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Genetics

BIBAC-गिनीकृमि द्विआधारी वेक्टर का उपयोग एकल-प्रतिलिपि सम्मिलन के साथ ट्रांसजेनिक संयंत्रों का सृजन

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

एक pBIBAC-गिनीकृमि द्विआधारी वेक्टर का प्रयोग बरकरार एकल प्रतिलिपि निवेशन, एक आसान प्रक्रिया के साथ ट्रांसजेनिक संयंत्रों पैदा करता है । यहां, प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत की है कि ट्रांसजेनिक Arabidopsis संयंत्रों पैदा करने की प्रक्रिया के माध्यम से पाठक गाइड, और अक्षुण्णता और आवेषण के प्रति संख्या के लिए पौधों का परीक्षण ।

Abstract

जब ट्रांसजेनिक पौधों पैदा, आम तौर पर उद्देश्य के लिए एक transgene के स्थिर अभिव्यक्ति है । यह transgene के एक एकल, बरकरार एकीकरण की आवश्यकता है, के रूप में बहु की नकल एकीकरण अक्सर जीन मुंह बंद करने के अधीन हैं । गेटवे-संगत बाइनरी वेक्टर अन्य pBIBAC डेरिवेटिव्स की तरह बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों (pBIBAC-गिनीकृमि) के आधार पर उच्च दक्षता के साथ एकल-प्रति transgenes के सम्मिलन की अनुमति देता है । मूल pBIBAC के लिए एक सुधार के रूप में, एक गेटवे कैसेट pBIBAC-गिनीकृमि में क्लोन किया गया है, ताकि ब्याज की जुगाड़ अब आसानी से गेटवे क्लोनिंग द्वारा वेक्टर स्थानांतरण डीएनए (टी डीएनए) में शामिल किया जा सकता है । सामांयतः, pBIBAC के साथ परिवर्तन-0.2 के एक दक्षता में गिनीकृमि परिणाम-0.5%, जिससे transgenics के आधा टी के एक बरकरार एकल प्रतिलिपि-डीएनए के एकीकरण ले । pBIBAC-गिनीकृमि वैक्टर पौधों में चयन के लिए बीज कोट में Glufosinate-अमोनियम या DsRed प्रतिदीप्ति प्रतिरोध के साथ उपलब्ध हैं, और बैक्टीरिया में एक चयन के रूप में कनमीसिन प्रतिरोध के साथ । यहां, प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत की है कि ट्रांसजेनिक संयंत्रों pBIBAC-गिनीकृमि का उपयोग कर पैदा करने की प्रक्रिया के माध्यम से पाठक गाइड: pBIBAC-गिनीकृमि पसंद के सदिश में ब्याज के दृश्यों के संयोजन से शुरू, के साथ संयंत्र परिवर्तन के लिए एग्रोबेक्टीरियम, transgenics का चयन, और डीएनए सोख्ता का उपयोग कर आवेषण की अक्षुण्णता और प्रतिलिपि संख्या के लिए पौधों का परीक्षण. ध्यान एक डीएनए सोख्ता रणनीति डिजाइन करने के लिए एक और बहु loci पर एकल और मल्टी कॉपी एकीकरण को पहचानने के लिए दिया जाता है ।

Introduction

ट्रांसजेनिक पौधों पैदा करते हैं, आमतौर पर उद्देश्य के लिए एकीकृत transgene (एस) छुरा व्यक्त किया है । यह एक transgene के अक्षुण्ण एकल प्रतिलिपि एकीकरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । एकाधिक एकीकरण एक transgene की अभिव्यक्ति में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन यह भी जीन मुंह बंद करने करने के लिए. transgenes के मुंह बंद करने अधिक संभावना है यदि संमिलित अनुक्रम मिलकर या उल्टे में व्यवस्था कर रहेहै1, 2, 3, 4 । बाइनरी वैक्टर एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन प्रयोगों में शटल के रूप में इस्तेमाल किया संयंत्र जीनोम में ब्याज की जुगाड़ देने के लिए कर रहे हैं । एक संयंत्र जीनोम में एकीकरण की संख्या एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens5,6में बाइनरी वेक्टर की प्रतिलिपि संख्या पर निर्भर है। कई सामांयतः इस्तेमाल किया द्विआधारी वैक्टर उच्च प्रतिलिपि वैक्टर हैं, और इसलिए एक उच्च औसत transgene कॉपी संख्या: 3.3 के लिए 4.9 प्रतियां Arabidopsis5में उपज ।

t-dna एकीकरणों की संख्या को बाइनरी वैक्टर का उपयोग करके कम किया जा सकता है जो a. tumefaciensमें एक कम-प्रतिलिपि संख्या है, जैसे BIBAC7, या a. tumefaciens गुणसूत्र5से एक T-dna लॉंच करके । ऐसे मामलों में transgene एकीकरणों की औसत संख्या 25,8,9,10से नीचे है । A. tumefaciens में एकल-प्रतिलिपि होने के कारण, और भी ई कोलाईमें, BIBAC-डेरिवेटिव बनाए रखने और 150 kb11के रूप में बड़े रूप में constructs वितरित कर सकते हैं ।

गिनीकृमि-संगत BIBAC वैक्टर10,12 में ब्याज की जीन का आसान परिचय की अनुमति गेटवे क्लोनिंग का उपयोग कर वेक्टर में । गेटवे प्रौद्योगिकी का उपयोग बहुत क्लोनिंग प्रक्रिया को सरल, लेकिन यह भी आम बड़ी कम कॉपी-संख्या वैक्टर13,14, जैसे एक कम डीएनए उपज और अद्वितीय प्रतिबंध के एक सीमित चयन के रूप में के साथ जुड़े समस्याओं पर काबू 7,11क्लोनिंग के लिए उपलब्ध साइटें । pBIBAC-गिनीकृमि डेरिवेटिव Glufosinate के लिए या तो प्रतिरोध के साथ उपलब्ध है-अमोनियम (pBIBAC-बार-गिनीकृमि) या बीज कोट में DsRed प्रतिदीप्ति (pBIBAC-आरएफपी-गिनीकृमि) पौधों में चयन के लिए (चित्रा 1)10,12। दोनों वैक्टर के लिए, एक कनमीसिन प्रतिरोध जीन बैक्टीरिया में चयन मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

pBIBAC-गिनीकृमि वैक्टर गठबंधन: (1) आसान डिजाइन और ई. कोलाईमें आनुवंशिक हेरफेर, और (2) बरकरार एकल उच्च दक्षता पर planta में नकल एकीकरण । pBIBAC-गिनीकृमि वैक्टर एक एकल एकीकृत टी-डीएनए10ले जाने के ट्रांसजेनिक पौधों के लगभग आधे के साथ Arabidopsis में औसत 1.7 एकीकरण पर उपज ।

transgenes के स्थिर अभिव्यक्ति सबसे transgenics उत्पंन के लिए एक आवश्यकता है । स्थिर transgene अभिव्यक्ति अक्षुण्ण, एकल प्रतिलिपि एकीकरण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । ट्रांसजेनिक पौधों को बरकरार रखने के साथ कार्य करना, एकल-प्रतिलिपि एकीकरण है, तथापि, और भी अधिक महत्वपूर्ण यदि उदाहरण के लिए, उद्देश्य क्रोमेटिन आधारित प्रक्रियाओं की दक्षता का अध्ययन करने के लिए है, जैसे mutagenesis, पुनर्संयोजन, या मरंमत, और इन की निर्भरता संमिलन स्थल पर जीनोमिक स्थान और क्रोमेटिन संरचना पर कार्यवाई करता है । हमारे हित के लिए, स्थानीय जीनोमिक संदर्भ पर oligonucleotide निर्देशित mutagenesis (ODM) की निर्भरता का अध्ययन करने के लिए, बरकरार, एक mutagenesis रिपोर्टर जीन की एक प्रतिलिपि एकीकरण के साथ रिपोर्टर लाइनों का एक सेट उत्पन्न किया गया था (चित्रा 2)10. लाइनों के इस सेट का उपयोग करते हुए यह दिखाया गया है कि ODM दक्षता अलग जीनोमिक स्थानों पर एकीकृत ट्रांसजेनिक loci के बीच, transgene अभिव्यक्ति के बजाय समान होने के स्तर के बावजूद भिन्न होता है ।

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Protocol

1. बाइनरी वेक्टर में ब्याज की अनुक्रम डालने

  1. गेटवे प्रविष्टि और बाइनरी वैक्टर तैयार करें ।
    1. अलग गेटवे प्रवेश वेक्टर एक डीएनए टुकड़ा युक्त या ब्याज की जीन आपूर्तिकर्ता के सुझावों के अनुसार एक मिनी तैयारी किट का उपयोग कर ।
      नोट: BIBAC-गिनीकृमि वैक्टर बैक्टीरिया में चयन के लिए कनमीसिन (किमी) के उपयोग की आवश्यकता होती है, इसलिए, एक प्रवेश सदिश के बजाय एक और प्रतिरोध मार्कर के साथ कनमीसिन का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, pENTR-जीएम वेक्टर, एक Gentamicin प्रतिरोध जीन ले जाने, एक अच्छा विकल्प12है ।
    2. प्रचार और BIBAC-गिनीकृमि ब्याज के सदिश को अलग । एक ई. कोलाई तनाव है कि ccdB गेटवे कैसेट के भीतर मौजूद जीन की विषाक्तता के लिए प्रतिरोधी है का प्रयोग करें । अलग BIBAC-वैक्टर प्रोटोकॉल या विशेष रूप से बड़े plasmids के लिए डिजाइन किट का उपयोग आपूर्तिकर्ता के सुझावों के अनुसार ।
  2. एक गेटवे प्रतिक्रिया ले ।
    1. आपूर्तिकर्ता के सुझावों के अनुसार LR पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया तैयार करें । कमरे के तापमान (आरटी) में एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निंनलिखित घटकों को मिलाएं: 100-300 एनजी प्रवेश क्लोन (supercoiled), 300 BIBAC के एनजी-गिनीकृमि वेक्टर, LR Clonase प्रतिक्रिया बफर (अंतिम एकाग्रता: 1x) । मिश्रण की मात्रा को ते के साथ 16 µ l को समायोजित करें (10 mm Tris, EDTA के 1 मिमी, पीएच 8.0). अंत में, LR Clonase एंजाइम मिश्रण के 4 µ एल जोड़ें, और भंवर से मिश्रण । 1 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण की मशीन ।
    2. कदम 1.2.1 में तैयार मिश्रण करने के लिए Proteinase कश्मीर समाधान (2 µ जी/µ एल) के 2 µ एल जोड़कर LR प्रतिक्रिया समाप्त । मिश्रण और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  3. electroporation द्वारा गेटवे प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ ई. कोलाई रूपांतरण ।
    1. electroporation से पहले LR प्रतिक्रिया मिश्रण नमक ।
      नोट: यह चरण सफल electroporation के लिए महत्वपूर्ण है । एक डायलिसिस विधि के नीचे वर्णित है, लेकिन सोडियम एसीटेट और इथेनॉल के साथ वर्षा के रूप में अंय तरीकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      1. LR प्रतिक्रिया के फिल्टर डायलिसिस के लिए सेटअप तैयार करते हैं । एक बाँझ पेट्री पकवान में ultrapure जल के 20 मिलीलीटर डालो । एक झिल्ली फिल्टर डिस्क प्लेस (ताकना आकार = ०.०२५ µm) पानी की सतह पर ।
      2. पिपेट पूरी LR प्रतिक्रिया झिल्ली के शीर्ष पर ध्यान से और 1 एच के लिए आर टी पर dialyze मिश्रण की अनुमति देते हैं ।
    2. एक electroporation cuvette (0.1 cm) में इलेक्ट्रो-सक्षम DH10B कोशिकाओं को नमकीन LR मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें । Electroporate कोशिकाओं (1.5 V/सेमी, प्रतिरोध 200 Ω, समाई 25 µF), और तुरंत जोड़ने के लिए 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म सुपर इष्टतम Catabolite दमन (समाज) के माध्यम से कोशिकाओं, 37 ° c पर मशीन के बाद 45 मिनट, 180 rpm के लिए । (समाज मध्यम, 1 एल: Bacto tryptone के 20 जी, खमीर निकालने के 5 जी, NaCl के 0.5 ग्राम, 1m KCl के 2.5 मिलीलीटर, 1 एम फिल्टर के 20 मिलीलीटर-निष्फल ग्लूकोज) ।
      नोट: DH10B कोशिकाओं को छुरा से बड़े plasmids बनाए रखने के अंय ई. कोलाई कोशिकाओं के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
      नोट: इष्टतम electroporation स्थितियों electroporation डिवाइस उपयोग पर निर्भर हैं ।
    3. गोली 30 एस के लिए अधिकतम गति से बैक्टीरिया एक microcentrifuge का उपयोग कर, अतिरिक्त समाज को हटाने, और Luria-Bertani (पौंड) मध्यम के लगभग कैलरी µ एल में गोली reसस्पेंड । कनमीसिन-पौंड (किमी पौंड) प्लेटों (किमी एकाग्रता, 40 µ g/एमएल) पर जीवाणुओं का प्रसार, और 37 डिग्री सेल्सियस रात भर में प्लेटें मशीन । (पौंड मध्यम, 1 एल: Bacto tryptone के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 जी, NaCl के 10 ग्राम । ठोस माध्यम के लिए जोड़ें आगर, 15 g/L) ।
  4. संयुक्त BIBAC-गिनीकृमि डेरिवेटिव और अलग प्लाज्मिड डीएनए की पहचान ।
    1. को किमी पौंड प्लेटों पर बढ़ने में सक्षम हो, ई. कोलाई कोशिकाओं संयुक्त BIBAC-गिनीकृमि प्लाज्मिड जिसमें ccdB अनुक्रम वांछित डालने के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है शामिल करना चाहिए । उपयोग कॉलोनी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)15 जांच करने के लिए यदि प्लेट पर बैक्टीरिया कालोनियों सही plasmids, BIBAC-गिनीकृमि रीढ़ और ब्याज की डालने वाले होते हैं ।
      1. pBIBAC-बार-गिनीकृमि रीढ़ की पहचान करने के लिए, प्राइमरों DM1969 5 '-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 ' और DM1970 5 '-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3 ' के साथ एक पीसीआर15 प्रतिक्रिया करते हैं । इस पुस्तक सेट एक बार जीन के 563 बीपी टुकड़ा प्रवर्धित ।
      2. BIBAC-आरएफपी-गिनीकृमि रीढ़ की उपस्थिति के लिए जांच करने के लिए, एक पीसीआर15 प्रतिक्रिया प्रदर्शन, प्राइमरों M737 5 '-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 ' और M892 5 '-AACAGATGGTGGCGTCCC-3 ' का उपयोग कर । इस पुस्तक संयोजन एक cruciferin मोटर और आरएफपी अनुक्रम अतिव्यापी एक 790 बीपी टुकड़ा प्रवर्धित ।
      3. पीसीआर15 प्रतिक्रियाओं का उपयोग जीन विशिष्ट प्राइमरों के हित के डालने की उपस्थिति के लिए जांच करने के लिए ।
    2. Inoculate एक एकल सकारात्मक कॉलोनी में 2-पौंड मध्यम से 5 मिलीलीटर युक्त कनमीसिन (40 µ जी/एमएल) डीएनए अलगाव के लिए16। 180 rpm, रातोंरात में एक कक्षीय शेखर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    3. प्लाज्मिड डीएनए को अलग (1.1.2 कदम देखें) ।

2. Arabidopsis के पुष्प सूई के लिए अ. tumefaciens की तैयारी

  1. ए. tumefaciensको BIBAC गिनीकृमि डेरिवेटिव रूपांतरण ।
    1. ए. tumefaciens तनाव C58C1 के pCH32 सहायक प्लाज्मिड7ले जाने के इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं को तैयार । टेट्रासाइक्लिन (5 µ g/ml) और रिफैंपिसिन (100 µ g/ml) की उपस्थिति में जीवाणुओं का विकास pCH32 के लिए चयन करने और केवल एग्रोबेक्टीरियम कक्षों की वृद्धि सुनिश्चित करने के लिए ।
    2. एक pBIBAC-गिनीकृमि व्युत्पंन के 0.25-0.5 µ जी डीएनए जोड़ें, पूर्व में भंग 10 – 20 µ l बाँझ ultrapure जल, में 20 µ एल सक्षम एग्रोबेक्टीरियम कोशिकाओं electroporation cuvettes (0.1 सेमी). कोशिकाओं को बर्फ पर रखें ।
    3. Electroporate कोशिकाओं (1.5 V/cm, प्रतिरोध 400 Ω, समाई 25 µF) । electroporation के तुरंत बाद, 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म (28 डिग्री सेल्सियस) बैक्टीरिया को समाज माध्यम जोड़ें और 60-90 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
    4. फैले 100 µ एल और अलग पौंड रिफैंपिसिन युक्त प्लेटों पर बैक्टीरिया के बाकी (100 µ जी/एमएल), टेट्रासाइक्लिन (5 µ जी/एमएल), और कनमीसिन (40 µ जी/एमएल), और 28 ° c पर अंधेरे में गर्मी 1-2 दिनों के लिए ।
  2. एग्रोबेक्टीरियम निलंबन की तैयारी करें ।
    1. पीसीआर द्वारा जांच चरण 2.1.4 में तैयार प्लेट से ए. tumefaciens कालोनियों के एक जोड़े, सही सदिश की उपस्थिति के लिए (कदम 1.4.1 देखें) ।
    2. लकीर एक भी कॉलोनी एक पौंड एंटीबायोटिक युक्त प्लेट पर उचित डालने के साथ द्विआधारी वेक्टर शामिल करने की पुष्टि की (कदम 2.1.4 देखें) । 28 डिग्री सेल्सियस रात में बढ़ती है ।
    3. एक एकल चरण -8 में प्राप्त कॉलोनी के साथ लकीर दोहराएं ।
    4. Inoculate नियंत्रण रेखा के 2.5 मिलीलीटर में एक एकल कॉलोनी एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (देखें चरण 2.1.4) संस्कृति के लिए । 180 rpm पर कम से 8 ज या रात भर के लिए 28 ° c पर मशीन । (LC मध्यम, 1 एल: Bacto tryptone के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 जी, NaCl के 0.5 जी, 2.5 जी के MgSO4 · 7H2ओ, 2 जी के माल्टोज़) ।
    5. चरण 2.2.4 से संस्कृति जोड़ें । करने के लिए 250 मिलीलीटर नियंत्रण एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (कदम 2.1.4 देखें) और 28 ° c पर, 180 rpm, रातोंरात पर हो जाना ।
    6. 12 मिनट के लिए 5,500 x जी में कताई द्वारा संस्कृति गोली फिर से 100 मिलीलीटर समाधान में गोली निलंबित 5% सुक्रोज, 0.05% Silwet L-77, 0.5 x MS । पौधों की सूई पुष्प के लिए एक बाँझ कंटेनर में निलंबन डालो ।

