Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Rask Nanoprobe Signal forsterkning av i Situ gull hydrogenion syntese

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/57297

Summary

I dette arbeidet presenteres en protokoll for signal forsterkning av nanoprobe-baserte biosensing. Protokollen er basert på reduksjon av chloroauric syre på overflaten av eksisterende nanoprobes som består av gull, sølv, silica eller jernoksid nanopartikler.

Abstract

Bruk av nanoprobes som gull, sølv, silica eller jernoksid nanopartikler som gjenkjenning reagenser i bioanalytical analyser kan aktivere høy følsomhet og praktisk kolorimetrisk avlesning. Imidlertid er høye tettheter av nanopartikler vanligvis nødvendig for gjenkjenning. Tilgjengelige syntese-baserte ekstrautstyr protokollene er enten gull og sølv nanopartikler eller stole på nøyaktig enzymatisk kontroll og optimalisering. Her presenterer vi en protokoll for å forbedre den kolorimetrisk avlesning av gull, sølv, silica og jernoksid nanoprobes. Det ble observert at kolorimetrisk signalet kan forbedres ved inntil en 10000-fold faktor. Grunnlaget for slike signal forsterkning strategier er kjemisk reduksjon av Au3 + Au0. Det er flere kjemiske reaksjoner at reduksjon av Au3 + Au0. Gods buffere og H2O2 brukes i protokollen, og det er mulig å favorisere avsetning Au0 på overflaten av eksisterende nanoprobes, i skade for dannelsen av nye gull nanopartikler. Protokollen består av inkubasjonstiden for microarray med en løsning med chloroauric syre og H2O2 i 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre pH 6 bufferen etter nanoprobe-basert oppdagelsen analysen. Løsningen kan brukes til papir og glass-baserte sensorer. Dessuten kan det brukes i kommersielt tilgjengelig immunanalyser som demonstrert av anvendelsen av metoden til en kommersiell allergen microarray. Signalet utvikling krever mindre enn 5 min med inkubering med ekstrautstyr løsningen og er avlesning kan bli vurdert av blotte øye eller low-end bilde oppkjøpet enheter som en bord-skanner eller et digitalt kamera.

Introduction

Bruk av nanomaterialer som gull nanopartikler (AuNPs) eller jernoksid nanopartikler (IONPs) har tillatt programmene i biosensing med økt følsomhet og allsidighet. 1 mengde metoder utviklet for utsmykkingen av overflaten av nanopartikler med forskjellige stoffer i kroppen, som å dra nytte av deres høy overflate til volumkontrollen, har aktivert utformingen av sensorer med økt følsomhet. 2 likevel en biosensing verktøyet er avhengig av antall nanoprobes som kreves for å oppnå en detectable signal. For eksempel ved 40 nm AuNPs, å skaffe seg et signal gjennom UV-vis spektroskopi, ca 90 × 106 nanoprobes kreves for å effektivt oppdage mål av interesse. 3 denne nanoprobe tetthet begrensningen kan omgås ved hjelp av signalforsterkning. Slike strategier4 kan baseres på interparticle samling eller agglomeration, der tettheten av første nanoprobes økes med samler et annet sett med nanoprobes på først. 5 av nanopartikler på et bestemt sted på en sensor overflate gir visuelle eller UV-vis signalet vinningen. Imidlertid vil sensitiviteten av analysen bli iboende koblet målretting kapasiteten på det andre settet med nanopartikler mot den første settet med nanoprobes. Andre strategier er avhengige av den flekker av enten gull og sølv nanoprobes. 6 , 7 den flekker oppnås gjennom reduksjon av sølv ioner onto overflaten av nanopartikler, aktivere en visual eller UV-vis gjenkjenning. 8 metodene forbedre signalet av gull eller sølv nanoprobes av potentiating overflaten resonans plasmon signal, ikke avhengig av sekundær målretting hendelser som interparticle agglomeration metoder. Sølv flekker metoder har imidlertid bare rapportert med bruk av gull eller sølv nanoprobes. 8 , 9

I 2005, Zayats et al. 10 rapportert reduksjon av Au ioner onto overflaten av gull nanoprobes å øke overflaten plasmon resonans signalet. I dette enzymet-avhengige arbeidet, ble hydrogenperoksid generert av glukose oksidase katalyse og cetyltrimethylammonium chloride tillatt reduksjon av chloroauric syre.

Nylig Wang et al. rapportert en enhancement metode hvor et gull lag er produsert på overflaten av eksisterende nanoprobes. 11 disse forstørret nanoprobes vises peroxidase-lignende katalytisk aktivitet mot underlaget 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) aktivere visualisering av lys blå farge ved å blotte øye.

Stevens et al. rapportert utviklingen av en plasmonic ELISA-baserte analysen. 12 etter oppdagelsen av en prostata-spesifikt antigen (PSA) gjennom en tradisjonell ELISA strategi, en sekundær antistoff merket med catalase ble inkubert med sensor som sensoren var oppslukt i en løsning som inneholder hydrogenperoksid og chloroauric syre. Tilstedeværelsen av sekundær catalase endret antistoffer (positivt resultat) ville fremme forbruket av Hydrogenperoksid, bremse chloroauric syre reduksjon og gir kvasi sfærisk monodispersed AuNPs med en rød farge. Fravær av catalase endret antistoffer (negativt resultat) tillatt hydrogenperoksid konsentrasjonen være intakt, dermed fremme rask chloroauric reduksjon og gir AuNPs med dårlig definerte morphologies ansvarlig for en blålilla farge . Konsentrasjonen av hydrogen peroxide, bestemmes av aktiviteten til catalase, viste seg å være korrelert til konsentrasjonen av analytt rundt. Behovet for en catalase endret sekundære antistoff og kontroll av betingelsene for katalytisk aktiviteten er to faktorer som hindrer universalitet av denne metoden. Videre kan dannelsen av gull klynger, uavhengig av den eksisterende AuNPs, introdusere bakgrunn støy problemer til forsterkning strategi.

De ovennevnte teknikkene, som også flere andre13,14,15, har gjort det mulig for nanoprobe-basert biosensors å oppnå grensene for gjenkjenning på linje med tradisjonelle teknikker.

Her, en roman gull enhancement metode er bevist, der signalet fra en eksisterende nanoprobe forsterkes av potentiating eller innføre en overflate plasmon resonans signal. Etter at registreringen er utført med bruk av gull, sølv, silica eller jernoksid nanopartikler, sensoren er tillatt å ruge med en løsning på en blanding av hydrogen peroxide og chloroauric syre i 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) pH 6 buffer. Konsentrasjonen av komponentene i løsningen var optimalisert for å favorisere avsetning Au0 på overflaten av eksisterende nanoprobes. For alle studert nanoprobe typer, dvs. AuNPs, silver nanopartikler (AgNPs), silica nanopartikler (SiNPs) og IONPs, dannelsen av en dårlig definerte lag gitt eller utvidet spredning av lys som resulterte i en synlig eller økt synlig signal. En signal økning med en 100-fold forsterkning faktor ble oppnådd for nanoprobes i papir og glass-basert microarrays og prosessen tar mindre enn 5 minutter å få et signal. Signalet vinningen kan gjøres av blotte øye, UV-vis spektroskopi eller imaging low-end verktøy som et digitalt kamera eller en bord-skanner. Videre ble det vist at denne ekstrautstyr protokollen kan lett brukes i en kommersielt tilgjengelig allergi diagnostiske analysen uten spesifikk optimalisering.

Protocol

Under koagulasjon ble innhentet i henhold til juridisk og etisk kravene i landet samling, dvs. godkjenning av en komité (eller lignende) og med skriftlig samtykke fra donor.

1. ekstrautstyr løsningen forberedelse:

  1. Forberede en 10 mM MES pH 6 buffer ved å stenge MES natrium salt i deionisert vann. Justere pH 6 bruker en 4 M NaOH løsning.
  2. Forbered en 5 mM HAuCl4 løsning i 10 mM MES pH 6-buffer (løsning 1).
  3. Forberede en H 1.027 M2O2 løsning i 10 mM MES pH 6-buffer (løsning 2).
    Merk: Volum av både løsning 1 og løsning 2 avhengig av antallet og størrelsen på microarrays å styrkes. Et microarray 10 x 10 mm krever for eksempel 100 μL totalt volum (løsning 1 + løsning 2) å sikre at området microarray er i kontakt med løsningen. Etter fortynning, bør H2O2 brukes i ca 30-45 dager.

2. nanopartikler forberedelse:

  1. Forberede 40 nm AuNPs som beskrevet av Bastús et al. 16 kort, injisere 1 mL av vandig 25 mM HAuCl4 forløper i en kokende løsning av 2,2 mM natriumsitrat (149 mL). Vent til en rødvin farge er observert. Bruk denne løsningen av nanopartikler som frø for frø-vekst trinn.
  2. Ved 90 ° C, injisere 1 mL av 60 mM natriumsitrat etterfulgt av 1 mL av 25 mM HAuCl4 frø som inneholder løsningen. Etter 30 min er reaksjonen fullført. Gjenta frø-vekst trinn fem ganger til 40 nm nanopartikler er oppnådd, som beskrevet av Bastús et al. 16
  3. Måle UV-vis absorbansen av den endelige løsningen av nanopartikler for å bestemme størrelsen på nanopartikler. 17 eventuelt transmission elektron micrographs (TEM) kan kjøpt og brukes for å bestemme størrelsen på nanopartikler.
  4. Forberede 90 nm AgNPs som beskrevet av Rivero et al. 18 kort, legge dimethylaminoborane (DMAB) til en kraftig rørt løsning av poly (akryl syre, natrium salt) (PAA) og AgNO3. Det siste bindet av løsningen er 50 mL og endelige konsentrasjonen av DMAB, PAA AgNO3 er 1,6 mM, 10 mM og 3,33 mM, henholdsvis.
    Merk: 100 nm IONPs endret med carboxyl grupper og 50 nm SiNPs endret med carboxyl grupper ble kjøpt.
  5. Functionalize AuNPs med antistoffer følger protokollen beskrevet av Puerta et al. 19 kort, legge til 1 mg av COOH PEG-SH (5000 g·mol−1) i en løsning av 1.2x10-9 M AuNPs (10 optisk tetthet, OD). Justere pH 12 med en løsning på 4 M NaOH.
    1. La løsningen ruge over natten, ved romtemperatur (~ 22 ° C), under mild gripende forhold.
    2. Fjerne overskytende av PEG ved sentrifugering løsningen på 13800 x g i 15 min.
    3. Resuspend pellets med 500 μL deionisert vann.
    4. Inkuber PEG-modifisert AuNPs med 5 μmol N-(3-Dimethylaminopropyl)-n '-ethylcarbodiimide hydroklorid (EDC) og 7,5 μmol N-hydroxysulfosuccinimide natrium salt (sulfo-NHS) i 10 mM MES pH 6 buffer i 30 min på 37 ° C.
    5. Fjerne overflødig EDC og sulfo-NHS av sentrifugering løsningen på 13800 x g i 5 min.
    6. Resuspend pellet i 500 µL 10 mM MES pH 6 bufferen og legge 100 g·mL-1 antistoff. La løsningen ruge 2 h på 37 ° C.
    7. Fjerne overflødig antistoff ved sentrifugering løsningen på 13800 x g i 10 min to ganger og resuspend pellet i 500 μL 10 mM natrium fosfat pH 7.5 0,3 M NaCl buffer. La løsningen ruge i 30 min på 37 ° C.
    8. Fjern uspesifikke bundet antistoffer av sentrifugering løsningen på 13800 x g i 10 min to ganger og resuspend pellets i 500 μL 1% bovin serum albumin (BSA) i 10 mM MES pH 6-buffer. Inkuber prøvene på 4 ° C over natten.
    9. Vask overskytende av BSA sentrifugering løsningen på 13800 x g i 10 min to ganger, og resuspending pellet i 500 μL 10 mM MES pH 6-buffer.
    10. Fremgangsmåten 2.5.1 gjennom 2.5.9 for endring av 5 M AgNPs, 0,5 mg av IONPS og 0,5 mg av SiNPs med antistoff, justere antall EDC og sulfo-NHS tilsvarende.

3. loddrett flyt papirbaserte analyser:

  1. Forberede microarrays ved å sette inn en gradient konsentrasjon av protein G på nitrocellulose papiret membran med en robot skriver. Etter utskrift, kan du la den microarrays tørre over natten i romtemperatur (~ 22 ° C).
  2. Utføre loddrett flyt analysen med membran i en filterholderen. Flyte en 8 M løsning av IgG endret AuNPs med en ultra-sprøytepumpe med en hastighet på 1 mL·min−1. Gjenta dette trinnet med en løsning på 17 M IgG modifisert AgNPs, 0.1 mg·mL−1 IgG endret SiNPs og 0,1 mg·mL−1 IgG endret IONPs.
  3. La microarrays tørr ved romtemperatur (~ 22 ° C) i 30 min og skanne dem i en planskanner 4800 dpi oppløsning. Lagre bildene som 24-biters farge TIFF-filer.

4. referanse kommersiell glass-basert analyser:

  1. Inkuber to glass lysbilder i 120 min deteksjon av allergen komponenter med 4 forskjellige koagulasjon ved romtemperatur.
  2. Skyll microarrays med deionisert vann.
  3. Incubate ett lysbilde med et fluorescerende-konjugerte anti-IgE antistoff ved romtemperatur (~ 22 ° C) for 30 min. Incubate det andre lysbildet med anti-menneskelige IgE antistoff-endret AuNPs i 30 min ved romtemperatur.
  4. Skyll microarrays med deionisert vann.
  5. Måle fluorescens intensiteten av microarray som ble inkubert med fluorescerende anti-IgE-antistoffer med en laser skanning apparat. Digital microarray som ble inkubert med den anti-menneskelige IgE antistoff-modifisert AuNPs med et bord skanner for kolorimetrisk signalet vinningen.
  6. Etter digitalisering, ruge microarray med ekstrautstyr løsningen ved romtemperatur (~ 22° C) i 5 min.
  7. Skyll sensoren med deionisert vann og la dem tørke i 10 min ved romtemperatur (~ 22 ° C).
  8. Digitalisere microarray med en bord skanner 4800 dpi oppløsning for kolorimetrisk signalet vinningen. Lagre dem som 16-biters gråtone-TIFF-filer.

5. Microarray inkubasjon med løsningen:

  1. Pre-mix samme mengde løsning 1 og 2-løsning eller bland dem direkte på overflaten av sensoren, og sikre at området av interesse på microarray er dekket med blanding av løsning.
  2. La sensoren ruge ved romtemperatur med ekstrautstyr løsningen for opp til 5 min. lengre inkubasjon tid kan gi bedre følsomheten samt høyere støy/signal ratio, spesielt for papirbaserte microarrays.
  3. Vask microarray av submerging det i deionisert vann en gang for 5 s. la det tørke i romtemperatur.
    Merk: Tiden av tørking trinnet, avhengig av materialet i microarray. Et papirbasert microarray krever tørking trinnet ca 30 min. Et glass-basert microarray krever tørking trinnet ca 5-10 min.

6. imaging analyse:

  1. Analysere fluorescens intensiteten med Programvareverktøyet. Vurdere alle resultater som er lik eller større enn 0,3 Isac Normaliser enheter (ISU), i retning av bruk (DfU) av sensoren produsenten.
  2. Analysere kolorimetrisk intensiteten ved hjelp av en Programvareverktøyet. Invertere bildefilene, måle intensiteten av hver spot og beregne mener pixel intensiteten. Bruke verdiene i de tre eksemplarer stedene for å beregne siste signal verdien som en tre mener sted piksel intensiteten.

Representative Results

Når en analyse utføres, bruker nanoprobes som gjenkjenning agenter, fylles sensor oppdagelsen området ut med nanoprobes (figur 1en). Hvis antall nanoprobes er under grensen for en visuell gjenkjenning, oppdagelsen av analytt, i utgangspunktet anses negative. Bruker protokollen presenteres her (figur 1b), signalet fra nanoprobes er kraftig ved å innføre en dårlig definerte lag av Au (figur 1c).

En papirbasert immunanalyse designet for påvisning av Protein-G ble utført på vise effektiviteten av ekstrautstyr protokollen (figur 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs og IONPs ble endret med IgG-antistoffer og brukes og gjenkjenning. Papir microarrays ble utarbeidet som har en stigning på en rekke Protein G molekyler per sted.

Etter analysen var gjennomført, ble det observert at IgG modifisert AuNPs (IgG-AuNPs) kunne oppdage så lavt som 2 × 105 molekyler per sted (figur 2en), IgG modifisert AgNPs (IgG-AgNPs) kunne oppdage så lavt som 2 × 104 molekyler per sted (figur 2c), IgG modifisert IONPs (IgG-IONPs) kunne oppdage så lavt som 2 × 107 molekyler per spot (figur 2e) og IgG modifisert SiNPs (IgG-SiNPs) ikke var i stand til å gi et visuelt signal ( Figur 2g).

Rugende microarrays med ekstrautstyr løsningen, var det mulig å øke signalet av 100-fold over alle typer nanopartikler brukes. Når det gjelder SiNPs, ekstrautstyr løsningen gjorde det mulig å observere et signal der ingen visuelle signalet ble observert uten løsningen (figur 2b, 2d, 2f og 2 h).

Mulighet for bruk av metoden til en eksisterende kommersielle immunanalyse ble evaluert. Forbedringen var utført på et glass-basert allergen komponent microarray immunanalyse. 4 godkjent og preget serum prøver fra allergisk pasienter ble evaluert med microarray (prøver fantes a, b, c og d). Standard fluorometric oppdagelsen av denne analysen var i forhold til farging med anti-IgE merket AuNPs etterfulgt av forbedringen av signal (Figur 3). Før ekstrautstyr, ble ingen flekker oppdaget på microarrays der registreringen ble gjennomført med anti-IgE merket AuNPs. Etter ekstrautstyr, flere flekker var synlig av blotte øye og intensitet ble registrert av bilde digitalisering (Figur 3). Med fluorescens deteksjon, en rekke steder var oppdaget (Figur 3).

Figure 1
Figur 1 . Illustrasjon av trinnene gjennomgår en microspot fra analytt oppdagelsen forbedret signal. (en) to antistoff-endret nanoprobes etter oppdagelsen av en analytt immobilisert på en microspot, (b) inkubasjonstiden for microarray med ekstrautstyr protokollen og påfølgende frø-vekst av antistoff-endret nanoprobes og () c) microspot der størrelsen på nanoprobes økt etter rugende 5 min med ekstrautstyr løsningen. Dette tallet har vært dapted fra Dias et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Digitalisert bilde av microarrays for påvisning av protein G. Til venstre på hver microarray er det observert microspots før forbedring av oppdagelsen med (en) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs og (g) IgG-SiNPs. Til høyre for hver microarray er microspots etter forbedring av (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs og (h) IgG-SiNPs. Hver konsentrasjon av protein G ble avsatt på microarray i tre eksemplarer. En beregning av antall protein G ble gjort basert på konsentrasjonen av protein trykket i hvert microspot. Dette tallet er tilpasset fra Dias et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Sammenheng mellom fluorescerende intensitet og kolorimetrisk intensitet innhentet for analyser utført med kommersielle allergi diagnostiske analysen. Mener fluorescens intensitet (MFI) og mener kolorimetrisk intensitet (MCI) til oppdagelsen av allergener i utvalgene a, b, c og d. Insets er 10 forvandlet loggdataene i intervaller der en lineær sammenheng mellom begge metodene ble observert. Intensiteten av microspots observert for deteksjon basert på fluorophore-modifisert antistoffer (Fluorophore-Ab) er fluorescens utslipp. Lysstyrken på microspots observert for deteksjon basert på Ab-AuNPs analysen ble oppnådd etter digitalizing microarray og snu bildet med bildebehandlingsprogrammer. Microarrays er utformet som å ha vertikal triplicates med positiv kontroller for fluorescens gjenkjenning høyreekstreme nederst. De andre tre hjørnene brukes for programvareevaluering. Bildene ble analysert i 16-biters gråtone. Dette tallet er tilpasset fra Dias et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

R2 tidligere ekstrautstyr R2 etter ekstrautstyr
IgG-AuNPs 8.70E-01 7.80E-01
IgG-AgNPs 9.10E-01 9.60E-01
IgG-IONPs 9.17E-01 9.30E-01
IgG-SiNPs - 8.50E-01

Tabell 1. R2 verdier for gjenkjenning av protein G, før og etter ekstrautstyr, bruker forskjellige sett med nanopartikler. R2 verdiene ble innhentet etter samkjøre intensiteten av stedene med konsentrasjonen av analytt målt.

Discussion

Foreløpig signal teknikker for analyser med nanoprobe-basert oppdagelsen er enten enzym-baserte12, krever et annet sett med nanopartikler mot oppdagelsen nanoprobes21 eller ved flekker teknikker, er begrenset til Bruk av AuNPs eller AgNPs som gjenkjenning sonder. 22 her, en enkel, rask og enzym-fri metode er beskrevet for signal forsterkning av nanoprobe detection-baserte analyser. Med denne metoden, var det mulig å forbedre kolorimetrisk signalet fra 4 typer nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs og SiNPs.

Den observerte forsterkning faktoren for hvert nanoprobes var 100-fold, bortsett fra SiNPs der kvantifisering av ekstrautstyr faktor ikke var mulig grunn av pre ekstrautstyr signaler. Denne forbedringen faktoren antyder at effektiviteten av protokollen ligner alle typer nanoprobes. Videre, når ekstrautstyr protokollen ble utført på en papirstøtten der en fortynning rekke en lager AuNPs suspensjon ble skrevet ut, det ble observert en 10000-fold forsterkning faktor. Forrige til ekstrautstyr, de synlige flekkene med det laveste antallet AuNPs var der ca 10000 nanopartikler ble trykt, ekstrautstyr flekker skjuler 10 nanopartikler ble synlig. 20

Betingelsene etablert for ekstrautstyr protokollen her presentert har tillatt utnytter reduksjon av Au3 + Au0 for signalet å forbedre, mens bakgrunnsstøy til et minimum. Forbedringen kan utføres rett etter analysen utføres samt på microarrays som har vært lagret i opptil flere måneder etter analysen ble utført. Løsningen består av en 1:1 blanding av løsning 1 og løsning 2. Begge løsninger kan tidligere blandet eller direkte blandet når pipetted på microarray. Forskjellen mellom pre blande eller direkte blande påvirker bare holdbarheten av ekstrautstyr løsningen. Når ferdigblandet holdbarheten er 5-7 dager øker til 30-45 dager hvis ikke pre blandet.

Videre analyse av resultatene har vist at metoden ekstrautstyr ikke forstyrrer kvantitativ analyse av biosensor. En lineær sammenheng mellom intensiteten observert og konsentrasjonen av analytt ble opprettholdt (tabell 1). Dataene innhentet for 4 pre preget klinisk prøver med glass-basert allergen komponent microarray immunanalyse, med standard fluorescens gjenkjenning og kolorimetrisk oppdagelsen, viste en god samsvar mellom de to gjenkjenning metodene. Sammenligne mener fluorescens intensiteten (MFI) og den betyr kolorimetrisk intensiteten (MCI), en gjennomsnittlig R2 = 0,79 +/-0,08 ble innhentet når dataene er 10-logget på begge aksene. Dette eksperimentet viste at forsterkning metoden kan brukes til en kommersiell pakke hvis det bruker nanoprobes for gjenkjenning eller kan tilpasses for nanoprobe-basert oppdagelsen.

Forsterkning metoden effekten er avhengig av to viktige aspekter. Det er viktig å sikre at blanding av løsning 1 og 2 er homogen. Uten en homogen blanding, vil sensoren være i kontakt med deler av løsningen der løsning 1 eller 2 er dominerende i forhold til den andre. Det vil redusere effektiviteten av reduksjon av Au3 + Au0, således skadelige effektiviteten av forbedringen. Det er også viktig å ha hele området av interesse microarray i kontakt med løsningen under inkubasjonstiden.

