifié avec 20 x SSC et un gel d’agarose, placé sur le dessus, suivie d’une membrane de nylon, papier filtre et une pile de tissus. Un poids léger est placé sur le dessus. Soin pour éliminer les bulles d’air entre le gel, le papier et la membrane. S’accrochent film est utilisée pour éviter l’assèchement de l’installation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : exemple d’ADN éponger la stratégie et les résultats expérimentaux. (A) ADN éponger la stratégie pour déterminer le nombre et le caractère intact des intégrations de l’ADN-T. Lieux de coupe des enzymes de restriction sélectionnés au sein de l’ADN-T est indiquées par des barres verticales. Les sondes eYFP et bar utilisés pour l’hybridation avec l’ADN génomique digéré sont indiqués à l’aide d’une ligne avec le point terminal au-dessous de l’ADN-T. (B–D) Exemple ADN blots. L’ADN génomique a été coupé avec ScaI et la tache a été sondée avec un bar et la eYFP sonde (B et C). L’ADN génomique a été coupé avec BglII et Pcij’ai et hybridé avec une sonde de bar . Des fragments intacts sont 5,5 kbp en taille (D). Notez que l’ensemble des échantillons en ré diffère de celles montrées en B et C. * indique la taille du fragment ATTENDU ; M, marqueur. Dans B, C et D le même marqueur de taille est utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : taux d’expression mTurquoise-eYFP et l’efficacité d’ODM lignes journaliste indépendant mTurquoise-eYFP. Niveaux de transcription (A) mTurquoise-eYFP Relative mesurées par RT-qPCR en lignes journaliste DM19. Pour la normalisation des niveaux de transcription de l’actine ont été utilisés. (B), ODM efficacité mesurée dans les lignes de journaliste DM19. Pour A et B, barres indiquent la moyenne d’au moins cinq réplicats biologiques. Barres d’erreur indiquent SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Type du locus de l’ADN-T Nr d’intégrations de l’ADN-T Ligne de journaliste Nombre de fragments détecté Intégrité
SCA J’ai BGL II BGL II/PciI
bar eYFP bar eYFP eYFP
Intégrations de locus unique 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2] -5 1 1 1 1 +
1 19 [2] -9 1 1 1 1 +
1 19 [2] -11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
répéter 2, inversé 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, l’intégration incomplète 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Plusieurs intégrations de locus 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND : non déterminé.

Tableau 1 : Synthèse de l’ADN éponger les données pour les organismes transgéniques isolé après transformation avec pDM19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Critique pour générer des organismes transgéniques avec des intégrations unique et intactes d’un transgène est le choix du vecteur binaire utilisé. Vecteurs de famille BIBAC ont été utilisés pour livrer les séquences des intérêts de nombreuses plantes espèces23,24,25,26,27,28. Vecteurs BIBAC, y compris BIBAC-GW, rendement exemplaire unique intégrations avec une grande efficacité : le nombre moyen d’insertions par ligne est 1,5 à 2, par rapport à 3 ou plus pour les5,9, , vecteurs binaires plus couramment utilisés 29. comme une amélioration importante par rapport aux autres vecteurs BIBAC, avec les vecteurs BIBAC-GW, les séquences d’intérêt peuvent être facilement insérés en utilisant la passerelle recombinaison sites12. Les vecteurs mis à jour le surmontent les problèmes généraux de vecteurs BIBAC lorsqu’il est utilisé dans les stratégies classiques de clonage : i) un nombre très limité de sites de restriction uniques et ii) un ADN de faible rendement. Les sites de recombinaison Gateway faire BIBAC-GW vecteurs une alternative intéressante aux autres vecteurs binaires pour générer des plantes transgéniques.

Une série de protocoles, de générer BIBAC-GW dérivés contenant des séquences d’intérêt, pour planter transformation et ADN tache analyse nombre et intégrité des séquences transgéniques est décrit ici. Plusieurs des protocoles présentées dans cet article, passerelle, clonage, électroporation des bactéries et la transformation des plantes, est une pratique courante dans de nombreux laboratoires et peut aussi être effectué avec de légères modifications. Il est important de savoir que BIBAC-GW est un vecteur de la simple copie chez e. coli et dans a. tumefaciens. Par conséquent, lorsque l’isolement de l’ADN, le rendement est faible ; Il est recommandé d’intensifier la technique d’isolation.

Dans transgénèse transportant plusieurs intégrations de l’ADN-T, des transgènes introduits sont souvent soumis à1,2,4,30de silençage génique et donc pour la plupart des applications proscrire. Pour identifier les plantes transgéniques avec des intégrations unique et intactes, il est recommandé d’utiliser l’analyse de l’ADN de tache. Tandis que d’autres méthodes que l’ADN buvard peut être utilisé pour déterminer le nombre de copies d’ADN-T et l’intégrité de l’ADN-T dans les lignées transgéniques (analyse de ségrégation, TAIL-PCR, quantitative PCR (qPCR) et digital gouttelette PCR), bien que du travail intensif, éponger l’ADN est souvent la méthode de choix. Analyse de la ségrégation n’est pas capable de différencier entre les multiples et intégrations d’ADN-T à locus unique de single. TAIL-PCR souvent sous-estime l’exemplaire numéro, surtout si plus d’une intégration de l’ADN-T est présent31et qPCR doit optimisation élaborée pour des résultats fiables31,32. Numérique goutte PCR est une méthode assez précise pour la détection de nombre de copie si l’équipement nécessaire est disponible31. L’avantage supplémentaire de transfert d’ADN est détection facile des tronqué T-ADN, qui n’est pas facilement respectée dans toutes les techniques basées sur la PCR.