3. Arabidopsis परिवर्तन

  1. परिवर्तन के लिए Arabidopsis पौधों को तैयार करें ।
    1. एक ग्रीनहाउस या जलवायु नियंत्रित विकास चैंबर में Arabidopsis संयंत्रों बढ़ने जब तक वे (9 के साथ 12 बर्तन फूल रहे है प्रत्येक सूई के प्रति प्रत्येक पौधे) ।
    2. क्लिप पहले बोल्ट और अधिक माध्यमिक बोल्ट उभरने के लिए अनुमति देते हैं । पौधों की सूई के लिए तैयार है 4-6 दिन कतरन के बाद, जब पौधों कई अपरिपक्व फूल सिर और नहीं कई निषेचित siliques है ।
  2. पुष्प सूई
    1. 5-10 एस में एग्रोबेक्टीरियम के लिए डुबकी फूलना चरण 2.2.6 में तैयार निलंबन । कोमल आंदोलन का प्रयोग करें ।
    2. नमी उच्च रखने के लिए चिपकी फिल्म में पौधों के ऊपर-जमीन भागों लपेटें, और एक बॉक्स के साथ संयंत्र बर्तन कवर करने के लिए अंधेरे में पौधों रखने के लिए । एक ग्रीनहाउस/विकास चैंबर में 2 दिनों के लिए पौधों की मशीन ।
    3. बॉक्स और पकड़ फिल्म निकालें और एक ग्रीनहाउस/विकास चैंबर में परिपक्वता के लिए पौधों को विकसित करना ।
      नोट: परिवर्तन की दक्षता बढ़ाने के लिए, एक ही पौधे को पहली सूई के बाद 7 दिन फिर से डूबा जा सकता है ।
    4. बीज फसल । पूल और पौधों की (T1) बीज का विश्लेषण, एक ही सेट के रूप में एक ही निर्माण के साथ बदल दिया है ।
  3. ट्रांसजेनिक संयंत्रों के लिए स्क्रीन ।
    1. ट्रांसजेनिक संयंत्रों के लिए स्क्रीन एक pBIBAC के साथ तब्दील-आरएफपी-गिनीकृमि व्युत्पंन, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बीज का विश्लेषण । आदेश में बीज कोट में DsRed अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए, एक उत्तेजना पर बीज छवि 560 एनएम और 600 के उत्सर्जन-650 एनएम । संदंश का उपयोग गैर फ्लोरोसेंट समकक्षों से फ्लोरोसेंट बीज अलग ।
    2. ट्रांसजेनिक पौधों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक pBIBAC के साथ तब्दील-बार-गिनीकृमि व्युत्पंन, मिट्टी से भरी ट्रे में बीज बोना (~ 2,500 बीज/ को सुनिश्चित करने के लिए एक भी बीज की ट्रे पर फैल, 0.1% में बीज सस्पेंड 0.5 x Murashige Skoog मध्यम (एमएस) में, और एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर बीज फैल ।
      नोट: एक तुल्यकालिक तरीके से अंकुरित करने के लिए बीज को उत्तेजित करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 दिनों के लिए बीज की मशीन । यह बीज बोने से पहले या बाद में किया जा सकता है ।
      1. ट्रे में बुआई के बाद 0.5% Glufosinate-अमोनियम समाधान 2 सप्ताह और 3 सप्ताह के साथ अंकुर स्प्रे करें । 1 मीटर2प्रति Glufosinate-अमोनियम सॉल्यूशन का 500 मिलीलीटर उपयोग करें ।
      2. व्यक्तिगत बर्तन के लिए जीवित अंकुर स्थानांतरण । अंकुर के साथ एक ट्रे की एक ठेठ छवि से पहले और बाद (दूसरा) Glufosinate-अमोनियम ट्रीटमेंट चित्रा 3में दिखाया गया है ।
      3. Glufosinate-अमोनियम-प्रतिरोधी संयंत्रों के हित के निर्माण की उपस्थिति के लिए पीसीआर द्वारा विश्लेषण (चरण 1.4.1. प्राइमरों के लिए देखें) ।
        1. जीनोमिक एडवर्ड्स एट अल द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर पीसीआर के लिए संयंत्र डीएनए को अलग. 17

4. टी-डीएनए एकीकरण की संख्या और अखंडता के लिए निस्र्पक Transgenics

  1. प्रतिबंध डाइजेस्ट की रणनीति
    नोट: टी डीएनए एकीकरण और उनकी अखंडता डीएनए सोख्ता द्वारा प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर की संख्या निर्धारित करें । इस विधि एकल की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक ही या जीनोम में अलग loci पर दोहराया एकीकरण ।
    1. संभव विभिंन एकीकरण पैटर्न की पहचान करने के लिए प्रतिबंध डाइजेस्ट की एक श्रृंखला का उपयोग करें:
      1. एक एंजाइम है कि टी डीएनए के बीच में एक बार कटौती का चयन करें, स्वतंत्र रूप से जांच करने के लिए सक्षम हो ऊपर और प्रतिबंध स्थल के बहाव अनुक्रम (चित्रा 4a और चित्रा 7A-सी) । चित्र 4aदेखें, और अपेक्षित परिणाम और व्याख्या के लिए चित्रा लीजेंड ।
      2. एक एंजाइम या एक बार में ब्याज की पूरी अनुक्रम काटने एंजाइमों के संयोजन का चयन करें (चित्रा 4B और चित्रा 7A-डी) । ज्ञात लंबाई से कोई विचलन एकीकृत कैसेट के जनचेतना को इंगित करता है.
        नोट: केवल प्रतिबंध एंजाइमों कि cytosine मिथाइल के प्रति संवेदनशील नहीं है का उपयोग करने के लिए ध्यान रखना ।
  2. जीनोमिक डीएनए के नमूने तैयार करें ।
    1. ब्याज के निर्माण को लेकर पौधों से जीनोमिक डीएनए को अलग । डीएनए अलगाव18के लिए एक CTAB डीएनए miniprep विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है । Arabidopsis डीएनए के डीएनए ब्लाट विश्लेषण के लिए, 2 – जीनोमिक डीएनए के 2.5 µ जी की जरूरत है । के डीएनए को भंग कर 50 µ l ते में ।
    2. जेल ट्रो द्वारा डीएनए अखंडता की जांच करें16। बरकरार जीनोमिक डीएनए जेल के शीर्ष पर एक असतत बैंड के रूप में स्थानांतरित कर । डीएनए क्षरण एक धब्बा की उपस्थिति के रूप में पहचाना जा सकता है । दोहराया ठंड-गल के कारण डीएनए क्षति से बचने के लिए, जीनोमिक डीएनए नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है ।
    3. जीनोमिक डीएनए (2-2.5 µ g Arabidopsis जीनोमिक डीएनए के मामले में 50 µ एल की कुल मात्रा में) डाइजेस्ट, रातोंरात, बफर एंजाइम आपूर्तिकर्ता द्वारा सुझाए गए शर्तों का उपयोग कर ।
      1. एक परीक्षण ट्यूब में, मिश्रण 2 – 2.5 µ g of Arabidopsis जीनोमिक डीएनए, 5 µ l 10x प्रतिबंध बफर, और 5 यू प्रतिबंध एंजाइम में कुल 50 µ l ultrapure जल.
    4. एक जेल पर लोड करने से पहले प्रतिबंध के नमूने के लिए लोड हो रहा डाई (1x अंतिम एकाग्रता) जोड़ें । अच्छा दृश्य ट्रैकिंग के लिए, निम्न में से किसी एक का उपयोग करें: छोटे अंशों के साथ comigrating (Bromophenol नीला, 350 – 400 bp), या comigrating बड़े अंशों के साथ (Cylene cyanol, 3 – 4 kbp).
  3. डीएनए जेल चला ।
    1. एक लंबा (20 सेमी) 0.5 x TBE agarose जेल19तैयार करें । जेल में agarose का प्रतिशत टुकड़ा अपेक्षित आकार पर निर्भर करता है । 0.8 – 1% अधिकतम अंशों को अलग करता है > 1 kb आकार में । अंशों के लिए 1 – 1.5% agarose का उपयोग करें < 1 kb । Ethidium ब्रोमाइड को जेल में न डालें । (5x TBE, 1 एल: Trizma बेस के 54 ग्राम, बोरिक एसिड की 27.5 ग्राम, EDTA के 3.75 ग्राम) ।
      नोट: डीएनए संदूषण को रोकने के लिए, जेल ट्रे का उपयोग करें कि fractionate प्लाज्मिड और पीसीआर परिवर्धित डीएनए के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं ।
    2. 19जेल पर नमूने लोड ।
    3. डीएनए मार्करों जेल है कि अपेक्षित टुकड़े की आकार सीमा में है जोड़ें । मार्कर के लगभग 1 µ जी लोड (50-250 अलग आकार टुकड़ा के एनजी) जेल पर यूवी प्रकाश द्वारा दृश्य की अनुमति के लिए ।
    4. आकार-fractionate एक कम वोल्टेज पर डीएनए (40-50 वी/
  4. agarose जेल से नायलॉन झिल्ली के लिए डीएनए के हस्तांतरण के लिए तैयार करते हैं ।
    1. एक अलग ट्रे को जेल स्थानांतरण, और यह 20 के लिए दाग-0.5 x TBE युक्त Ethidium ब्रोमाइड में 25 मिनट (5 µ जी/एमएल) 40 rpm पर एक कक्षीय शेखर पर घूर्णन द्वारा ।
    2. एक यूवी transilluminator पर जेल कल्पना । जीनोमिक डीएनए का आकार पृथक्करण, असतत उपग्रह बैंड की दृश्यता सहित सत्यापित करें (चित्र 5 ए) । कम आणविक वजन आकार के प्रति एक धब्बा डीएनए क्षरण इंगित करता है ।
    3. यूवी transilluminator पर, जेल पर एक पारदर्शिता रखना, और स्लॉट की स्थिति और एक मार्कर पेन (चित्रा 5B) के साथ मार्कर बैंड निशाना. यह मार्कर अनुक्रम जांच डीएनए के साथ विशेष रूप से संकरण नहीं है मामले में बाद में संकरित टुकड़ों के आकार का निर्धारण करने की सुविधा होगी । इस चरण में मार्कर अंशों को इंगित करके, यह hybridizing अंशों के आकार को ट्रैक करने के लिए संभव है ।
    4. जेल को वापस ट्रे में रखें, ultrapure के पानी से कुल्ला करें और जेल के भीतर डीएनए को fragmentize करने के लिए 15 मिनट के लिए 0.25 मीटर एचसीएल में इसे जलमग्न कर लें । ultrapure के पानी से धो लें । ट्रे में जेल को कवर करने के लिए पर्याप्त HCl और पानी का उपयोग करें, और एक कक्षीय शेखर पर 40 rpm पर जलमग्न जेल के साथ ट्रे घुमाएं ।
    5. विकार बफर में ultrapure के साथ 30 मिनट धोने के लिए जेल में मशीन पानी । ट्रे में जेल कवर करने के लिए पर्याप्त बफर और पानी का उपयोग करें, और एक कक्षीय शेखर पर 40 rpm पर जलमग्न जेल के साथ ट्रे घुमाएं । (विकार बफर: ०.५ मीटर NaOH, १.५ मीटर NaCl).
    6. ultrapure जल के साथ 30 मिनट धोने के लिए बेअसर बफर में जेल मशीन । ट्रे में जेल कवर करने के लिए पर्याप्त बफर और पानी का प्रयोग करें, एक कक्षीय शेखर पर 40 rpm पर जलमग्न जेल के साथ ट्रे घुमाएं । (बेअसर बफर: 0.5 मीटर Tris, 1.5 मीटर NaCl, 220 mM एचसीएल, पीएच 7.6) ।
  5. एक नायलॉन झिल्ली के लिए डीएनए स्थानांतरण ।
    1. जीनोमिक डीएनए के केशिका हस्तांतरण के लिए सेटअप तैयार करते हैं । एक प्लास्टिक की थाली प्लेस (लगभग जेल या बड़ा के आकार) एक 20x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) से भरी ट्रे पर । ट्रे के ऊपर मोटे फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा फ़ोल्ड करें, जिससे उसके सिरों के दोनों हिस्से एसएससी में लटक जाएं । एक जेल में कटौती-सकारात्मक चार्ज नायलॉन झिल्ली Hybond N + के टुकड़े आकार, और मोटी फिल्टर कागज के 2 टुकड़े । (20x SSC: 3 एम NaCl, 0.3 m सोडियम साइट्रेट).
    2. सोख्ता सेटअप (चित्रा 6) जेल, स्लॉट्स प्लास्टिक की थाली पर फिल्टर पेपर के शीर्ष पर नीचे रखकर तैयार करें । शीर्ष पर एक Hybond N + झिल्ली प्लेस, फ़िल्टर कागज के 2 परतों के बाद । पूर्व 20x एसएससी में प्रत्येक परत गीला उंहें विधानसभा में जोड़ने से पहले । इन परतों के बीच में किसी भी हवा में बुलबुले को हटाने के रूप में इन डीएनए हस्तांतरण में बाधा सुनिश्चित करें ।
    3. टिशू पेपर की एक मोटी परत के साथ विधानसभा कवर । एक प्लास्टिक की थाली को एक वजन के साथ रखें, जैसे कि एक छोटी बोतल, शीर्ष पर । यकीन है कि दबाव समान रूप से जेल पर विभाजित है बनाओ । इससे डीएनए का उचित हस्तांतरण सुनिश्चित होगा ।
      नोट: वजन के बारे में होना चाहिए 200 – 300 g; भारी वजन डीएनए हस्तांतरण में बाधा ।
    4. उजागर फिल्टर पेपर सहित विधानसभा, आसपास के क्षेत्र को कवर (चित्रा 6) 20x एसएससी बफर के वाष्पीकरण से बचने और नायलॉन झिल्ली की ओर केशिका बलों को लक्षित करने के लिए । दाग रातोंरात ।
    5. पेंसिल के साथ झिल्ली के शीर्ष पर स्लॉट, नाम, और/या दिनांक की स्थिति चिह्नित करें, और असेंबली से झिल्ली निकालें । ध्यान दें कि नीचे की ओर है कि जेल के साथ संपर्क में रहा है, डीएनए किया जाता है ।
    6. तुरंत यूवी विकिरण द्वारा झिल्ली को ठीक डीएनए (२,४०० µJ/एम2) एक यूवी Crosslinker का उपयोग कर ।
      नोट: Crosslinking शर्तें उपयोग की गई झिल्ली के प्रकार पर निर्भर करती हैं ।
      नोट: इस बिंदु पर झिल्ली-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में एक जांच के साथ संकरण के लिए इस्तेमाल किया । 2x एसएससी में crosslinked झिल्ली कुल्ला और यह-20 डिग्री सेल्सियस पर रखने से पहले पूर्व जोड़ गर्मी सील पॉलीथीन टयूबिंग में सील ।
  6. संकरण के लिए जांच की तैयारी करें ।
    1. पीसीआर20द्वारा डीएनए सोख्ता के लिए जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा अनुक्रम बढ़ाना । एक 250 बीपी-2 kbp पीसीआर अंश की कैलरी एनजी का प्रयोग जांच के तौर पर किया जाता है । दो अलग जांच, सही सीमा समीपस्थ क्षेत्र के लिए एक hybridizing और टी डीएनए की बाईं सीमा समीपस्थ क्षेत्र के लिए दूसरे, पूरे टी डीएनए की उपस्थिति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 4a और चित्रा 7).
    2. एक टेस्ट ट्यूब में ultrapure के 24 µ एल में पीसीआर प्रोडक्ट की कैलरी एनजी को पतला करना ।
    3. पतला पीसीआर उत्पाद इसे पानी या गर्मी ब्लॉक के एक चोंच में 5 मिनट के लिए उबलते द्वारा प्रकृति, तो बर्फ पर सीधे शांत ।
    4. गल बना GCT-बर्फ पर मिश्रण । (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (सभी 0.5 मिमी), यादृच्छिक hexamers ४३.२ एनजी/µ एल, Acetylated BSA 1.33 मिलीग्राम/एमएल, 33 मिमी के β-mercaptoethanol, ०.६७ एम Hepes, ०.१७ मिमी Tris पीएच 6.8, 17 मिमी MgCl).
    5. पीसीआर प्रोडक् ट को GCT-मिक्स और Klenow के 2 यू के 21 µ l को जोड़ें ।
    6. 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और मशीन के लिए [32P] एटीपी के 2 µ एल जोड़ें
      चेतावनी: सभी [32पी शामिल कदम] एटीपी के लिए एक रेडियोधर्मी काम के लिए नामित किया, जबकि उचित सुरक्षा का उपयोग करने की जरूरत है ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि [32P] एटीपी ताजा है (नहीं 1 आधे से अधिक समय बीत चुका है) ।
    7. एक Sephadex G-50 (मोटे या मध्यम) स्तंभ21 को (रेडियोधर्मी) न्यूक्लियोटाइड से लेबल जांच को शुद्ध करने के लिए तैयार करें । एक 2 मिलीलीटर सिरिंज ले लो, और मोटी फिल्टर कागज के एक छोटे से सर्कल के साथ आउटलेट को कवर किया । Sephadex जी के 2 मिलीलीटर-50 सिरिंज में ते में भंग जोड़ें, और कताई द्वारा कॉलम से सभी तरल हटा दें ।
    8. एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में कॉलम प्लेस, कॉलम पर लेबल जांच लोड, और कमरे के तापमान पर स्पिन (750 x जी पर केंद्रापसारक सेट, rpm को बढ़ाने के लिए जब तक 750 x जी तक पहुंच गया है, तो रोकने के केंद्रापसारक और रोटेशन को अस्वीकार करने की अनुमति 0 x g) elute करने के लिए जांच की । के 200 µ l को कॉलम में ते और स्पिन को elute शेष जांच के लिए जोड़ें; एक बार दोहराएं । इन स्थितियों में, लेबल डीएनए टुकड़े Sephadex मैट्रिक्स और elute से बाहर रखा गया है, जबकि मुक्त न्यूक्लियोटाइड कॉलम में रहते हैं ।
    9. संकरण ट्यूब प्रति लेबल जांच के 300 µ l का उपयोग करें । शेष लेबल जांच में-20 ° c बाद के उपयोग के लिए रखें । हालांकि, [32P] एटीपी का आधा समय ध्यान में रखें ।
  7. डीएनए ब्लाटर को संकरण ।
    1. हीट 2x एसएससी और संकरण बफर (संकरण ट्यूब प्रति 15 मिलीलीटर, ट्यूब प्रति 2 दाग की अधिकतम) 65 डिग्री सेल्सियस के लिए । (संकरण बफर: 10% dextran सल्फेट, 1% एसडीएस, 1 एम NaCl, 50 मिमी Tris पीएच 7.5, 65 डिग्री सेल्सियस पर भंग, पर aliquots रख-20 ° c).
    2. पूर्व 65 डिग्री सेल्सियस के लिए संकरण ओवन गर्मी ।
    3. एक ट्रे में नायलॉन जाल गरम (65 डिग्री सेल्सियस) 2x एसएससी ट्रे को कवर करने के लिए का एक छोटा सा के साथ प्लेस । जाली के ऊपर डीएनए दाग जगह, डीएनए पक्ष के साथ । दाग जाल के साथ एक साथ रोल और एक संकरण ट्यूब में रोल डालें । अतिरिक्त 2x एसएससी बंद डालो ।
    4. एक microcentrifuge ट्यूब में, सामन शुक्राणु डीएनए के 150 µ एल फोड़ा (एकाग्रता 10 मिलीग्राम/एमएल) प्रति संकरण ट्यूब 5 मिनट के लिए (यह भी कदम 4.6.3 देखें) । बर्फ पर तुरंत ठंडा और पूर्व गरम संकरण बफर को जोड़ें ।
    5. संकरण बफर-सामन शुक्राणु दाग के साथ ट्यूब के लिए समाधान जोड़ें । प्री-संकरण पर 65 ° c एक घूर्णन व्हील, 12 rpm में कम से 1 ज के लिए ।
    6. जब चरण 4.7.5 में पूर्व-मशीन । लगभग समाप्त हो गया है, 5 मिनट के लिए लेबल जांच के 300 µ एल फोड़ा (यह भी कदम 4.6.3 देखें) और मशीन के बाद दाग को तुरंत जोड़ें ।
    7. 63 डिग्री सेल्सियस, 12 rpm पर घूर्णन व्हील में रातोंरात संकरण । जांच सीधे दाग पर मत पिपेट, लेकिन संकरण बफर-सामन शुक्राणु समाधान में ।
  8. ब्लाटर को धो लें ।
    1. पहले से गरम करना वाशिंग समाधान (1x SSPE, 0.1% एसडीएस और 0.1 x SSPE, 0.1% एसडीएस) से 65 ° c । (20x SSPE: 3 M NaCl, 230 mm णः2PO4, 20 एमएम EDTA, पीएच 7.0) ।
    2. संकरण समाधान को निपटाने और जोड़ें के बारे में 100-150 मिलीलीटर की SSPE, 0.1% संकरण ट्यूब के लिए एसडीएस समाधान, ट्यूब बंद करें, और हाथ से घुमाएं । संकरण और उचित तरल रेडियोधर्मी कचरे में धोने समाधान डालो ।
    3. के बारे में 100-जोड़ें 1x SSPE के 150 मिलीलीटर, 0.1% ट्यूब के लिए समाधान एसडीएस, बंद, और 15 मिनट के लिए ट्यूब मशीन में 63 ° c घूर्णन व्हील, 12 rpm में । वॉशिंग सॉल्यूशन को उचित रूप से त्यागें ।
    4. के बारे में जोड़ें 100 – 150 मिलीलीटर की 0.1 x SSPE, 0.1% एसडीएस समाधान के लिए संकरण ट्यूब, बंद करें, और घुमाएं के लिए ट्यूब 5 मिनट में 63 ° c, 12 rpm. वॉशिंग सॉल्यूशन को उचित रूप से त्यागें ।
    5. दाग ट्यूब से बाहर ले लो और यह पर्याप्त गरम 0.1 x SSPE, 0.1% एसडीएस युक्त ट्रे में जगह है, और 65 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी स्नान में 3 मिनट के लिए हिला । इस बीच, एक पानी से भरी ट्रे में जाल कुल्ला ।
    6. दाग बाहर ले लो, यह पूर्व के बीच में जगह-जोड़ प्लास्टिक (पॉलीथीन टयूबिंग), ध्यान से अधिक तरल बंद पोंछ, और दाग सूखी संक्षेप । ध्यान दें कि लिक्विड phosphorimager स्क्रीन को बर्बाद कर देगा ।
    7. तीनों तरफ प्लास्टिक में दाग को सील कर । दाग आसपास के सभी अतिरिक्त तरल निकालें और चौथी तरफ सील करके प्लास्टिक ट्यूब बंद करो । प्लास्टिक के अधिशेष काट । सुनिश्चित करें कि सील दाग लीक नहीं है और है कि प्लास्टिक के बाहर पर शुष्क है ।
  9. phosphorimager स्क्रीन बेनकाब ।
    1. एक phosphorimager कैसेट में सीलबंद दाग प्लेस, phosphorimager स्क्रीन के साथ दाग के डीएनए पक्ष का सामना करना पड़ रहा है । कैसेट बंद करें और ± 2 के लिए छोड़ दो-4 दिन, रेडियोधर्मी लेबल और phosphorimager की संवेदनशीलता की ताकत पर निर्भर करता है ।
    2. एक phosphorimager का उपयोग कर phosphorimager स्क्रीन स्कैन करें । स्क्रीन को स्कैन करने से पहले प्रकाश करने के लिए संभव के रूप में छोटे बेनकाब करने के लिए ध्यान रखना । छवि सहेजें । यह चमकदार प्रकाश को उजागर करके संकेत से स्क्रीन मिटा ।
  10. ब्लाटर का विश्लेषण करें ।
    1. विश्लेषण चरण 4.1 में उपयोग की गई प्रतिबंध कार्यनीति पर निर्भर करता है. जब चरण 4.1.1.1 (चित्र 4a) में दिखाए गए कार्यनीति के अनुसार तैयार किए गए ब्लाट का विश्लेषण करते हैं, तो पाया गया अंशों की संख्या गिनना. इस रणनीति में, संकरित अंशों की संख्या टी-डीएनए एकीकरण की संख्या को संदर्भित करता है ।
      1. बाएं (आरेख 7B) और T-DNA का दायां (चित्र 7C) भाग के लिए जांच के साथ खोजे गए अंशों की संख्या की तुलना करें ।
        नोट: यदि hybridizing टुकड़ों की एक अलग संख्या का पता चला है, तो या तो मैं) एकाधिक टी डीएनए प्रतियां (या तो उल्टे या प्रत्यक्ष अभिविंयास में) या द्वितीय) पूरी तरह से एकीकृत टी DNAs मौजूद हैं ।
      2. मार्कर बैंड के आकार के आधार पर दाग पर संकरे टुकड़े के आकार का अनुमान है, और की तुलना में अपेक्षित टुकड़ा आकार के साथ की गणना के साथ संकरित टुकड़े के आकार के साथ संमिलन का प्रतिबंध रणनीति (चित्र 4a) के आधार पर) टी-DNAs की संभव मिलकर व्यवस्था की पहचान करें । अपेक्षित अंशों के आकार की गणना करने के लिए मार्गदर्शिका के रूप में आरेख 4a का उपयोग करें ।
        नोट: यदि संकरित अंशों का आकार परिकलित लोगों के साथ सहमत नहीं है, तो सबसे अधिक संभावना मौजूद एकीकरणों में से एक पूर्ण नहीं है.
    2. जब कदम 4.1.1.2 (चित्रा 4B) में दिखाया रणनीति के अनुसार तैयार दाग का विश्लेषण, मार्कर बैंड के आकार के आधार पर दाग पर hybridizing टुकड़ा के आकार का अनुमान है, और यह अपेक्षित आकार के साथ तुलना करें । एक बरकरार सम्मिलन एक निर्धारित लंबाई के साथ एक टुकड़ा पैदावार । अपेक्षित लंबाई का कोई विचलन अपूर्ण एकीकरण (चित्र 7d) को इंगित करता है ।
  11. फिर से संकरण के लिए दाग पट्टी (वैकल्पिक) ।
    नोट: एक ही दाग अलग जांच के साथ लगातार संकर जा सकता है । एक नई जांच के साथ जारी रखने से पहले, दाग से पिछले एक संकर जांच पट्टी ।
    1. ब्लाटर से जांच को हटाने के लिए दाग को एक ट्रे में अपने डीएनए के साथ-साथ नीचे की ओर रखें । ट्रे में 0.5% एसडीएस की एक अधिशेष डालो । 2-5 मिनट के लिए झिल्ली फोड़ा । उपचार की अवधि का इस्तेमाल किया जांच के आकार और जीसी-सामग्री पर निर्भर करता है । अब और GC-अमीर जांच एक लंबे समय तक इलाज की जरूरत है ।
    2. अलग करने के बाद, एक और जांच के साथ दाग संकरण, या सील और दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस ।

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Representative Results

BIBAC-गिनीकृमि प्रणाली का प्रयोग, रिपोर्टर पौधों में ODM अध्ययन के लिए निर्माण10उत्पंन किया गया । निर्माण गेटवे प्रवेश वेक्टर pENTR में डिजाइन किए गए थे-जीएम12 और pBIBAC में डाला बार-गिनीकृमि (चित्रा 1) गेटवे LR पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया का उपयोग कर ।

Arabidopsis pDM19 के साथ बदल रहे थे, एक BIBAC बार एक mTurquoise-eYFP codon पढ़ने के फ्रेम में स्थिति 120 (eYFP-mTurquoise2 * 40) (चित्रा 2)10पर रोक eYFP ले जाने के रिपोर्टर के साथ गिनीकृमि प्लाज्मिड । कुल में 126 Arabidopsis पौधे (9 पौधे प्रति बर्तन, 14 बर्तन) रूपांतरित किए गए । इन पौधों के बीज परित, मिट्टी के साथ ट्रे पर बोया गया था, और दो सप्ताह के लिए Glufosinate-अमोनियम समाधान के साथ इलाज से पहले बढ़ने की अनुमति दी । केवल बार जीन व्यक्त अंकुर (BIBAC-बार-गिनीकृमि में मौजूद) Glufosinate-अमोनियम उपचार (चित्रा 3) जीवित रहते हैं । कुल में, 11 pDM19 के साथ तब्दील transgenics की पहचान की, बीज का 0.02% की एक परिवर्तन दक्षता के लिए इसी से विश्लेषण किया गया ।

के लिए 11 transgenics पृथक, डीएनए सोख्ता टी की संख्या डीएनए एकीकरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । उस प्रयोजन के लिए, जीनोमिक डीएनए या तो बीजीएलद्वितीय या Scaमैं ( चित्र 4aपर तैयार के रूप में रणनीति) के साथ काट दिया गया था । इन प्रतिबंध एंजाइमों के दोनों टी में केवल एक बार-डीएनए अनुक्रम में कटौती (चित्रा 7A) । जांच के साथ संकरण बार और eYFP कोडिंग क्षेत्रों संबंधित डीएनए अंशों की संख्या का पता लगाने की अनुमति दी पहचानने ।

रिपोर्टर लाइंस (तालिका 1) में T-dna संमिलन की संख्या का अनुमान लगाने के लिए अनुमति प्राप्त ब्लाटर पर व्यक्तिगत डीएनए अंशों की संख्या । दोनों बार और eYFP जांच के साथ एकल hybridizing टुकड़े एक भी टी डीएनए एकीकरण की उपस्थिति का संकेत दिया । 11 transgenics विश्लेषण से, छह एकल एकीकरण किया । एकीकरणों की औसत संख्या 1.2 थी ।

के लिए 6 एक टी ले जाने लाइनों-डीएनए एकीकरण, डाला रिपोर्टर का निर्माण की अखंडता डीएनए सोख्ता का उपयोग कर परीक्षण किया गया था के रूप में ( चित्रा 4Bपर तैयार की रणनीति) । जीनोमिक डीएनए के साथ बीजीएलद्वितीय और पीसीआईमैं दोनों बार और mTurquoise-eYFP फ्यूजन जीन (चित्रा 7A) युक्त 5.5 केबी टुकड़ा जारी करने के लिए काट दिया गया था । eYFP के विरुद्ध एक जांच अपेक्षित अंश का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था । सभी पौधों का परीक्षण एक बरकरार टुकड़ा किया । ध्यान दें कि टुकड़ा की जांच छोड़ दिया और सही टी डीएनए सीमा शामिल नहीं है, और इसलिए पूरे टी डीएनए की अखंडता की जांच नहीं करता है, लेकिन केवल ब्याज की transgenes युक्त हिस्सा है ।

फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति स्वतंत्र एकल-प्रतिलिपि ट्रांसजेनिक केवल टी डीएनए के जीनोमिक स्थान से भिंन लाइनों में निर्धारित किया गया था । रिश्तेदार CaMV के प्रतिलिपि स्तर-35S प्रमोटर चालित mTurquoise-eYFP रिपोर्टर आर टी-qPCR द्वारा चार DM19 रिपोर्टर लाइनों में बरकरार, एकल प्रतिलिपि एकीकरण, जिनमें से जीनोमिक स्थिति निर्धारित किया गया था ले जा रहे थे मापा गया10। रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति स्तर में पंक्तियों के बीच भिन्नता नाबालिग थी: mTurquoise-eYFP आरएनए स्तर में अधिकतम अंतर 2-गुना (चित्रा 8A) था.

अगले, ODM इन रिपोर्टर लाइनों में किया गया था । चार स्वतंत्र रिपोर्टर लाइनों के बाहर तीन बल्कि इसी तरह ODM क्षमता दिखाया (चित्रा 8B). हालांकि, एक पंक्ति, DM19 [4] 1, अन्य पंक्तियों की तुलना में एक बहुत कम ODM दक्षता झुकेंगे । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ODM स्थानीय जीनोमिक संदर्भ से प्रभावित है । DM19 [4] 1 में T-DNA एकीकरण के स्थानीय जीनोमिक प्रसंग को किस तरीके से अलग किया गया है, जो अंय पंक्तियों में पहचाना जाना रहता है । गैर-ट्रांसजेनिक संयंत्रों में जीनोमिक टी-डीएनए एकीकरण साइटों पर सक्रिय और निष्क्रिय क्रोमेटिन चिह्नों पर उपलब्ध डेटासेट का विश्लेषण एक उत्तर10प्रदान नहीं किया ।