For å oppnå ultrasensitive forbedring av et signal, vil lengre inkubasjon tid (ca 5 min) med ekstrautstyr løsningen være nødvendig. For å unngå utvikling av bakgrunnsstøy som kan forstyrre signalet vinningen, bør microarray overflaten være tidligere blokkert (f.eks BSA, PEG) å hindre rask uspesifikke deponering av Au0 og påfølgende dannelsen av gull lag.

En begrensning for metoden ekstrautstyr er iboende effekten av analysen. Analysen krever å ha negative og positive kontroller for å sikre at signalet styrking observert kan tilskrives sann-positive resultater. Hvis det er en uspesifikk samspillet i nanoprobes med målet, signaler kjøpt etter ekstrautstyr ikke vil være gyldig.

Andre teknikker er basert på enten hydrogenion samlingen eller flekker av nanopartikler med et materiale som gir forbedret signalet vinningen. Ved å fremme samling av antall nanopartikler på webområdet gjenkjenning, signalet vinningen kan enten visuelt eller UV-Vis målenheter. 5 teknikker disse signal stole på en to-trinns deteksjon system, første påvisning av analytt renter og andre trinnet der reporteren er nødvendig for å binde til den første oppdagelse konstruere. Slike strategier mangler universalitet på behovet for bestemte ekstrautstyr protokollen optimalisering for hver analysen.

Farging ekstrautstyr teknikker, for eksempel sølv flekker, mye som protokollen her presenteres, tillater direkte styrking av signalet oppdagelsen konstruksjoner. Men i motsetning til protokollen som vises her, har sølv flekker bare vært vist på AuNPs eller AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9

Anvendelsen av denne metoden kan trolig span alle analysen som bruker AuNPs, AgNPs, IONPs eller SiNPs som gjenkjenning. Videre arbeid blir utført for å studere anvendelsen av metoden sensorer som består av andre materialer.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Finansiering fra europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant avtalen nr. 615458, svensk forskningsråd og Pronova excellence center for protein teknologi (VINNOVA - svensk Direktorat for innovasjon systemer) er takknemlig anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroauric acid Sigma-Aldrich 254169 ALDRICH
Sodium citrate Sigma-Aldrich S4641 SIGMA-ALDRICH
Dimethylaminoborane  Sigma-Aldrich 476668 ALDRICH
Poly(acrylic acid, sodium salt)  Sigma-Aldrich 416037 ALDRICH
Silver nitrate Sigma-Aldrich 204390 ALDRICH
100 nm magnetic nanoparticles Ademtech 021111
50 nm silica nanoparticles Corposcular 140510-10
COOH-PEG-SH  RAPP Polymere 135000-4-32
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462 EMD MILLIPORE
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 SIGMA
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt  Sigma-Aldrich 56485 ALDRICH
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 95313 SIGMA-ALDRICH
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250 SIGMA
IgG antibody Abcam
Sodium phosphate  Sigma-Aldrich 342483 ALDRICH
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Bovine serum albumin VWR  422351S
Protein G Thermo Scientific 21193
Nitrocellulose paper membrane Whatman 10402096
Nanoplotter 2.1 robotic printer GeSIM
Filter holder Merck XX3001200
PhD2000 Ultrasyring pump Harvard
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II Cannon
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs  Thermofisher
Laser scanning LuxScan 10/K Capital Bio
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro Epson
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 Thermofisher 81-1011-01
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody  Thermofisher 81-1011-01
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4  Thermofisher

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
  2. Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
  3. Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
  4. Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
  5. Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
  6. Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
  7. Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
  8. Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
  9. Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
  10. Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
  11. Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
  12. de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
  13. Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
  14. Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
  15. Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
  16. Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  17. Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
  18. Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
  19. Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
  20. Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
  21. Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
  22. Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).

Tags

Kjemi problemet 133 Signal ekstrautstyr gull nanopartikler immunanalyse nanoprobe microarray papirbaserte analysen glass-basert analysen loddrett flyt analysen lateral flyt analyse
Rask Nanoprobe Signal forsterkning av <em>i Situ</em> gull hydrogenion syntese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, More

Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis. J. Vis. Exp. (133), e57297, doi:10.3791/57297 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter