Summary
이 작품에서는, nanoprobe 기반 바이오 센 싱의 신호 향상을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜은 금은, 실리 카 또는 산화 철 나노 입자의 구성 된 기존 nanoprobes의 표면에 chloroauric 산의 감소를 기반으로 합니다.
Abstract
높은 감도 편리한 색도계 판독 등 금은, 실리 카 또는 산화 철 나노 입자 생물 분석 실험 시 약 검색으로 nanoprobes 사용 하 여 설정할 수 있습니다. 그러나, 나노 입자의 높은 밀도 일반적으로 검색 필요 합니다. 사용할 수 있는 합성 기반 향상 프로토콜 중 골드 및된 실버 나노 입자 또는 정확한 효소 제어 및 최적화. 여기, 선물이 골드, 실버, 실리 카, 산화 철 nanoprobes의 색도계 판독을 강화 하는 프로토콜. 그것은 10000-fold 요소까지 색도계 신호에 의해 향상 시킬 수 있습니다 관찰 했다. 이러한 신호 향상 전략에 대 한 Au3 + Au0의 화학 감소 이다. Au3 + Au0의 감소를 사용할 수 있는 여러 화학 반응 있다. 프로토콜에서 좋은 버퍼 및 H2O2 는 사용 하 고 누구나0 의 새로운 금 나노 입자의 형성에 기존 nanoprobes의 표면에 증 착을 부탁 수 있습니다. Chloroauric 산 및 H2O2 에 2-(N-morpholino)으로 구성 된 솔루션으로는 microarray의 외피의 프로토콜 구성 ethanesulfonic 산 성 pH 6 버퍼 nanoprobe 기반 탐지 분석 결과 따라. 향상 솔루션은 종이 유리 기반 센서에 적용할 수 있습니다. 또한, 그것은 사용할 수 있습니다 상용 immunoassays에 상업 알레르기 microarray 방법의 응용 프로그램에서와 같이. 신호 개발 향상 솔루션 외피의 5 분 미만 필요 하 고 판독 육안 또는 탁상 스캐너 또는 디지털 카메라 등 저가형 이미지 수집 디바이스 평가할 수 있습니다.
Introduction
금 나노 입자 (AuNPs) 또는 산화 철 나노 입자 (IONPs)와 같은 나노 재료를 사용 하 여 향상 된 감도와 다목적 바이오 센 싱에 응용 프로그램을 허용 했다. 1 볼륨 비율, 그들의 높은 표면의 활용으로 다양 한 ligands와 나노 입자의 표면 훈장을 위해 개발 된 방법의 과다 향상 된 감도와 센서의 디자인을 활성화 했습니다. 2 그럼에도 불구 하 고, 바이오 센 싱 도구 감지 신호를 달성 하는 데 필요한 nanoprobes의 수에 따라 달라 집니다. 예를 들어 40의 경우 nm UV vis 분광학, 약 90 × 106 nanoprobes 통해 신호를 얻으려고 AuNPs 관심의 목표를 효과적으로 탐지 하는 데 필요한. 3 이 nanoprobe 밀도 제한 신호 증폭을 통해 피할 수 있습니다. 이러한 전략4 interparticle 집계 또는 덩어리, 처음에 nanoprobes의 두 번째 세트를 축적 하 여 초기 nanoprobes의 밀도 증가 하는 어디를 기반으로 될 수 있습니다. 5 센서 표면에 주어진된 위치에 나노 입자의 수를 증가 visual 또는 UV 마주 신호 수집 수 있습니다. 그러나, 분석 결과의 감도 nanoprobes의 초기 설정으로 나노 입자의 두 번째 집합의 대상 능력에 본질적으로 링크 될 것입니다. 금색과 은색 nanoprobes의 얼룩에 의존 하는 다른 전략. 6 , 7 visual 또는 UV에 대 한 감지 하는 나노 입자의 표면에은 이온의 감소를 통해 이루어집니다는 얼룩. 8 이러한 방법 향상 금 기존 신호 또는 공명 표면 플라스몬 potentiating 여은 nanoprobes 신호, 보조 대상 사건 interparticle 덩어리 방법 따라 하지. 그러나,은 착 색 방법만 금 또는 nanoprobes의 사용으로 보고 되었다. 8 , 9
2005 년에, Zayats 외. 10 Au 금 nanoprobes 표면 플라스몬 공명 신호 증가 표면에 이온의 감소를 보고 했다. 이 효소 종속 작업에서 과산화 수소 및 chloroauric 산의 감소를 허용 하는 cetyltrimethylammonium 염화 함께 포도 당 산화 효소 촉매 작용에 의해 생성 되었습니다.