Figure 1
चित्रा 1: pBIBAC के कार्यात्मक नक्शे-गिनीकृमि वैक्टर । pBIBAC-गिनीकृमि डेरिवेटिव Glufosinate के लिए या तो प्रतिरोध के साथ उपलब्ध है (बार) या बीज कोट में DsRed प्रतिदीप्ति (DsRed) पौधों में एक चयन मार्कर के रूप में । दोनों वैक्टर के लिए, एक कनमीसिन प्रतिरोध जीन बैक्टीरिया में चयन मार्कर है । गेटवे ccdB कैसेट हरे ऐरोहेड के बीच दिखाया गया है attR1 और attR2 पुनर्संयोजन साइटों का प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Mutagenesis रिपोर्टर का निर्माण. mTurquoise-eYFP रिपोर्टर जीन 35S-CaMV की मोटर से संचालित होते हैं । mTurquoise कोडिंग क्षेत्र एक eYFP एक सी ले जाने क्षेत्र कोडिंग न्यूक्लियोटाइड स्थिति 120 में एक उत्परिवर्तन, एक समयपूर्व अनुवाद बंद codon ताा में जिसके परिणामस्वरूप, और फ्यूजन प्रोटीन के अनुवाद के समयपूर्व समाप्ति के लिए जुड़े हुए है । 3 ' Nopaline सिंथेस (3 ' नग) polyadenylation सिग्नल का निर्माण22की प्रतिलिपि को समाप्त करने के लिए किया जाता है । नाभिकीय स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) को नाभिक के अनुवादित प्रोटीन को लक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Glufosinate-अमोनियम उपचार से पहले और बाद Arabidopsis अंकुरों से भरा ट्रे । अंकुर व्यक्त न बार जीन कि pBIBAC-बार-गिनीकृमि टी में मौजूद है डीएनए Glufosinate-अमोनियम सॉल्यूशन के साथ छिड़काव होने के बाद मर जाते हैं. तस्वीरें Glufosinate-अमोनियम के साथ छिड़काव करने से पहले अंकुर की एक ही ट्रे (A), बोने के 14 दिनों के बाद, और (B) 10 दिन बाद, दो बार छिड़काव किया जा रहा दिखाने के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: संख्या और डाला टी-DNAs की अक्षुण्णता की पहचान करने के लिए सामान्य डीएनए प्रतिबंध रणनीति. (एक) टी डीएनए के बीच में एक प्रतिबंध साइट (आर) स्वतंत्र छोड़ (लाल एल) और टी के दाहिने भाग डीएनए (ग्रीन आर) की जांच की अनुमति देता है । सही शो पर कार्टून कि एकल या बहु कॉपी टी डीएनए एकीकरण पर निर्भर करता है, अलग बैंडिंग पैटर्न डीएनए सोख्ता के साथ प्राप्त कर रहे हैं । एक * के साथ चिह्नित बैंड एक परिभाषित लंबाई है, जबकि अंय बैंड की लंबाई पार्श्व जीनोमिक डीएनए में निकटतम प्रतिबंध साइट पर निर्भर करता है । एकल संमिलित करें: एल और आर जांच दोनों एक स्वतंत्र टुकड़ा दे । अपेक्षित औसत अंश आकार के आधार पर जीनोम में प्रतिबंध साइट की आवृत्ति गणना की जा सकती है । न्यूनतम आकार प्रतिबंध साइट से बाईं बॉर्डर (LB) या दाएँ बॉर्डर (आरबी) के लिए दूरी है, जिसके आधार पर एकीकरण की समाप्ति की जांच की जा रही है, और यदि T-डीएनए बरकरार है । मिलकर दोहराने: L और R के लिए जांच दोनों दो टुकड़े दे; प्रत्येक जांच के लिए टुकड़े में से एक जीनोमिक डीएनए, दूसरा टुकड़ा एक अपेक्षित आकार है और दोनों की जांच द्वारा पहचान की है पार्श्व शामिल है । उल्टे दोहराएँ: एकीकृत कैसेट के दिशात्मकता पर निर्भर करता है, या तो एक एल और दो आर टुकड़े, या दो एल और एक आर पहचाना जा सकता है । व्यक्तिगत एकल सम्मिलन: परिणाम स्वतंत्र अंशों की संख्या है, और अंशों की संख्या एकीकरणों की संख्या से मेल खाती है. (ख) T-डीएनए के चरम पर प्रतिबंध साइटों प्रतिबंध साइटों के बीच टुकड़ा की अखंडता निर्धारित करने की अनुमति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिबंध पैटर्न और मिलान पारदर्शिता के साथ एक agarose जेल. (क) agarose जेल पर, जीनोमिक डीएनए पचता है EcoRके साथ मैं दिखाया गया है । डीएनए के समुचित पाचन असतत उपग्रह बैंड की उपस्थिति से सचित्र है । (ख) एक पारदर्शिता पर स्लॉट और मार्कर बैंड की स्थिति अंकन यह बाद में आसानी से hybridizing टुकड़े के आकार की गणना करने के लिए संभव बनाता है । यहां, MRC हॉलैंड मार्करों (नीले और लाल) का उपयोग किया जाता है, एम द्वारा संकेत दिया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: केशिका सोख्ता के लिए सेटअप । एक केशिका सोख्ता सेटअप में, कागज कागज 20x एसएससी बफर में फांसी के सिरों के साथ एक प्लास्टिक की थाली पर रखा गया है । कागज 20x एसएससी के साथ गीला है, और एक agarose जेल शीर्ष पर रखा, एक नायलॉन झिल्ली, फिल्टर कागज के बाद, और ऊतकों के ढेर । एक हल्के वजन शीर्ष पर रखा गया है । देखभाल जेल, कागज और झिल्ली के बीच हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए लिया जाता है । चिपके फिल्म सेटअप से बाहर सुखाने से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: डीएनए सोख्ता रणनीति और प्रयोगात्मक परिणाम का उदाहरण । (क) डीएनए सोख्ता की संख्या और टी डीएनए एकीकरण की अक्षुण्णता निर्धारित करने की रणनीति. टी डीएनए के भीतर चयनित प्रतिबंध एंजाइमों के काटने स्थानों ऊर्ध्वाधर सलाखों के साथ संकेत दिया है । पचता जीनोमिक डीएनए के साथ संकरण के लिए इस्तेमाल किया eYFP और बार जांच टी डीएनए के नीचे टर्मिनल डॉट के साथ एक पंक्ति का उपयोग कर संकेत दिया जाता है । (ख-घ) उदाहरण डीएनए दाग । जीनोमिक डीएनए को Scaके साथ काट दिया गया था I और ब्लाटर दोनों को एक बार और eYFP जांच (बी और सी) से जांचा गया । जीनोमिक डीएनए बीजीएलद्वितीय और पीसीआईमैं और एक बार जांच के साथ जांच के साथ काट दिया गया था । बरकरार अंशों में 5.5 kbp आकार (D) होते हैं । नोट करें कि D में नमूनों का सेट B और C. * में दिखाए गए से भिन्न है अपेक्षित अंश आकार इंगित करता है; मी, मार्कर. B, C, और D में समान आकार मार्कर का उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: mTurquoise-eYFP अभिव्यक्ति स्तर और ODM क्षमता में स्वतंत्र mTurquoise-eYFP रिपोर्टर लाइनों. (क) रिश्तेदार mTurquoise-eYFP प्रतिलिपि DM19 रिपोर्टर लाइनों में आरटी-qPCR द्वारा मापा स्तर । Actin के सामांय प्रतिलिपि के स्तर के लिए इस्तेमाल किया गया । (ख) ODM दक्षता DM19 रिपोर्टर लाइनों में मापा जाता है । A और B के लिए, सलाखों के औसत से संकेत मिलता है कम से कम पांच जैविक प्रतिकृति । त्रुटि पट्टियों का संकेत SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

T-DNA लोकस का प्रकार T-डीएनए एकीकरण के Nr रिपोर्टर लाइन पहचाने गए अंशों की संख्या अखंडता
Sca मैं बीजीएल द्वितीय बीजीएल द्वितीय PciI/
बार eYFP बार eYFP eYFP
एकल लोकस एकीकरण 1 19 [2]-2 1 1 1 1 +
1 19 [2]-5 1 1 1 1 +
1 19 [2]-9 1 1 1 1 +
1 19 [2]-11 1 1 1 1 +
1 19 [4]-1 1 1 1 1 +
1 19 [4]-2 1 1 1 1 +
2, उल्टे दोहराएँ 19 [2]-10 2 1 1 1 +
2, अपूर्ण एकीकरण 19 [2]-3 1 2 1 1 एनडी
एकाधिक लोकस एकीकरण 2 19 [2]-6 2 2 2 एनडी
2 19 [2]-7 2 2 2 2 एनडी
3/4 19 [2]-1 4 3 3 3 एनडी
एनडी-निर्धारित नहीं है ।

तालिका 1: pDM19 के साथ परिवर्तन के बाद अलग transgenics के लिए डीएनए सोख्ता डेटा का सारांश ।

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Discussion

एक transgene के एकल, बरकरार एकीकरण के साथ transgenics पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण द्विआधारी वेक्टर का चयन किया जाता है । BIBAC परिवार वैक्टर कई संयंत्र प्रजातियों23,24,25,26,27,28के लिए हितों का जुगाड़ देने के लिए इस्तेमाल किया गया है । BIBAC वैक्टर, BIBAC-गिनीकृमि सहित, एक उच्च दक्षता के साथ प्रतिलिपि एकीकरण उपज: प्रति पंक्ति संमिलन की औसत संख्या 1.5 से 2 है, की तुलना में 3 या उच्चतर के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया द्विआधारी वैक्टर5,9, 29. अंय BIBAC वैक्टर की तुलना में एक प्रमुख सुधार के रूप में, BIBAC-गिनीकृमि वैक्टर के साथ, ब्याज की अनुक्रम आसानी से गेटवे पुनर्संयोजन साइटों12का उपयोग कर डाला जा सकता है । संशोधित वैक्टर BIBAC वैक्टर की सामांय समस्याओं को दूर जब पारंपरिक क्लोनिंग रणनीतियों में इस्तेमाल किया: मैं) अद्वितीय प्रतिबंध साइटों और द्वितीय की एक बहुत ही सीमित संख्या) एक कम डीएनए उपज । गेटवे पुनर्संयोजन साइटों बनाने BIBAC-गिनीकृमि ट्रांसजेनिक संयंत्रों के उत्पादन के लिए अंय द्विआधारी वैक्टर के लिए एक आकर्षक विकल्प वैक्टर ।

यहां प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला, BIBAC-गिनीकृमि ब्याज की जुगाड़ युक्त डेरिवेटिव, संयंत्र परिवर्तन के लिए, और संख्या और ट्रांसजेनिक दृश्यों की अक्षुण्णता के लिए डीएनए दाग विश्लेषण से वर्णित है । इस पत्र में रिपोर्ट प्रोटोकॉल के कई, गेटवे क्लोनिंग, बैक्टीरिया की electroporation, और संयंत्र परिवर्तन, कई प्रयोगशालाओं में आम अभ्यास कर रहे हैं और भी मामूली संशोधनों के साथ बाहर किया जा सकता है. यह जानना महत्वपूर्ण है कि BIBAC-गिनीकृमि एक एकल ई. कोलाई में सदिश की नकल है और एक. tumefaciensमें । इसलिए, डीएनए को अलग करते समय, उपज कम होती है; यह आइसोलेशन प्रक्रिया स्केल करने के लिए अनुशंसित है ।

transgenics में कई टी-डीएनए एकीकरण ले जाने, transgenes शुरू अक्सर जीन मुंह बंद करने के अधीन हैं, 2, 4, 30, और इसलिए सबसे अनुप्रयोगों से बचा जाना चाहिए । एकल, अक्षुण्ण एकीकरण के साथ ट्रांसजेनिक संयंत्रों की पहचान करने के लिए, यह डीएनए ब्लाट विश्लेषण का उपयोग करने की सिफारिश की है. जबकि डीएनए सोख्ता के अलावा अंय तरीकों टी के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता डीएनए प्रतिलिपि संख्या और ट्रांसजेनिक लाइनों में टी DNAs की अखंडता (पृथक्करण विश्लेषण, पूंछ पीसीआर, मात्रात्मक पीसीआर (qPCR), और डिजिटल छोटी बूंद पीसीआर), हालांकि श्रम गहन, डीएनए सोख्ता अक्सर है पसंद की विधि । पृथक्करण विश्लेषण के लिए एक loci में कई और एकल टी डीएनए एकीकरण के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं है । पूंछ-पीसीआर अक्सर के अंतर्गत-प्रतिलिपि संख्या का अनुमान है, खासकर अगर एक से अधिक टी डीएनए एकीकरण31मौजूद है, और qPCR विश्वसनीय परिणाम के लिए विस्तृत अनुकूलन31,32की जरूरत है । डिजिटल छोटी बूंद पीसीआर की जरूरत है अगर उपकरण उपलब्ध है31कॉपी नंबर का पता लगाने के लिए एक जगह सटीक तरीका है । डीएनए सोख्ता का जोड़ा लाभ कटा हुआ टी-DNAs का सतही डिटेक्शन है, जो सभी पीसीआर आधारित तकनीक में आसानी से चूक जाता है ।

डीएनए ब्लाट विश्लेषण के साथ, दाग पर hybridizing टुकड़े को संकेत और आकार में अच्छी तरह से पहचाने जाने की जरूरत है । कई कारकों को डीएनए सोख्ता के परिणाम को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । प्रतिबंध एंजाइमों की एक उपयुक्त चयन के अलावा ( चित्रा 4में संकेत रणनीति) और आकार मार्करों, अच्छी गुणवत्ता के पर्याप्त डीएनए की आवश्यकता है । जीनोमिक Arabidopsis डीएनए के 2 से कम µ जी अच्छी तरह से पहचाने नहीं टुकड़े उपज नहीं होगा । जब बड़ा जीनोम से निपटने, और अधिक डीएनए की आवश्यकता है । Arabidopsis डीएनए, फूलों के ऊतकों या 1 सप्ताह पुराने अंकुरों की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक पेट्री पकवान पैदावार 2-8 डीएनए के µ जी पर हो अंकुर का एक बैच । आदेश में अलगाव के दौरान डीएनए क्षरण से बचने के लिए, देखभाल के लिए संयंत्र सामग्री तेजी से प्रक्रिया की जानी चाहिए । इसके अलावा, जीनोमिक डीएनए Tris-EDTA में reसस्पैंड किया जाना चाहिए nucleases द्वारा अपनी गिरावट को कम करने के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत के बजाय-20 डिग्री सेल्सियस डीएनए दोहराया ठंड-गल चक्र के कारण निक रोकने के लिए । यदि अनिश्चित है कि सभी डीएनए नमूने पूरी तरह से पचा रहे हैं, यह एक अंतर्जात, अद्वितीय जीनोमिक क्षेत्र पहचानने जांच के साथ डीएनए दाग rehybridize के लिए सुझाव दिया है । ट्रांसजेनिक या अंतर्जात दृश्यों की पहचान करने के लिए जांच दृश्यों का चयन करते समय, यह केवल अद्वितीय दृश्यों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । संक्षेप में संकरित टुकड़े के आकार का निर्धारण करने में सक्षम होने के लिए, डीएनए जेल स्लॉट और डीएनए मार्कर बैंड की स्थिति एक पारदर्शिता पर चिह्नित किया जाना चाहिए (चित्रा 5B) जब एक यूवी पर एक Ethidium ब्रोमाइड-दाग जेल (चित्रा 5) visualizing transilluminator । मामले में मार्कर अनुक्रम जांच डीएनए के साथ संकरण नहीं है, या संकरण आंशिक है, यह एक ही रास्ता नीचे hybridizing टुकड़े के आकार को ट्रैक है ।

एक बार देखभाल अच्छा संकरण संकेत और टुकड़ा आकार के अनुमान को प्राप्त करने के लिए लिया जाता है, सोख्ता परिणामों की व्याख्या सीधी है । जब केवल एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग कर, और अलग जांच के साथ hybridizing या तो छोड़ दिया है या सही भाग t-डीएनए का पता लगाने, पता चला अंशों की संख्या टी डीएनए निवेशन की संख्या को दर्शाता है । उदाहरण के लिए, चित्रा 7B, सी एक ही डीएनए दाग से पता चलता है, अलग जांच, बार (चित्रा 7B) और बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eYFP) (चित्रा 7C) के साथ संकर, चित्रा 7Aमें दिखाया रणनीति का उपयोग कर । सभी गलियों, 4 को छोड़कर, दोनों दाग पर टुकड़े की एक समान संख्या दिखाने: 6 लाइन के लिए दो टुकड़े और अंय सभी लाइनों के लिए एक टुकड़ा । पता लगाए गए अंशों की यह संख्या टी-डीएनए सम्मिलनों की संख्या है.

जब टुकड़ों की संख्या या तो छोड़ दिया है या टी डीएनए के सही हिस्सा बाध्यकारी जांच के साथ पता चला (के रूप में चित्रा 7B, सी, रेखा 4), या तो अपूर्ण सम्मिलन मौजूद हैं, या टी DNAs मिलकर व्यवस्था में डाला है । मिलकर निवेशन T-डीएनए अंशों में से एक के लिए गैर यादृच्छिक टुकड़ा लंबाई प्रदर्शन (चित्रा 4a, सही पैनल), और क्या प्रतिबंध रणनीति के आधार पर उंमीद है के साथ संकर टुकड़ा आकार की तुलना द्वारा पहचाना जा सकता है । एक अतिरिक्त सोख्ता रणनीति टी डीएनए निवेशन के मिलकर व्यवस्था की पुष्टि करने की जरूरत हो सकती है । 4 लाइन (चित्रा 7B, सी) पर दिखाए गए नमूने में, दो सम्मिलन एक औंधा दोहराने अभिविन्यास में व्यवस्थित कर रहे हैं.

जब एक टी डीएनए, या उसके हिस्से की अक्षुण्णता का आकलन, hybridizing टुकड़ा की लंबाई प्रतिबंध रणनीति के आधार पर गणना की जा सकती है । अपेक्षित आकार से कोई विचलन किसी अपूर्ण प्रविष्टि की उपस्थिति को इंगित करता है । उदाहरण के लिए, चित्र 7dमें, लेन 4 में, एक hybridizing अंश 8 kbp पर माइग्रेट करता है, (अपेक्षित 5.5 kbp के बजाय) प्रतिबंध साइटों में से एक की कमी के कारण एक बढ़ी हुई अंश आकार का संकेत देता है ।

BIBAC-गिनीकृमि वैक्टर संयंत्र प्रजातियों की एक संख्या में एकल प्रतिलिपि बरकरार एकीकरण पैदा करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण हैं । यहां रिपोर्ट प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय प्रक्रिया प्रदान करता है के साथ पौधों की पहचान, ब्याज की एक transgene के बरकरार एकीकरण ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष की घोषणा ।

Acknowledgments

इस शोध को डच प्रौद्योगिकी फाउंडेशन STW (१२३८५) द्वारा समर्थित है, जो नीदरलैंड के वैज्ञानिक अनुसंधान (NWO) के लिए संगठन का हिस्सा है, और जो आंशिक रूप से आर्थिक मामलों के मंत्रालय (ओटीपी अनुदान १२३८५ से एमएस) द्वारा वित्त पोषित है ।  हम कैरोल एम हैमिल्टन (कॉर्नेल विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका) pCH20, BIBAC-गिनीकृमि वैक्टर की रीढ़ प्रदान करने के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

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References

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Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

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