Summary
ويرد في هذا العمل، وضع بروتوكول لتعزيز الإشارات بيوسينسينج على أساس نانوبروبي. ويستند البروتوكول الحد حمض تشلورووريك على السطح من القائمة نانوبروبيس التي تتكون من الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد جسيمات نانوية.
Abstract
لتمكين استخدام نانوبروبيس مثل الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد جسيمات نانوية كالكشف عن المواد الكاشفة في فحوصات بيواناليتيكال حساسية عالية وقراءات قياس الألوان مريحة. بيد أنه يلزم عادة كثافة عالية من جسيمات نانوية للكشف. البروتوكولات المتاحة تحسين المستندة إلى توليف أما جسيمات نانوية المحدودة للذهب والفضة أو تعتمد على دقة السيطرة الانزيمية والتحسين. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز قراءات قياس الألوان من الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد نانوبروبيس. ولوحظ أن الإشارة اللونية يمكن أن تتحسن بما يصل إلى عامل 10000-fold. هو الأساس لمثل هذه الاستراتيجيات تعزيز إشارة الاختزال الكيميائي Au3 + للاتحاد الأفريقي0. وهناك العديد من التفاعلات الكيميائية التي تمكن من الحد من الاتحاد الأفريقي3 + للاتحاد الأفريقي0. في البروتوكول، ويتم استخدام المخازن المؤقتة لحسن وح2س2 ومن الممكن أن ترسب الاتحاد الأفريقي0 على السطح نانوبروبيس القائمة، على حساب تكوين جسيمات نانوية ذهبية جديدة لصالح. البروتوكول يتكون من الحضانة ميكرواري مع حل تتألف من حمض تشلورووريك وح2س2 في 2-(ن-morpholino) اثانيسولفونيك حامضي 6 المخزن المؤقت بعد الفحص الكشف على أساس نانوبروبي. يمكن تطبيق الحل تعزيز للورق وأجهزة الاستشعار المستندة إلى الزجاج. وعلاوة على ذلك، استخدامها في تحديدكم المتاحة تجارياً كما يتضح من تطبيق الأسلوب على ميكرواري حساسية تجارية. ويتطلب وضع إشارة أقل من 5 دقائق للحضانة مع تعزيز الحل ويمكن تقييمها قراءات بالعين المجردة أو بأجهزة اقتناء الصور المنخفضة مثل كاميرا رقمية أو ماسح ضوئي أعلى الجدول.
Introduction
وقد يسمح باستخدام المواد النانوية مثل الذهب جسيمات نانوية (أونبس) أو جسيمات نانوية أكسيد الحديد (إيونبس) التطبيقات في بيوسينسينج مع تحسين حساسية وبراعة. 1 تمكين عدد كبير الأساليب المتقدمة للزخرفة السطحية للجسيمات النانوية مع يغاندس المختلفة، فيما يتعلق بالاستفادة من سطحها عالية لنسبة الحجم، تصميم أجهزة الاستشعار مع تحسين حساسية. 2 مع ذلك، أداة بيوسينسينج فيعتمد على عدد نانوبروبيس اللازمة لتحقيق إشارة قابلة للاكتشاف. على سبيل المثال، في حالة 40 نانومتر أونبس، للحصول على إشارة من خلال التحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية، قرابة 90 × 106 نانوبروبيس مطلوب من أجل فعالية الكشف عن هدف الفائدة. 3 يمكن التحايل عليها هذا القيد الكثافة نانوبروبي عن طريق استخدام تضخيم الإشارات. يمكن أن تستند هذه الاستراتيجيات4 إلى تجميع إينتيربارتيكلي أو تجمع سكاني، حيث تزداد كثافة نانوبروبيس الأولية بتجميع مجموعة ثانية من نانوبروبيس عند الأول. 5 زيادة عدد جسيمات نانوية في موقع معين على سطح جهاز استشعار يسمح البصرية أو اقتناء إشارة تجاه الأشعة فوق البنفسجية. سيتم ربط حساسية المقايسة بيد أصلاً لاستهداف قدرة المجموعة الثانية من جسيمات نانوية نحو مجموعة أولية من نانوبروبيس. استراتيجيات أخرى تعتمد على تلطيخ نانوبروبيس أما الذهب والفضة. 6 , 7 وتلطيخ يتحقق عن طريق الحد أيونات الفضة على السطح من جسيمات نانوية، تمكين أحد البصرية أو كشف الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة. 8 هذه الأساليب تعزيز إشارة القائمة الذهب أو الفضة نانوبروبيس من بوتينتياتينج السطح الرنين مأكل مثل الطحين إشارة، لا اعتماداً على الأحداث تستهدف الثانوية كما هو الحال في أساليب التكتل إينتيربارتيكلي. ومع ذلك، أبلغ أساليب المصبوغة الفضة فقط مع استخدام نانوبروبيس الذهبية أو الفضية. 8 , 9
وفي عام 2005، زاياتس وآخرون. وأفادت 10 الحد أيونات الاتحاد الأفريقي على السطح نانوبروبيس الذهبية لزيادة إشارة الرنين السطحية مأكل مثل الطحين. من أجله بيروكسيد الهيدروجين في هذا العمل، وتعتمد على إنزيم الجلوكوز أوكسيديز الحفز وجنبا إلى جنب مع كلوريد سيتيلتريميثيلامونيوم يسمح بالحد حمض تشلورووريك.
في الآونة الأخيرة وانغ وآخرون. ذكرت طريقة تعزيز حيث يتم إنتاج الذهب طبقة على سطح نانوبروبيس القائمة. 11 هذه نانوبروبيس الموسع عرض نشاط الحفاز مثل البيروكسيديز ضد الركازة 3، 5، 5 '--تيتراميثيلبينزيديني (TMB) تمكين التصور من اللون الأزرق الساطع بالعين المجردة.
ستيفنز et al. وأفادت تنمية مقايسة على أساس أليسا plasmonic. 12 بعد الكشف عن مستضد البروستات محددة (PSA) من خلال استراتيجية أليسا تقليدية، جسم ثانوي المسمى بحدث كان المحتضنة مع استشعار بعدها الاستشعار كانت مغمورة في محلول يحتوي على بيروكسيد الهيدروجين و حمض تشلورووريك. وجود جسم تعديل كاتالاز الثانوي (نتيجة إيجابية) سيعزز استهلاك بيروكسيد الهيدروجين، تباطؤ بانخفاض حمض تشلورووريك والعائد شبه كروية مونوديسبيرسيد أونبس بلون أحمر. نظراً لغياب جسم تعديل كاتالاز (نتيجة سلبية) يسمح بتركيز فوق أكسيد الهيدروجين لتبقى سليمة، وبالتالي تشجيع الحد تشلورووريك السريع والعائد أونبس مع مورفولوجيس غير محددة مسؤولة عن لون أزرق/أرجواني . وأبدى تركيز فوق أكسيد الهيدروجين، يحددها نشاط الكاتلاز، إلى الارتباط بتركيز أكثر الفائدة. هي الحاجة إلى جسم ثانوي تعديل الكاتالاز ومراقبة ظروف النشاط الحفاز اثنين من العوامل التي تعوق الطابع العالمي لهذا الأسلوب. وعلاوة على ذلك، تشكيل مجموعات الذهب، مستقلة عن أونبس القائمة، قد يعرض القضايا الضوضاء الخلفية باستراتيجية التضخيم.
التقنيات المذكورة أعلاه، كما أيضا عدة أشخاص آخرين13،14،15، جعلت من الممكن لأجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس نانوبروبي لتحقيق الحدود للكشف على قدم المساواة مع التقنيات التقليدية.
هنا، هو أظهر أسلوب رواية تعزيز الذهب، حيث يتم تضخيمه الإشارة من نانوبروبي الموجودة قد أو إدخال إشارة رنين سطحية مأكل مثل الطحين. بعد أن يجري الكشف عن باستخدام الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد جسيمات نانوية، أجهزة الاستشعار مسموح لاحتضان مع حلاً خليط من بيروكسيد الهيدروجين، وحمض تشلورواوريك في 2-(ن-Morpholino) حمض اثانيسولفونيك (MES) الرقم الهيدروجيني 6 المخزن المؤقت. كانت الأمثل تركيزات المكونات الموجودة في الحل تعزيز لصالح ترسب الاتحاد الأفريقي0 على سطح نانوبروبيس القائمة. لكل درس أنواع نانوبروبي، أي. أونبس، أسفرت عن الفضة جسيمات نانوية (أجنبس)، والسليكا جسيمات نانوية (سينبس) وإيونبس، تشكيل طبقة غير محددة أو المعقم بعثرة الضوء مما أدى إلى إشارة مرئية يمكن كشفها أو زيادة. وتحققت زيادة إشارة مع معامل تضخيم 100-fold نانوبروبيس في ورقة والقائم على الزجاج [ميكروارس] وتستغرق العملية أقل من 5 دقائق للحصول على إشارة. ويمكن أن يتم الحصول على إشارة بالعين المجردة، مطيافية الأشعة فوق البنفسجية مقابل أو التصوير الأدوات المنخفضة مثل كاميرا رقمية أو ماسح ضوئي أعلى الجدول. وعلاوة على ذلك، وثبت أن هذا البروتوكول تعزيز يمكن تطبيقها سهولة في مقايسة تشخيصية الحساسية متوفرة تجارياً دون الحاجة إلى التحسين المحددة.
Protocol
وتم الحصول على عينات مصل الدم البشري وفقا للمتطلبات القانونية والأخلاقية للبلد لجمع، أي. بموافقة لجنة الأخلاقيات (أو ما شابه)، ومع موافقة خطية من الجهة المانحة.
1-تعزيز إعداد الحل:
- إعداد المخزن مؤقت الأس الهيدروجيني 6 مس 10 ملم بتعليق مس ملح الصوديوم في المياه. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6 استخدام حل هيدروكسيد الصوديوم 4 أمتار.
- إعداد 5 مم حوكل4 الحل في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 6 مس 10 ملم (الحل 1).
- إعداد 1.027 م ح2س2 حلاً في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 6 مس 10 ملم (حل 2).
ملاحظة: وحدات التخزين من الحل 1 و 2 الحل يعتمد على عدد وحجم [ميكروارس] أن يتعزز. على سبيل المثال، يتطلب ميكرواري 10 × 10 مم 100 ميكروليتر الحجم الإجمالي (الحل 1 + الحل 2) لضمان أن منطقة ميكرواري على اتصال بتعزيز الحل. بعد تمييع، ينبغي استخدام2س ح2 خلال حوالي 30-45 يوما.
2-جسيمات نانوية إعداد:
- إعداد 40 نانومتر أونبس كما هو موضح ب Bastús وآخرون. بإيجاز، ضخ 16 1 مل سلائف4 حوكل مائي 25 مم في حل مغلي من سترات الصوديوم 2.2 ملم (149 مل). انتظر حتى يتم ملاحظة لون النبيذ الأحمر. استخدام هذا الحل لجسيمات نانوية كبذور لخطوات نمو البذور.
- عند 90 درجة مئوية، حقن 1 مل سترات الصوديوم 60 ملم تليها 1 مل 25 مم حوكل4 إلى البذور التي تحتوي على الحل. وبعد 30 دقيقة، رد فعل كاملة. كرر الخطوة البذور-نمو خمس مرات حتى يتم الحصول على 40 نانومتر جسيمات نانوية، كما وصفها Bastús et al. 16
- قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية-تجاه الحل النهائي لجسيمات نانوية لتحديد حجم الجسيمات النانوية. 17 بدلاً من ذلك، نقل الإلكترون ميكروجرافس (TEM) يمكن المكتسبة والمستخدمة لتحديد حجم الجسيمات النانوية.
- إعداد 90 نانومتر أجنبس كما وصفها ريفيرو وآخرون. بإيجاز، إضافة 18 ديميثيلامينوبوراني (دماب) إلى حل قوة المقلبة لبولي (حمض اﻷكريليك، وملح الصوديوم) (PAA) وانيو3. حجم الحل النهائي هو 50 مل وتركيز دماب، الكمية النهائية وهي إنيو3 1.6 ملم، 10 و 3.33 ملم، على التوالي.
ملاحظة: إيونبس شمال البحر الأبيض المتوسط 100 تعديل مع مجموعات الكربوكسيل و 50 نانومتر سينبس تعديل مع مجموعات الكربوكسيل تم شراؤها. - فونكتيوناليزي أونبس مع الأجسام المضادة بعد البروتوكول وصف بويرتاس et al. بإيجاز، إضافة 19 1 مغ من COOH-شماعة-ش (5000 g·mol1) لإيجاد حل ل 1.2x10-9 "أونبس م" (الكثافة البصرية 10، التطوير التنظيمي). قم بضبط درجة الحموضة إلى 12 بمحلول من هيدروكسيد الصوديوم م 4.
- واسمحوا الحل احتضان بين عشية وضحاها، في درجة حرارة الغرفة (~ 22 درجة مئوية)، تحت ظروف إثارة خفيفة.
- إزالة فائض الوتد قبل سينتريفوجينج الحل في 13800 ز س لمدة 15 دقيقة.
- ريسوسبيند بيليه مع 500 ميكروليتر من المياه.
- احتضان أونبس تعديل الوتد مع μmol 5 من N-(3-Dimethylaminopropyl)-N '-هيدروكلوريد اثيلكاربودييميدي (EDC) و μmol 7.5 من ملح الصوديوم N-هيدروكسيسولفوسوكسينيميدي (سالفو--دائرة الصحة الوطنية) في 10 ملم مس pH 6 المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إزالة الزيادة في الصادرات وسالفو--دائرة الصحة الوطنية التي سينتريفوجينج الحل في 13800 x ز لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه في ميليلتر 500 ملم 10 مس الرقم الهيدروجيني 6 المخزن المؤقت وإضافة 100 g·mL-1 من الأجسام المضادة. واسمحوا أن الحل احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
- إزالة الفائض من الأجسام المضادة التي سينتريفوجينج الحل في 13800 x ز لمدة 10 دقائق مرتين وريسوسبيند بيليه في 500 ميكروليتر من 10 ملم فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7.5، المخزن المؤقت لكلوريد الصوديوم 0.3 متر. واسمحوا أن الحل احتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إزالة جسم منضم غير محدد بواسطة سينتريفوجينج الحل في 13800 x ز لمدة 10 دقائق مرتين وريسوسبيند بيليه في 500 ميكروليتر من ألبومين المصل البقري 1% (BSA) في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 6 مس 10 ملم. احتضان هذه العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- أغسل الفائض في جيش صرب البوسنة سينتريفوجينج الحل في 13800 x ز لمدة 10 دقائق مرتين، وريسوسبيندينج بيليه في ميكروليتر 500 ملم 10 مس الرقم الهيدروجيني 6 المخزن المؤقت.
- اتبع الخطوات 2.5.1 من خلال 2.5.9 لتعديل أجنبس م 5، 0.5 ملغ من إيونبس و 0.5 ملغ من سينبس مع الأجسام المضادة، ضبط كميات الصادرات وسالفو--دائرة الصحة الوطنية تبعاً لذلك.
3-عمودي تدفق فحوصات على الورق:
- إعداد [ميكروارس] بإيداعها بتركيز البروتين ز على غشاء الورق النيتروسليلوز تدرج مع طابعة روبوتية. بعد الطباعة، اسمحوا [ميكروارس] الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (~ 22 درجة مئوية).
- تنفيذ المقايسة التدفق العمودي مع الغشاء المغلقة في حامل عامل تصفية. تدفق إلى حل م 8 من أونبس تعديل مفتش باستخدام مضخة الترا-حقنه بمعدل 1 mL·min1. كرر هذه الخطوة مع حل أجنبس 17 "مفتش م"-تعديل، 0.1 mg·mL1 سينبس تعديل مفتش و 0.1 mg·mL1 إيونبس تعديل مفتش.
- واسمحوا [ميكروارس] الجاف في درجة حرارة الغرفة (~ 22 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة وفحصها في الماسح ضوئي مسطح بدقة 4800 نقطة في البوصة. حفظ الصور كملفات TIFF الألوان ذات 24-بت.
4-تشير فحوصات التجاري القائم على الزجاج:
- احتضان شريحتين زجاج لمدة 120 دقيقة للكشف عن العناصر المسببة للحساسية مع 4 عينات مصل الدم البشري مختلفة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف [ميكروارس] مع المياه.
- إينكوباتي شريحة واحدة مع فريق الخبراء الحكومي الدولي الإنسان المضادة مترافق الفلورسنت جسم في درجة حرارة الغرفة (~ 22 درجة مئوية) عن 30 دقيقة إينكوباتي الشريحة الثانية مع الإنسان المضادة فريق الخبراء الحكومي الدولي جسم-تعديل أونبس لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف [ميكروارس] مع المياه.
- قياس كثافة fluorescence ميكرواري التي كان المحتضنة مع جسم الإنسان المضادة الفلورسنت على فريق الخبراء الحكومي الدولي مع ليزر مسح الجهاز. رقمنة ميكرواري التي كان المحتضنة مع الإنسان المضادة فريق الخبراء الحكومي الدولي تعديل جسم أونبس مع ماسح ضوئي أعلى الجدول لاقتناء الإشارات اللونية.
- بعد والرقمنة، احتضان ميكرواري مع تعزيز الحل في درجة حرارة الغرفة (~ 22 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
- شطف الاستشعار مع المياه. والسماح لتجف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (~ 22 درجة مئوية).
- رقمنة ميكرواري مع ماسح ضوئي أعلى الجدول بدقة 4800 نقطة في البوصة لاقتناء الإشارات اللونية. حفظ الصور كالرمادي 16 بت ملفات TIFF.
5-ميكرواري الحضانة مع تعزيز الحل:
- مزيج مسبقاً على نفس القدر من الحل 1 و 2 الحل أو مزجها مباشرة على السطح من أجهزة الاستشعار، والتأكد من أن مجال الاهتمام في ميكرواري مغطى بخليط الحل.
- تمكنك أجهزة الاستشعار احتضانها في درجة حرارة الغرفة مع تعزيز الحل ليصل إلى الحد الأدنى 5 حضانة أطول وقت يمكن أن تسفر عن الحساسيات محسنة، فضلا عن ارتفاع نسبة الضوضاء/إشارة، خاصة بالنسبة للقائم على الورق [ميكروارس].
- تغسل في ميكرواري بغمر أنه في المياه مرة واحدة ل 5 س اتركه حتى يجف في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الوقت خطوة التجفيف يعتمد على مادة ميكرواري. ميكرواري الورقية، يتطلب خطوة التجفيف حوالي 30 دقيقة. ميكرواري المستندة إلى الزجاج، يتطلب خطوة التجفيف حوالي 5-10 دقيقة.
6-التصوير بالتحليل:
- تحليل كثافة الأسفار مع أداة البرمجيات. النظر في جميع النتائج التي مساوية أو أكبر من المعهد 0.3 توحيد وحدات (الوحدة)، اتباع الإرشادات للاستخدام (DfU) من الشركة المصنعة لأجهزة الاستشعار.
- تحليل الكثافات اللونية باستخدام أداة برمجية. عكس ملفات الصور وقياس الكثافة من كل بقعة وحساب كثافة بكسل يعني. استخدام القيم من ثلاث بؤر لحساب القيمة النهائية إشارة كمتوسط كثافة بكسل بقعة يعني ثلاثة.
Representative Results
بعد القيام تحليل، استخدام نانوبروبيس كعوامل الكشف، قد يتم ملؤها في مجال الكشف عن جهاز استشعار مع نانوبروبيس (الشكل 1). وإذا كان العدد نانوبروبيس الحد الأدنى للكشف عن مرئي، الكشف عن أكثر، في البداية، سينظر في السلبية. باستخدام بروتوكول المعروضة هنا (الشكل 1ب)، إشارة نانوبروبيس هو بوتينتياتيد بإدخال طبقة غير محددة من الاتحاد الأفريقي (الشكل 1ج).
تم الاضطلاع المناعة ورقية مصممة للكشف عن "البروتين ز" فيما يتعلق بعرض فعالية البروتوكول تعزيز (الشكل 2). أونبس، أجنبس، سينبس، وإيونبس تم تعديلها مع الأجسام المضادة مفتش واستخدامها، والكشف عن العوامل. وقد أعدت ورقة [ميكروارس] فيما يتعلق رج عدد من جزيئات "البروتين ز" كل بقعة.
بعد أن أجريت المقايسة، لوحظ أن مفتش أونبس المعدلة (IgG-أونبس) كانت قادرة على كشف منخفضة تصل إلى 2 × 105 جزيئات كل بقعة (الشكل 2)، مفتش أجنبس المعدلة (IgG-أجنبس) كانت قادرة على كشف منخفضة تصل إلى 2 × 104 جزيئات كل بقعة (الشكل 2ج)، مفتش تعديل إيونبس (IgG-إيونبس) كانت قادرة على كشف منخفضة 2 × 107 جزيئات كل بقعة (الشكل 2ه) وتعديل مفتش سينبس (IgG-سينبس) لم تكن قادرة على توفير إشارة مرئية ( الشكل 2ز).
التي تفرخ [ميكروارس] مع تعزيز الحل، كان من الممكن لزيادة الإشارة بمعززات عبر جميع أنواع الجسيمات النانوية المستخدمة. في حالة سينبس، تعزيز الحل جعلت بالإمكان لمراقبة إشارة حيث لوحظ لا إشارة مرئية دون تعزيز الحل (الشكل 22 واو 2d، ب، والمادة 2 حاء).
وكان تقييم إمكانية تطبيق الأسلوب على المناعة تجارية القائمة. تعزيز أجريت على حساسية القائم على الزجاج مكون ميكرواري المناعة. التحقق من صحة مجموعة من 4 وتتميز المصل تم تقييم عينات من مرضى حساسية مع ميكرواري (عينات وتم تعيين a b c و d). تمت مقارنة كشف هذا الفحص فلوروميتريك القياسية لتلطيخ مع مكافحة-فريق الخبراء الحكومي الدولي المسمى أونبس متبوعاً بتعزيز الإشارات (الشكل 3). قبل تعزيز، تم اكتشاف لا بقع على [ميكروارس] حيث أجرى الكشف مع مكافحة-فريق الخبراء الحكومي الدولي المسمى أونبس. بعد تعزيز، العديد من المواقع كانت مرئية بالعين المجردة وسجلت قوتها بصورة والرقمنة (الشكل 3). مع الكشف عن الأسفار، كانت مجموعة متنوعة من بقع الكشف عن (الشكل 3).
الشكل 1 . شكل توضيحي للخطوات التي يخضع ميكروسبوت من الكشف عن أكثر لتعزيز الإشارات. نانوبروبيس () اثنان جسم تعديل بعد الكشف عن أكثر معطلة في ميكروسبوت، (ب) حضانة ميكرواري مع بروتوكول تعزيز ونمو البذور اللاحقة من جسم تعديل نانوبروبيس و ( ج) ميكروسبوت حيث زيادة حجم نانوبروبيس بعد حضانة 5 دقيقة مع تعزيز الحل. وكان هذا الرقم دابتيد من دياس وآخرون. 20 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . صورة رقمية من [ميكروارس] للكشف عن البروتين غ. على اليسار من كل ميكرواري هي ميكروسبوتس الملاحظة قبل تعزيز الكشف عن الاضطلاع بها مع () IgG-أونبس، (ج) IgG-أجنبس، (ه) مفتش-إيونبس و (ز) مفتش-سينبس. على حق كل ميكرواري هي ميكروسبوتس بعد تعزيز (ب) IgG-أونبس، (د) IgG-أجنبس، (و) مفتش-إيونبس و (ح) مفتش-سينبس. وأودع كل تركيز البروتين ز في ميكرواري في ثلاث نسخ. حساب عدد من البروتين ز وقد تم ذلك استناداً إلى تركيز البروتين المطبوعة في كل ميكروسبوت. وهذا الرقم تم تكييف من دياس وآخرون. 20 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . العلاقة بين شدة الفلورسنت والكثافة اللونية التي تم الحصول عليها لفحوصات أجريت مع الفحص التشخيصي الحساسية التجارية- يعني كثافة الفلورية (MFI) وتعني الكثافة اللونية (MCI) قياس للكشف عن المواد المسببة للحساسية في عينات أ، ب، جيم، ودال Insets هي بيانات السجل 10 تتحول في الفواصل الزمنية حيث لوحظ وجود علاقة خطية بين كلا الأسلوبين. كثافة ميكروسبوتس لاحظ للكشف عن استناداً إلى جسم تعديل فلوروفوري (Fluorophore-Ab) انبعاثا الأسفار. تم الحصول على سطوع ميكروسبوتس لاحظ للكشف عن استناداً إلى التحليل أونبس Ab بعد الاضطلاع ميكرواري وعكس الصورة مع برامج التصوير. [ميكروارس] صممت فيما قد تريبليكاتيس الرأسي مع عناصر إيجابية للكشف عن الأسفار في أسفل اليمين المتطرف. يتم استخدام الزوايا الثلاث الأخرى لتقييم البرامج. وجرى تحليل الصور في الرمادي 16-بت. وهذا الرقم تم تكييف من دياس وآخرون. 20 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| R2 تعزيز السابقة | R2 بعد تعزيز | |
| أونبس مفتش | 8.70E-01 | 7.80E-01 |
| أجنبس مفتش | 9.10E-01 | 9.60E-01 |
| إيونبس مفتش | 9.17E-01 | 9.30E-01 |
| سينبس مفتش | - | 8.50E-01 |
الجدول 1. R2 القيم للكشف عن البروتين ز، قبل وبعد تعزيز، باستخدام مجموعات مختلفة من جسيمات نانوية. وتم الحصول على قيم ص2 بعد ربط كثافة البقع مع تركيز أكثر من قياس.
Discussion
حاليا، تقنيات تعزيز إشارة لفحوصات بالكشف على أساس نانوبروبي أما على أساس إنزيم12، تتطلب مجموعة ثانية من جسيمات نانوية للهدف نانوبروبيس الكشف عن21 أو، في حالة تلوين تقنيات، محدودة باستخدام أونبس أو أجنبس كالكشف عن تحقيقات. 22 هنا، هو وصف أسلوب بسيط وسريع وخال من إنزيم لتعزيز الإشارات من الاختبارات المستندة إلى الكشف عن نانوبروبي. بهذه الطريقة، كان من الممكن لتعزيز الإشارات اللونية المقدمة من 4 أنواع من نانوبروبيس: أونبس، أجنبس، إيونبس، وسينبس.
وكان معامل التضخيم المرصودة لكل مجموعة من نانوبروبيس من معززات، فيما عدا سينبس حيث القياس الكمي لعامل تعزيز لم يكن من الممكن الواجب لعدم وجود إشارات قبل تعزيز. هذا عامل تعزيز تشير إلى أن فعالية البروتوكول مماثلة عبر كافة أنواع نانوبروبيس. وعلاوة على ذلك، عندما نفذ البروتوكول تعزيز على دعم ورق حيث تمت طباعة سلسلة إضعاف من وقف أونبس الأسهم، لوحظ عامل تضخيم 10000-fold. السابقة لتعزيز، البقع مرئية مع أقل عدد من أونبس بحيث تم طبع حوالي 10000 جسيمات نانوية، بعد تعزيز البقع إيواء جسيمات نانوية أقل من 10 أصبحت مرئية. 20
وسمحت الشروط المحددة لتعزيز البروتوكول المعروضة هنا الاستفادة من الحد من الاتحاد الأفريقي3 + ل الاتحاد الأفريقي0 لتحسين إشارة، مع الحفاظ على ضجيج الخلفية إلى الحد أدنى. يمكن أن يؤديها في تعزيز حق بعد إجراء المقايسة فضلا على [ميكروارس] التي تم تخزينها لمدة تصل إلى عدة أشهر بعد المقايسة أنجز. تعزيز الحل يتكون من خليط 1:1 من الحل 1 و 2 الحل. يمكن سابقا مختلطة أو مختلطة مباشرة عند بيبيتيد على ميكرواري كل الحلول. الفرق بين قبل الخلط أو المزج مباشرة يؤثر فقط الحياة-الجرف لتعزيز الحل. عندما قبل مختلطة صلاحيتها من 5-7 أيام زيادة على 30-45 يوما إذا لم يكن مسبقاً مختلطة.
وقد أظهرت مزيدا من التحليل للنتائج أن الأسلوب تعزيز لا تتداخل مع التحليل الكمي بيوسينسور. وأبقى على علاقة خطية بين كثافة لاحظ وتركز أكثر (الجدول 1). وأظهرت البيانات التي تم الحصول عليها للعينات السريرية تتميز قبل 4 استخدام المناعة ميكرواري المكونات المسببة للحساسية القائمة على الزجاج، مع كشف fluorescence القياسية والكشف عن قياس الألوان، الفهرس أبجدي جيدة بين أساليب الكشف عن اثنين. مقارنة كثافة fluorescence يعني (MFI) والكثافة اللونية يعني (MCI)، متوسط ص2 = 0.79 +/-0.08 تم الحصول عليها عندما تكون البيانات 10-تسجيل على كلا محاور. وأظهرت هذه التجربة أن الأسلوب تعزيز يمكن تطبيقها على مجموعة تجارية إذا كان يستخدم في نانوبروبيس للكشف أو يمكن تكييفها للكشف على أساس نانوبروبي.
تعزيز فعالية أسلوب يعتمد على جانبين من جوانب حاسمة. من المهم أن أؤكد أنه خليط الحل 1 والحل 2 متجانسة. دون خليط متجانس، ستكون أجهزة الاستشعار على اتصال بكسور لتعزيز الحل حيث حل 1 أو 2 السائد بالنسبة للآخر. أن يقلل من الكفاءة للحد من الاتحاد الأفريقي3 + للاتحاد الأفريقي0، وبالتالي الأضرار بكفاءة تعزيز. من المهم أيضا أن المنطقة بأكملها لمصلحة ميكرواري على اتصال بتعزيز الحل خلال فترة الحضانة.
لتحقيق أولتراسينسيتيفي تعزيز إشارة، سيكون فترة حضانة أطول (حوالي 5 دقائق) مع تعزيز الحل المطلوب. لتجنب وضع الضوضاء الخلفية التي يمكن أن تتداخل مع الحصول على إشارة، ينبغي أن يكون السطح ميكرواري المحظورة سابقا (مثل جيش صرب البوسنة، شماعة) لمنع ترسب غير محدد السريع للاتحاد الأفريقي0 وما يترتب عليها من تشكيل من الذهب طبقة.
حد لتعزيز الأسلوب هو فعالية المتأصلة المقايسة. الفحص يتطلب وجود عناصر سلبية وإيجابية بما يكفل التقيد بتعزيز إشارة يمكن أن يعزى إلى نتائج إيجابية حقيقية. إذا كان هناك تفاعل غير محددة نانوبروبيس مع الهدف، اكتسبت إشارات بعد تعزيز لن يكون صالحاً.
تعزيز تقنيات أخرى استناداً إلى التجميع نانوحبيبات أما أو المصبوغة لجسيمات نانوية مع مواد التي تتيح الحصول على إشارة محسنة. عن طريق تعزيز جمع عدد من جسيمات نانوية في موقع الكشف، الحصول على إشارة يكون ممكناً أما بصريا أو قياسات الأشعة فوق البنفسجية-Vis. 5 تقنيات تعزيز هذه الإشارات تعتمد على نظام الكشف عن مرحلتين، الأولى الكشف عن أكثر من الفائدة، وخطوة ثانية حيث مطلوب المراسل لربط بناء الكشف الأولى. تفتقر هذه الاستراتيجيات العالمية نظراً لاشتراط محدد تعزيز البروتوكول الأمثل لكل نوع من التحليل.
تقنيات تعزيز المصبوغة، مثل الفضة تلطيخ، كثير مثل البروتوكول المعروضة هنا، تتيح تعزيز بنيات الكشف عن إشارة مباشرة. ومع ذلك، خلافا للبروتوكول الذي هو موضح هنا، تلطيخ الفضة فقط قد ثبت ليتم تطبيقها على أونبس أو أجنبس. 6 , 7 , 8 , 9
انطباق هذا الأسلوب يمكن أن المحتمل أن تمتد أي الإنزيم الذي يستخدم أونبس أو أجنبس أو إيونبس أو سينبس كعوامل الكشف. يجري مزيد من العمل لدراسة تطبيق الأسلوب في أجهزة الاستشعار التي تتكون من مواد أخرى.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
التمويل من "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن "البرنامج الإطاري السابع" للاتحاد الأوروبي (FP/2007-2013)/منسق الإغاثة الطارئة منحة الاتفاق رقم 615458، المجلس السويدي للبحوث والتميز برونوفا مركز للتكنولوجيا البروتين (فينوفا-السويدية العرفان هو الوكالة الحكومية لنظم الابتكار).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
References
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