최근 왕은 외. 기존 nanoprobes의 표면에 골드 레이어 생성 향상 방법 보고. 11 이 확대 nanoprobes 표시 기판 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) 육안에 의해 밝은 파란색의 시각화를 사용에 대 한 과산화 효소와 같은 촉매 활동.
스티븐 스 외. plasmonic ELISA 기반 분석 결과의 개발을 보도 했다. 12 전통 ELISA 전략을 통해 전립선 특정 항 원 (PSA)의 검색, 이차 항 체 카 탈 라 제와 함께 표시 했다 incubated 센서는 센서에에서 젖 었습니다 과산화 수소를 포함 하는 솔루션 및 chloroauric 산입니다. 보조 catalase 수정 항 (긍정적 결과)의 존재는 과산화 수소, chloroauric 산 감소 둔화와 붉은 색으로 준 구형 monodispersed AuNPs 저조한의 소비를 홍보 것 이다. 과산화 수소 농도를 그대로, 따라서 빠른 chloroauric 감소를 추진 하 고 병이 정의 형태학 파란색/보라색 색상에 대 한 책임으로 AuNPs 저조한 유지를 허용 하는 catalase 수정 항 체 (부정적인 결과)의 부재 . 카 탈 라 제의 활동에 의해 결정 되는 과산화 수소의 농도의 분석의 농도에 상관 될 표시 했다. Catalase 수정 이차 항 체 및 촉매 활동의 조건의 제어에 대 한 필요는이 방법의 보편성을 방해 하는 두 가지 요인이 있습니다. 또한, 기존 AuNPs의 독립적인 골드 클러스터의 형성 배경 잡음 문제 확대 전략을 소개 합니다.
위에서 언급 한 기술도 몇 가지 다른13,14,15, 가능 하 게 만든 그것은 전통적인 기술 파 탐지의 한계를 달성 하기 위해 nanoprobe 기반 바이오 센서에 대 한.
여기, 소설 금 향상 방법 시연 되는 기존 nanoprobe의 신호는 potentiating 또는 표면 플라스몬 공명 신호를 도입 하 여 증폭 하는. 센서는 과산화 수소와 2-(N-Morpholino) chloroauric 산의 혼합물의 솔루션으로 품 어 수 후 검색 실시 하는 골드, 실버, 실리 카 또는 산화 철 나노 입자의 사용과, ethanesulfonic 산 (MES) pH 6 버퍼. 향상 솔루션의 구성 요소의 농도 Au0 기존 nanoprobes의 표면에 증 착을 최적화 했다. 모든 nanoprobe 유형, 즉를 공부 했다. AuNPs, 실버 나노 입자 (AgNPs), 실리 카 나노 입자 (SiNPs)와 IONPs, 병이 정의 하는 계층의 형성 굴복 하거나 감지 또는 증가 보이는 신호 귀착되는 빛의 산란을 증강. 종이 유리 기반 microarrays에 nanoprobes에 대 한 100 증폭 계수와 신호 증가 달성 하 고 프로세스는 신호를 얻으려고 5 분 미만 소요. 육안에 의해 신호 수집을 할 수 있는 UV vis 분광학 또는 이미징 탁상 스캐너 또는 디지털 카메라와 같은 낮은-엔드 도구. 또한, 그것은이 향상 프로토콜 적용할 수 있는 즉시 상용 알레르기 진단 분석 결과에서 특정 최적화를 필요로 하지 않고 시연 했다.
Protocol
인간의 혈 청 샘플 컬렉션, 즉국가의 법적, 윤리적 요구 사항에 따라에서 얻은 했다. 윤리 위원회의 (또는 유사한) 승인 및 기증자 로부터 서 면된 동의.
1. 향상 솔루션 준비:
- 나트륨 소금 이온된 수에 MES를 일시 중단 하 여 10mm MES pH 6 버퍼를 준비 합니다. 6 4 M NaOH 솔루션을 사용 하 여 pH를 조정 합니다.
- 5 m m 10mm MES pH 6 버퍼 (해결 방법 1)에서 HAuCl4 솔루션을 준비 합니다.
- 10 m m MES pH 6 버퍼 (솔루션 2) 1.027 M H2O2 솔루션을 준비 합니다.
참고: 솔루션 1과 솔루션 2 볼륨 향상 될 수와 microarrays의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어, 10 x 10 m m의 microarray 100 μ 총 볼륨 (솔루션 1 + 솔루션 2) microarray 영역 향상 솔루션 문의 되도록 필요 합니다. 희석, 후 H2O2 는 약 30-45 일 이내에 사용 되어야 한다.
2. 나노 준비:
- 준비 하는 40 nm AuNPs Bastús 외에 설명 된 대로. 16 는 짧게, 2.2 m m 나트륨 구 연산 염 (149 mL)의 끓는 솔루션으로 수성 25 m m HAuCl4 전조의 1 mL를 주사. 레드 와인 색상은 관찰 될 때까지 기다립니다. 씨앗으로 나노 입자의이 솔루션을 사용 하 여 씨앗 성장 단계.
- 90 ° C에서 60 m m 나트륨 구 연산 염 솔루션을 포함 하는 씨앗에 25 mM HAuCl4 의 1 mL 선행의 1 mL를 주사. 30 분 후 반응 완료 됩니다. 씨앗-성장 단계 반복 5 번 때까지 40 nm 나노 입자는, Bastús 외에 설명 된 대로. 16
- 나노 입자의 크기를 결정 하기 위한 나노 입자의 최종 솔루션의 대 한 UV 흡 광도 측정 합니다. 17 또는 전송 전자 현미경 (TEM) 수 수 인수 하 고는 나노 입자의 크기를 결정 하는 데 사용.
- 준비 90 nm AgNPs Rivero 외에 설명 된 대로. 18 잠시, 폴 리 (아크릴산 나트륨 소금)의 적극적으로 냈다 솔루션 dimethylaminoborane (DMAB) 추가 (PAA)와 어 그 노3. 솔루션의 최종 볼륨 50 mL 및 DMAB, PAA의 최종 농도 이며 AgNO3 는 1.6 mM, 10 mM 및 3.33 m m, 각각.
참고: 100 nm IONPs 수정 carboxyl 그룹 및 50 nm carboxyl 그룹 수정 SiNPs 구입 했다. - 푸에르타 스 외에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 항 체와는 AuNPs를 functionalize. 19 는 짧게, 1.2x10-9 M AuNPs의 솔루션에 1mg의 COOH-말뚝-SH (5000 g·mol− 1) 추가 (10 광 밀도, OD). 12 4 M NaOH 솔루션에 pH를 조정 합니다.
- 순 교 반 조건 하에서 하룻밤, 실내 온도 (~ 22 ° C)에 품 어 솔루션을 보자.
- 15 분 13800 x g에서 솔루션 centrifuging 말뚝의 과잉을 제거 합니다.
- 이온된 수의 500 μ와 펠 릿 resuspend
- N-(3-Dimethylaminopropyl)-N의 5 μmol와 페그 수정 AuNPs를 품 어 '-37 ° c.에 30 분 동안 ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 N-hydroxysulfosuccinimide 나트륨 소금 (sulfo NHS) 10mm MES ph 6의 7.5 μmol 버퍼
- 5 분 13800 x g에서 솔루션 centrifuging EDC와 sulfo NHS의 과잉을 제거 합니다.
- 10 m m MES 버퍼 pH 6의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 100 g·mL-1 항 체의 추가. 솔루션 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어 보자
- 10 분 13800 x g에서 솔루션을 두 번 centrifuging 여 항 체의 과잉을 제거 하 고 10 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 0.3 M NaCl 버퍼의 500 μ에 펠 릿을 resuspend. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어 솔루션을 보자
- 10 분 13800 x g에서 솔루션을 두 번 centrifuging 여 난다 바인딩된 항 체를 제거 하 고 10 m m MES pH 6 버퍼에 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 500 μ에 펠 릿을 resuspend. 4 ° C에서 샘플을 밤새 품 어.
- 두 번, 10 분 13800 x g에서 솔루션 centrifuging와 10mm MES 버퍼 pH 6의 500 μ에 펠 릿을 resuspending 하 여 BSA의 초과 씻어.
- 따라 EDC와 sulfo NHS의 수량을 조정 하는 항 체와 SiNPs의 2.5.9 5 M AgNPs, IONPS의 0.5 mg을 0.5 mg의 수정에 대 한 통해 2.5.1 단계를 따릅니다.
3. 수직 흐름 종이 기반 분석 실험:
- Microarrays는 로봇 프린터 니트로 종이 막에 G 단백질의 그라데이션 농도 입금 하 여 준비 합니다. 인쇄, 후 microarrays 실내 온도 (~ 22 ° C)에서 하룻밤을 건조 시킬.
- 필터 홀더에 막으로 수직 흐름 시험을 실시 합니다. 1 mL·min− 1의 속도로 울트라-주사기 펌프를 사용 하는 IgG 수정 AuNPs의 8 M 솔루션 흐름. 17 M IgG 수정 AgNPs의 솔루션으로이 단계를 반복 하 여 0.1 mg·mL− 1 IgG 수정 SiNPs 및 0.1 mg·mL− 1 IgG 수정 IONPs.
- 30 분 동안 실내 온도 (~ 22 ° C)에 말리 고 4800 dpi의 해상도에 평판 스캐너에서 스캔 microarrays 하자. 24-비트 컬러 TIFF 파일 이미지를 저장 합니다.
4. 상업 유리 기반 분석을 참조:
- 실 온에서 4 다른 인간의 혈 청 샘플 구성 요소 알레르겐의 검출에 대 일 분에 대 한 두 개의 유리 슬라이드를 품 어.
- Microarrays 이온된 물으로 린스.
- 품 한 슬라이드는 형광 활용 된 안티 인간 IgE 항 체로 30 분 안티 인간 IgE와 품 두 번째 슬라이드에 대 한 실 온 (~ 22 ° C)에서 항 체-수정 AuNPs 실 온에서 30 분.
- Microarrays 이온된 물으로 린스.
- 형광 안티 인간 IgE 항 체와 알을 품는 레이저 장치를 스캔 microarray의 형광 강도 측정 합니다. 이었다 incubated 안티 인간 IgE 항 체 수정 AuNPs 색도계 신호 수집을 위한 테이블 탑 스캐너로 microarray 디지털화
- 디지털화, 후 5 분 동안 실내 온도 (~ 22 ° C)에 향상 솔루션 microarray를 품 어.
- 이온된 수와 센서를 헹 구 고 실내 온도 (~ 22 ° C)에서 10 분 동안 말리는 것을 그것 허용.
- 색도계 신호 수집을 위한 4800 dpi의 해상도-탁상용 스캐너는 microarray를 디지털화. 이미지 저장할 16 비트 회색조 TIFF 파일.
5. Microarray 인큐베이션 향상 솔루션:
- 솔루션 1과 솔루션 2의 동일한 금액을 미리 혼합 또는 센서의 표면에 직접 그들을 혼합 하 고는 microarray에 관심 분야 솔루션의 혼합물으로 덮여 확인 합니다.
- 최대 5 분 이상 보육에 시간 얻을 수 있습니다 향상 된 감도 특히 microarrays 종이-기반에 대 한 높은 잡음/신호 비율에 대 한 하자 센서 향상 솔루션으로 실 온에서 품 어.
- 5 한 번 이온된 물에 잠수 하 여 있는 microarray를 씻어 미 실 온에서 건조 두고.
참고: 건조 단계에 있는 microarray 자료에 따라 달라 집니다. 종이 기반 microarray 건조 단계 약 30 분 필요합니다. 유리 기반 microarray 건조 단계 약 5-10 분 필요합니다.
6. 영상 분석:
- 소프트웨어 도구와 형광 강도 분석. (DfU)를 사용 하 여 센서 제조 업체의 지시에 따라 0.3 Isac 표준화 단위 (ISU) 보다 크거나 중인 모든 결과를 고려 하십시오.
- 소프트웨어 도구를 사용 하 여 색상 채도 농도 분석 합니다. 이미지 파일을 반전, 각 명소의 강도 측정 하 고 평균 픽셀 강도 계산. 세 가지 뜻 자리 픽셀 농도의 뜻으로 최종 신호 값을 계산 하는 triplicate 명소의 값을 사용 합니다.
Representative Results
분석 결과, 실행 된다 nanoprobes를 사용 하 여 검색 요원으로 후 센서 탐지 영역 nanoprobes (그림 1a)로 채울 수 있습니다. 비주얼 검색 제한 아래 nanoprobes의 수를 실행 하는 경우는 분석의 검색, 처음, 간주 됩니다 부정. (그림 1b)를 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하는 nanoprobes의 신호는 Au그림 1(c)의 병이 정의 층을 도입 하 여 potentiated입니다.
단백질 G의 탐지를 위한 종이 기반 immunoassay 향상 프로토콜 (그림 2)의 효과 보여주는로 실시 됐다. AuNPs, AgNPs, SiNPs, IONPs IgG 항 체와 수정 그리고 사용 및 검색 에이전트. 종이 microarrays 자리 당 단백질 G 분자의 수의 그라디언트로 준비 했다.
그것을 관찰 분석 결과, 실시 후 수정 된 AuNPs (IgG-AuNPs) 낮은 자리 (그림 2는) 당 2 × 105 분자 검출 수 있었다 IgG, IgG 수정된 AgNPs (IgG-AgNPs) 2 × 104 낮은 검색 수 있었다 자리그림 2(c) 당 분자, IgG 수정 IONPs (IgG-IONPs) SiNPs (IgG-SiNPs) ( 시각적 신호를 제공 하지 못했습니다 당 2 × 107 분자 (그림 2e) 자리와 IgG 수정 낮은 검색 수 있었다 그림 2g).
그건 약에 의해 신호를 높일 수 향상 솔루션 microarrays, 배양 하 여 사용 하는 나노 입자의 모든 종류에 걸쳐. SiNPs, 경우 향상 솔루션 가능 하 게 했다 시각적 신호 향상 솔루션 없이 관찰 되었다 신호를 관찰 하는 것 (그림 2b, 2d, 2 층 2 h).
기존 상업 immunoassay 방법의 적용 가능성 평가 했다. 강화 유리 기반 알레르기 구성 요소 microarray immunoassay에 실행 되었다. 4 세트 유효성 검사 및 혈 청 알레르기 환자에서 샘플은 microarray와 평가 했다 특징 (샘플 a, b로 지정 되었다 c와 d). 이 분석 결과의 표준 fluorometric 감지 안티-IgE AuNPs 신호 (그림 3)의 향상에 따른 분류와 얼룩이 비교 되었다. 향상, 이전에 아무 반점 microarrays는 감지 안티-IgE AuNPs를 표시와 함께 실시 되었다 어디에 발견 했다. 향상, 후 여러 관광 명소 육안으로 표시 되었고 그들의 강도 이미지 디지털화 (그림 3)에 의해 등록 되었다. 형광 탐지와 관광 명소의 다양 한 했다 감지 (그림 3).
그림 1 . 일러스트 레이 션 단계는 microspot 향상 된 신호를 분석 감지에서 수행 됩니다. 는 microspot, 향상 프로토콜 microarray의 부 화 (b)와 nanoprobes 항 체 수정 및 (의 후속 씨앗 성장에 움직일 수 있는 분석의 검색 (한) 2 항 체 수정 nanoprobes c) microspot는 nanoprobes의 크기 5 분 향상 솔루션 잠복기 후 증가. 이 그림에서 디아스 외dapted 되었습니다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . G. 단백질의 검출을 위한 microarrays의 디지털된 이미지 각 microarray의 왼쪽에는 탐지 (로한) (c) (e) IgG AgNPs IgG AuNPs 수행의 향상 이전에 관찰 된 마이크로 IgG IONPs 및 (g) IgG-SiNPs. (B) (d) (f) IgG AgNPS IgG AuNPs의 향상 후는 마이크로 각 microarray의 오른쪽에는 IgG IONPs와 (h) IgG-SiNPs. 단백질 G의 각 농도 3 중에 microarray에 입금 했다. 단백질 G 이루어졌다 단백질의 농도에 따라 수의 계산 각 microspot에 인쇄. 이 그림에서 디아스 외적응 되었습니다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 형광 강도 분석 실험에 대 한 얻은 색도계 강도 사이 상관 관계 상업 알레르기 진단 분석 결과 함께 실시. 형광 강도 (MFI) 의미 고 색도계 강도 (MCI) a, b, 샘플에 알레르기 검출을 위한 측정을 의미 c 및 d. 인세트 로그 10 변형 데이터 간격 두 방법 사이의 선형 상관 관계가 관찰 되었다. 마이크로 fluorophore 수정 항 체 (Fluorophore-Ab)에 따라 검색에 대 한 관찰의 강도 형광 방출. 마이크로 Ab AuNPs 분석 결과에 따라 검색에 대 한 관찰의 밝기는 microarray를 디지털화 하 고 이미징 소프트웨어 사용 하 여 이미지를 반전 후 얻은 것입니다. Microarrays는 맨 오른쪽 하단에 형광 검출에 대 한 긍정적인 컨트롤과 세로 triplicates로 설계 되었습니다. 다른 3 개의 모서리는 소프트웨어 평가에 사용 됩니다. 이미지는 16 비트 회색조로 분석 되었다. 이 그림에서 디아스 외적응 되었습니다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| R2 사전 향상 | 향상 후 R2 | |
| IgG AuNPs | 8.70E-01 | 7.80E-01 |
| IgG AgNPs | 9.10E-01 | 9.60E-01 |
| IgG IONPs | 9.17E-01 | 9.30E-01 |
| IgG SiNPs | - | 8.50E-01 |
표 1입니다. R2 검색 향상, 나노 입자의 다른 세트를 사용 하 여 전후의 단백질 G, 이전 값. R2 값은 측정 분석의 농도와 관광 명소의 강도 상호 연결 후 얻은 했다.
Discussion
현재, nanoprobe 기반 탐지와 분석에 대 한 신호 향상 기법 중 효소 기반12, 대상 검색 nanoprobes21 나노 입자의 두 번째 집합을 필요로 또는, 기법, 얼룩의 경우에 제한 됩니다. AuNPs 또는 감지 프로브로 AgNPs의 사용. 22 여기, 간단, 신속 하 고 효소 없는 메서드 nanoprobe 탐지 기반 분석 실험의 신호 향상을 위한 설명 되어 있습니다. 이 방법으로, 그것은 nanoprobes의 4 종류에서 제공 하는 색도계 신호를 향상 시킬 수: AuNPs, AgNPs, IONPs 및 SiNPs.
Nanoprobes의 각 집합에 대 한 관찰된 증폭 요인은 향상 요인의 정량화 사전 향상 신호의 부족으로 인해 가능 하지 않았다 SiNPs 제외한 약,의 이었다. 이 향상 요인은 모든 유형의 nanoprobes 프로토콜의 효율성은 유사한 나왔다. 또한, 향상 프로토콜 재고 AuNPs 현 탁 액의 희석 시리즈 인쇄 된 종이 지원에 실행 되었다 때 10000-fold 증폭 요인은 관찰 되었다. 향상, AuNPs의 낮은 번호 표시 장소에 이전 했다 약 10000 나노 인쇄 되었다 향상 후 10 나노 입자를 은닉 하는 관광 명소 보이게 되었다. 20
여기 제시 향상 프로토콜에 대 한 설립 조건 Au3 + 의 감소의 Au0 최소에 배경 잡음을 유지 하면서 신호 향상을 위한 활용 수 있다. 분석 결과 뿐만 아니라에 대 한 최대 저장 된 microarrays에 몇 달 후 분석 결과 수행한 수행 된 후 바로 향상을 수행할 수 있습니다. 솔루션 1과 솔루션 2의 1:1 혼합 향상 솔루션에 의하여 이루어져 있다. 두 솔루션 이전 혼합 하거나 직접는 microarray에 pipetted 때 혼합 될 수 있습니다. 미리 혼합 또는 직접 혼합의 차이만-수명 향상 솔루션의 영향을 줍니다. 때 미리 혼합 선반-인생은 그렇지 않으면 30-45 일을 증가 하는 5-7 일의 사전 혼합.
추가 분석 결과의 향상 메서드는 바이오 센서의 정량 분석 방해 하지 않습니다 나타났습니다. 관찰 하는 강도와 분석의 농도 사이의 선형 상관 관계 (표 1)를 유지 했다. 4 미리 특징이 임상 샘플 표준 형광 탐지 및 색도계 검출, 유리 기반 알레르기 구성 요소 microarray immunoassay를 사용 하 여 얻은 데이터 두 검출 방법 사이 좋은 일치를 보였다. 말은 형광 강도 (MFI)와 평균 색도계 강도 (MCI), 평균 R2 비교 = 0.08 ± 0.79 데이터가 10-양 축 로그온 때 얻은. 이 실험이 보여주었다는 nanoprobes를 사용 하 여 검색 하거나 nanoprobe 기반 탐지에 대 한 적용할 수 있습니다 경우 향상 방법 상업 키트에 적용할 수 있습니다.
향상 방법 효능 두 중요 한 측면에 의존합니다. 솔루션 1의 혼합 보장 하는 것이 중요 하다 고 솔루션 2 균질 성 이다. 동질적인 혼합물을 없이 센서 솔루션 1 또는 2는 다른 기준으로 주된 향상 솔루션의 접촉 될 것입니다. 그의 Au3 + Au0, 따라서 손상 강화의 효율 감소의 효율성을 줄일 것입니다. 그것은 또한 잠복기 동안 향상 솔루션 접촉 microarray의 관심의 전체 영역을 갖는 것이 중요.
신호의 磁 향상을 위해 향상 솔루션와 함께 긴 부 화 시간 (약 5 분) 하셔야 합니다. 신호 획득을 방해할 수 있는 배경 잡음의 개발을 방지 하려면 microarray 표면 해야 이전 차단 (예: BSA, 못) 골드의 Au0 및 결과 형성의 신속한 난다 증 착을 방지 하기 위해 레이어입니다.
향상 방법에 한계는 분석 결과의 본질적인 효능 이다. 분석 결과 부정적이 고 긍정적인 컨트롤 신호 향상 관찰 확인 하십시오 데 true 긍정적인 결과에 표시 될 수 있습니다 필요 합니다. 경우에 대상으로는 nanoprobes의 일반적인 상호 작용을, 신호 인수 후 향상 유효 하지 않을 것 이다.
다른 향상 기법 중 나노 집계에 따라 또는 향상 된 신호 수집을 허용 하는 재료와 나노 입자의 얼룩 있습니다. 검색 사이트에서 나노 입자의 수의 집회를 홍보 하 여 신호 수집 가능한 것도 시각적으로 또는 UV에 대 한 측정. 5 이러한 신호 향상 기법 2 단계 탐지 시스템, 관심과 기자 초기 감지 구조에 바인딩할 필요는 두 번째 단계는 분석의 초기 검색에 의존 합니다. 이러한 전략의 분석 결과의 각 유형에 대 한 특정 향상 프로토콜 최적화의 요구 사항으로 인해 보편성을 부족합니다.
얼룩, 훨씬 여기 제시, 프로토콜 같은 실버 등 착 색 향상 기법, 신호 검색 구문 직접 향상을 수 있습니다. 그러나, 여기에 표시 되는 프로토콜, 달리 실버 얼룩만 보였다 AuNPs 또는 AgNPs에 적용할. 6 , 7 , 8 , 9
이 방법의 적용 가능성이 탐지 요원 AuNPs, AgNPs, IONPs 또는 SiNPs를 사용 하는 분석 결과 걸쳐 수 있습니다. 추가 작업은 다른 물자의 구성 된 센서에서 방법의 응용 연구를 수행 되 고.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP/2007-2013) 아래 유럽 연구 위원회에서 자금 / ERC 부여 계약 번호 615458, 스웨덴 연구 위원회 및 Pronova 우수성 센터 단백질 기술 (VINNOVA-스웨덴어 혁신 시스템에 대 한 정부 기관)은 기꺼이 인정 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
References
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