Avec l’analyse de l’ADN de tache, les fragments d’hybridation sur la tache doivent être bien identifiable dans le signal et la taille. Plusieurs facteurs sont connus pour affecter l’issue du transfert d’ADN. Outre une sélection appropriée des enzymes de restriction (stratégie indiquée à la Figure 4) et marqueurs de taille, suffisamment ADN de bonne qualité est nécessaire. Moins de 2 µg de génomique Arabidopsis ADN ne donneront pas des fragments bien identifiables. Lorsqu’il s’agit des génomes plus grands, plus d’ADN est nécessaire. Pour obtenir des quantités suffisantes Arabidopsis ADN, 1 - semaine vieux plantules ou tissus floraux peuvent être utilisés. Un lot de plants cultivés sur une boîte de Pétri rapporte le 2 – 8 µg d’ADN. Afin d’éviter la dégradation de l’ADN lors de l’isolation, il faut traiter le matériel végétal rapide. En outre, l’ADN génomique devrait être resuspendue dans Tris-EDTA pour réduire sa dégradation par les nucléases et stocké à 4 ° C plutôt que-20 ° C afin d’empêcher l’ADN entaille due à répété des cycles gel-dégel. En cas de doute que tous les échantillons d’ADN sont complètement digérés, il est suggéré de rehybridize la tache de l’ADN avec une sonde reconnaissant une région génomique endogène, unique. Lors de la sélection de séquences de sonde pour identifier les séquences transgéniques ou endogènes, il est crucial de choisir uniquement des séquences uniques. Pour être en mesure de déterminer précisément la taille des fragments hybrides, les positions de l’ADN de gel fentes et bandes de marqueurs d’ADN doivent être marquées sur une transparence (Figure 5 b) lorsque visualisant un gel teinté du bromure d’éthidium (Figure 5 a) sur une UV transilluminateur. Dans le cas où les séquences de marqueur ne s’hybrident pas avec la sonde ADN ou l’hybridation est partielle, il est le seul moyen pour retrouver la taille d’hybridation des fragments.

Une fois veiller à atteindre le signal d’hybridation bon et estimation de la taille de fragment, l’interprétation des résultats Blot est simple. Quand en utilisant qu’une seule enzyme de restriction et s’hybridant avec différentes sondes détection soit la partie gauche ou droite de l’ADN-T, le nombre de fragments détectés reflète le nombre d’insertions d’ADN-T. Par exemple, Figure 7 b, C montre la même tache d’ADN, hybridé avec différentes sondes, bar (Figure 7 b) et une protéine fluorescente jaune (eYFP) (Figure 7), à l’aide de la stratégie illustrée à la Figure 7 a. Toutes les voies, sauf 4, montrent un nombre égal de fragments sur les deux transferts : deux fragments pour la ligne 6 et d’un fragment unique pour toutes les autres lignes. Ce nombre de fragments détectés est le nombre d’insertions d’ADN-T.

Lorsque le nombre de fragments détectées avec sondes liant la gauche ou la partie droite de l’ADN-T est différent (comme pour la Figure 7 bC, ligne 4), soit incomplètes insertions sont présentes, soit l’ADN-T ont inséré dans l’arrangement en tandem. Les insertions de tandem affichent de longueur de fragment non aléatoire pour un des fragments d’ADN-T (Figure 4 a, panneau de droite) et peuvent être identifiées en comparant la taille de fragment hybridée avec ce que l'on attend basée sur la stratégie de restriction. Une stratégie de transfert supplémentaire peut être nécessaire pour confirmer l’arrangement en tandem de l’insertion d’ADN-T. Dans l’exemple indiqué à la ligne 4 (Figure 7 b, C), deux insertions sont disposées dans une orientation répétition inversée.

Pour estimer le caractère intact d’un ADN-T, ou une partie de celui-ci, la longueur du fragment qui s’hybrident peut être calculée basée sur la stratégie de restriction. Tout écart par rapport à la taille attendue indique la présence d’une insertion incomplète. Par exemple, dans la Figure 7, en piste 4, un fragment qui s’hybrident migre à 8 kbp, (au lieu de la 5,5 attendus kbp) indiquant une taille de fragment accrue en raison de l’absence de l’un des sites de restriction.

BIBAC-GW vecteurs sont d’excellents outils pour générer des intégrations intactes exemplaire unique dans un certain nombre d’espèces végétales. Le protocole rapporté ici prévoit une procédure fiable pour identifier les plantes avec des intégrations unique et intactes d’un transgène d’intérêt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche est soutenue par le hollandais STW Foundation Technology (12385), qui fait partie de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), et qui est financé en partie par le ministère des affaires économiques (OTP Grant 12385 à MS).  Nous remercions Carol M. Hamilton (Cornell University, Etats-Unis) pour la fourniture de pCH20, l’épine dorsale des vecteurs BIBAC-GW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Tags

Génétique numéro 133 vecteur binaire BIBAC passerelle compatible vecteur binaire plant transformation intégration unique silençage génique ADN buvard transfert de Southern
Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter