Summary
Pseudomonas aeruginosa infectie veroorzaakt significante morbiditeit in kwetsbare hosts. De nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek van P. aeruginosa stam PA14, uitgeroepen tot PA14NR ingesteld, vergemakkelijkt de analyse van gene functionaliteit in tal van processen. Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van hoge kwaliteit kopieën van de PA14NR ingesteld mutant bibliotheek.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa is een fenotypische en genotypisch divers en flexibel gram-negatieve bacterie alomtegenwoordig in de menselijke omgevingen. P. aeruginosa vermag vormen van biofilms, ontwikkelen van resistentie tegen antibiotica, produceren van virulentiefactoren en snel evolueren in de loop van een chronische infectie. Dus P. aeruginosa kan leiden tot zowel acute en chronische, moeilijk te behandelen van infecties, resulterend in significante morbiditeit in bepaalde patiënt populaties. P. aeruginosa stam PA14 is een menselijke klinische isolaat met een geconserveerde genoom structuur die een verscheidenheid aan zoogdieren en nonvertebrate gastheren maken PA14 een aantrekkelijke stam voor de studie van deze ziekteverwekker infecteert. In 2006, werd een nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek met 5,459 mutanten overeenkomt met 4,596 voorspelde PA14 genen geproduceerd. Sindsdien heeft de distributie van de bibliotheek PA14 de onderzoeksgemeenschap om beter te begrijpen de functie van afzonderlijke genen en complexe trajecten van P. aeruginosatoegestaan. Handhaving van de integriteit van de bibliotheek door middel van het replicatieproces vereist goede behandeling en precieze technieken. Te dien einde stelt dit manuscript protocollen die beschrijven in detail de stappen bij bibliotheek replicatie, de controle van de kwaliteit van de bibliotheek en correcte opslag van individuele mutanten betrokken.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa is een fenotypische en genotypisch divers en flexibel gram-negatieve bacterie aanwezig in de bodem, water, en de meeste menselijke omgevingen, evenals huid microflora. Vergeleken bij veel bacteriesoorten, heeft P. aeruginosa een relatief grote genoom van 5.5-7 Mbp met hoge G + C inhoud (65-67%). Bovendien een aanzienlijk deel van de genen betrokken zijn bij de metabole aanpassingsvermogen en zijn onderdeel van regulerende netwerken, grote flexibiliteit in reactie op de milieudruk1. P. aeruginosa geeft uiting aan een overvloed van virulentiefactoren, neiging naar formulier biofilms vertoont, bezit het vermogen om te coördineren van de reacties via meerdere quorum sensing trajecten en bevat een opmerkelijke capaciteit te ontwikkelen resistentie tegen antibiotica en tolerantie2,3,4,5,6,7,8. Deze kenmerken stellen belangrijke uitdagingen voor de behandeling van infecties veroorzaakt door P. aeruginosa.
Chronische P. aeruginosa infecties kunnen optreden in talrijke ziekte staten. Cystic fibrosis (CF), een genetische ziekte die wordt veroorzaakt door mutatie van het gen Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) , resulteert in inspissated, besmette afscheidingen binnen de luchtwegen, progressieve Bronchiëctasie en uiteindelijk dood van respiratoire insufficiëntie9. Door volwassenheid, zijn de meerderheid van de patiënten met CF chronisch geïnfecteerd met P. aeruginosa, dat een sleutelrol in de morbiditeit en mortaliteit die zijn gekoppeld aan deze ziekte10 speelt. Bovendien hebben patiënten met ernstige branden verwondingen11, tracheostomies12, gewrichtsprothesen13of inwonende katheters14 risico op P. aeruginosa infectie gerelateerd aan van de bacteriën vermogen om vorm biofilms en ontsnappen host15van de inflammatoire reacties. Verder, kolonisatie zonder concurrentie treedt op nadat een bevolking meerdere antibiotica resistentie of tolerant is geselecteerd door middel van breedspectrum, sequentiële antimicrobiële behandeling12,16,17 , 18. beter begrijpen van de pathogenese van P. aeruginosa zal belangrijke gevolgen hebben voor talloze ziekte staten.
Verschillende P. aeruginosa klinische isolaten, met inbegrip van stammen PAO1, PA103, PA14 en PAK, zijn uitvoerig bestudeerd om te onderzoeken van de verschillende functies van P. aeruginosa pathogenese. Stam PA14 is een klinische isolaat die behoort tot een van de meest voorkomende klonale groepen wereldwijd19,20 en heeft niet uitgebreid in het laboratorium is gepasseerd. PA14is zeer virulente in gewervelde modellen van infectie, met een opmerkelijke endotoxine profile21, pili structuur22, pathogeniteit eilanden23, III secretie typesysteem (TTSS), cytotoxiciteit naar zoogdieren cellen24 en profielen van antibiotische weerstand en volharding25. Bovendien, PA14 is ook zeer virulente in talrijke gastheer-pathogeen modelsystemen, met inbegrip van plant blad infiltratie modellen26,27,Caenorhabditis elegans infectie modellen28, 29, insect modellen30,31, evenals muis longontsteking modellen32,,33 en huid branden modellen34.
Genoom-brede mutant bibliotheken zijn verzamelingen van isogene mutanten in niet-essentiële genen die zeer krachtige tools om te begrijpen van de biologie van een organisme door analyse van de genfunctie toe te staan op een genomic schaal vormen. Twee in de buurt van-saturation transposon invoeging mutant bibliotheken gebouwd in P. aeruginosa zijn momenteel beschikbaar voor distributie. De sites van de invoeging van de transposons zijn vastgesteld voor beide bibliotheken. Deze zogenaamde nonredundant bibliotheken genoom-brede studie van bacteriestammen vergemakkelijken door het aanzienlijk verlagen van de tijd en kosten genfunctieonderzoek screening willekeurige transposon mutanten. De P. aeruginosa PAO1 transposon mutant bibliotheek, gebouwd in de MPAO1 isoleren van de stam PAO1 met behulp van transposons ISphoA/ hah en ISlacZ/ hah35, is samengesteld door het Manoil laboratorium, Universiteit van Washington. De bibliotheek bestaat uit een reeks-geverifieerd verzameling 9,437 transposon mutanten die biedt brede genoom dekking en omvat twee mutanten voor de meeste genen36. Informatie over de PAO1 van de P. aeruginosa transposon mutant library is beschikbaar op de openbare, internet toegankelijke Manoil lab-website op http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. De P. aeruginosa stam PA14 nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek (PA14NR ingesteld) gebouwd in stam PA14 met behulp van de MAR2xT7 en Tn transposonsphoA37 wordt momenteel gedistribueerd door de afdeling kindergeneeskunde in het Massachusetts General Hospital. De PA14NR Set bestaat uit een verzameling van meer dan 5.800 mutanten met één transposon invoegingen in niet-essentiële genen37. Details over de bouw van de PA14NR Set zijn beschreven in de openbare, toegankelijke internet site http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, waarin ook een scala aan online zoekprogramma's om het gebruik van de PA14NR Instellen.
De oorspronkelijke PA14NR Set bestond uit 5,459 mutanten, geselecteerd uit een uitgebreide bibliotheek van ongeveer 34.000 willekeurige transposon insertiemutanten, die overeenkomen met 4,596 voorspelde PA14 genen 77% van alle voorspelde PA14 genen37. Sinds de bouw van de bibliotheek in 2006 nieuwe mutanten werden toegevoegd, en momenteel de PA14NR Set omvat meer dan 5.800 mutanten38 die vertegenwoordigen ongeveer 4.600 PA14 genen. De meerderheid van de PA14 transposon mutanten werden gegenereerd in het wild type achtergrond37. Details over elk lid van de mutant bibliotheek, met inbegrip van genetische achtergrond, zijn beschikbaar via de online database zoeken, of door het downloaden van de Nonredundant bibliotheek spreadsheet, beide functies beschikbaar op de website van PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). De meerderheid van mutanten werden gemaakt met behulp van de MAR2xT7 (MrT7) transposon, met een kleine set gemaakt met behulp van de TnPhoA (phoA) transposon37. Elke transposon heeft een antibiotica-resistentie-cassette, waarmee een mutant selectie met gentamicine (MrT7) of kanamycine (phoA). De PA14NR-set van mutanten in drieënzestig 96-wells-platen is opgeslagen en omvat twee extra controle van de 96-wells-platen, die bestaan uit wild type PA14 geënt en niet-geënte wells tussenliggende in een vooraf ingesteld patroon. De indeling van de 96-wells-plaat gecombineerd met de online zoekprogramma's sterk vergemakkelijkt de aangepaste ontwikkeling van screening tests waarmee gebruikers gemakkelijk om genen te identificeren mutant fenotypen is gekoppeld. De online zoekprogramma's vergemakkelijken ook de zoek- en selectie van aanvullende relevante mutanten vereist voor verdere studies.
De PA14 en PAO1 transposon mutant bibliotheken zijn zeer belangrijke wereldwijde resources voor de wetenschappelijke gemeenschap, en zij elkaar aanvullen bij het valideren van de functie van onbekende genen en trajecten van deze bacteriële pathogenen. Toevallig, sinds de bouw van de PAO1 en PA14 transposon mutatie Bibliotheken, heeft full-DNA sequentiebepaling genoomanalyse van vele P. aeruginosa isolaten aangetoond dat PAO1 en PA14 tot verschillende belangrijke subclades van de P. aeruginosa behoren fylogenie7,39,40,41. Omdat klinisch P. aeruginosa isolaten vindt u verspreid over de fylogenie, het feit dat PAO1 en PA14 tot verschillende P. aeruginosa behoren subgroepen verhoogt de waarde van de twee transposon mutatie bibliotheken voor vergelijkende studies.
Publicaties met een beschrijving van de bouw en screening van bacteriële mutant Bibliotheken, waaronder P. aeruginosa bibliotheken35,zijn37,42, beschikbaar in de literatuur. Echter tot de beste van onze kennis, geen gepubliceerde protocollen beschrijven gedetailleerde procedures en technieken die worden gebruikt voor replicatie, onderhoud en validatie van bacteriële mutant bibliotheken zijn beschikbaar.
De methodologie uiteengezet in deze publicatie beschrijft een set van drie protocollen die het gebruik vergemakkelijken en onderhoud van de PA14NR Set. Het eerste protocol beschrijving van replicatie van de bibliotheek zoals aanbevolen voor de ontvangers van de PA14NR Set. Het tweede protocol bevat richtsnoeren voor de strepen, groeiende en opslaan van individuele mutanten geïdentificeerd met behulp van de PA14NR Set. Het derde protocol beschrijft kwaliteitscontrole technieken, met inbegrip van PCR versterking van fragmenten van transposon mutanten en de daaropvolgende sequencing mutant identiteit te bevestigen. Deze set van protocollen kan ook worden aangepast voor de replicatie en het onderhoud van andere bacteriële mutant bibliotheken of collecties. De replicatie van bacteriële mutant bibliotheken of collecties is zeer aangeraden voor het behoud van de integriteit van de "master copy" (originele exemplaar ontvangen). Replicatie van meerdere kopieën van de PA14NR Set voor routinematige laboratoriumgebruik minimaliseert de kans op besmetting van de interwell van het originele exemplaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Gebruik standaard BSL-2 veiligheidsmaatregelen bij het verwerken van P. aeruginosa, een menselijke pathogenen. Als u een immuungecompromitteerde individu bent of een medische aandoening die uw gevoeligheid voor bacteriële infectie verhoogt, bijzondere voorzichtigheid nemen bij het werken met P. aeruginosa. Raadpleeg de bioveiligheid-kantoor in uw instelling en toestemming van uw arts voordat u gaat werken met de de PA14 NR instellen of de mutant bibliotheken van bacteriële pathogenen.
Figuur 1: overzicht van Protocol I: replicatie van de PA14NR ingesteld. Dag 1: Bevroren mutant culturen van "hoofdkopie" van PA14NR ingesteld in LB agarmedia repliceren en groeien van mutanten 's nachts bij 37 ° C. Dag 2: Mutant groei van LB agarmedia overbrengen naar diepe goed blokken met vloeibare de pond-Bouillon, 's nachts groeien bij 37 ° C met schudden bij 950 rpm. Dag 3: Meng overnachting LB culturen met glycerol, vervolgens overbrengen naar de bestemming van de 96-wells-platen voor langdurige opslag. Plaats 96-wells-platen plat in-80 ° C vriezer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: aanbevolen setup. Steriliteit en gestroomlijnde werkprocessen moeten worden gehandhaafd door middel van passende voorzorgsmaatregelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
1. protocol I: replicatie van de PA14NR instellen
Opmerking: Replicatie van de bibliotheek kan worden bereikt door het verdelen van de PA14NR Set in vier subgroepen van zestien platen elke dat kunnen worden verwerkt in vier opeenvolgende weken. Generatie van 1 tot en met 6 kopieën houdt zich aan de per werkstroom genoemd in tabel 1, terwijl de generatie van meer dan 6 kopieën volgt de per werkstroom die worden beschreven in tabel 2. Voor het genereren van 12 exemplaren van de PA14NR Set, enten van de dezelfde subset van de PA14NR in vloeibare LB-media op dag 2 en nogmaals op dag 3 (uit de dezelfde set van agar platen gerepliceerd op dag 1), en overdracht overnachting mutant culturen in kopie platen op dag 3 en dag 4 respectievelijk.
| Dag 0 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 |
| Prep dag | Groei van PA14NR ingesteld op LB agarmedia mutanten | Groei van PA14NR ingesteld mutanten in vloeibare LB-media | Overdracht van mutant culturen PA14NR ingesteld op bestemming platen |
Tabel 1: planning voor replicatie van 1-6 exemplaren van de PA14NR Set. Replicatie van een klein aantal exemplaren kan voldoen aan een per werkstroom.
| Dag 0 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 |
| Prep dag | Groei van PA14NR ingesteld op LB agar mutanten | Groeien van PA14NR ingesteld mutanten in vloeibare LB-media | Overdracht van dag 3 mutant culturen voor het genereren van de 1e set 6 kopieën van PA14NR Set | Overdracht van dag 4 mutant culturen voor het genereren van de 2e set 6 kopieën van PA14NR Set |
| Groei van PA14NR ingesteld mutanten in vloeibare LB-media |
Tabel 2: schema voor replicatie van maximaal 12 kopieën van de PA14NR Set. Replicatie van een groter aantal kopieën vergt gelaagdheid binnen een per werkstroom.
- Dag 1: Groei van PA14NR ingesteld Master kopie op LB agar platen
- Draag handschoenen, laboratoriumjas en masker om de PA14NR Set.
- Schakel bankje en Navegen met 70% ethanol.
- Bereiden van LB agar media43 en steriliseren in autoclaaf voor 25 min. Cool media tot 55 ° C in water bad en toevoegen van beide gentamicine 15 µg/mL, voor mutanten met MAR2xT7 transposon invoegingen of 200 µg/mL kanamycine, for mutanten met TnphoA invoegingen.
- Giet gesmolten LB agar in rechthoekige platen met behulp van ongeveer 60 mL media per plaat. Droge platen in een steriele kap gedurende ongeveer 1 uur vóór gebruik. Zorg ervoor dat er geen condensatie van water op het oppervlak van de agar. Opslaan platen bij 4 ° C, indien nodig.
- Steriele velden maken met een bunsenbrander ethanol-veegde Bank bovenop en opzetten van containers met passende oplossingen voor replicator pin sterilisatie (zie stap 1.1.9). Gebruik open plastic bakjes (5,25" L x 4,25" W x 1,75 "H grootte ongeveer) voor replicator pin sterilisatie. Autoclaaf plastic bakjes vóór gebruik.
Opmerking: De hitte van de vlam Bunsenbrander maakt een convectie huidige, die verwarmt de ruimte boven de vlam en liften van alle deeltjes in de lucht omhoog en weg van de koelere lucht daaronder het werkgebied steriel te houden. - Verwijderen van een maximum van vier PA14NR Set master platen uit de diepvries-80 ° C (om te voorkomen dat geen onnodige ontdooien), en leg ze op droog ijs in 4 L ijs pan.
- Nemen de 96-Wells master plaat die moet worden gerepliceerd van droogijs en plaats deze op de Bank om korte ontdooien, die alleen de tijd zal nemen die nodig zijn voor de sterilisatie van de replicator pinnen (ongeveer 3-4 min) (zie stap 1.1.8). Markeer de positie van de coördinaat van de A1 op de agarplaat voorafgaand aan stempelen. Uitlijnen master plaat en agarplaat met de A1-coördinaat voor beide platen in de hogere linkerhoek.
- Steriliseren de replicator "pinnen" door het volgen van de stappen die hieronder worden beschreven. Tik op replicator iets na elke stap om het overtollige vocht te verwijderen.
- Onderdompelen pinnen in 250 mL 0.3-0.5% natriumhypochloriet (10% huishoudelijk bleekwater) gedurende 30 seconden. Minimaliseer contact met natriumhypochloriet-oplossing, omdat het leiden kan tot schade van de pinnen. Onderdompelen pinnen in 250 mL steriele ddH2O of steriel ultrazuiver water voor 10 seconden, dan in 250 mL 70% ethanol voor 30 seconden, dan in 250 mL 95% ethanol gedurende 2 minuten.
- Vlam steriliseren replicator pinnen door replicator loodrecht te houden aan de vlam Bunsenbrander, langzaam naderen vlam totdat ethanol ontbrandt en vervolgens onmiddellijk te trekken van de vlam. Vlam zal uitdoven eenmaal alle ethanol brandwonden af. Houd een deksel of een soortgelijk container sluiten door te verstikken brandende ethanol, indien nodig.
Opmerking: Wees extreem voorzichtig bij het werken met ethanol in de buurt van een vlam. Houd replicator niet direct boven het vuur. - Cool pinnen door vastzetten op een ongebruikte steriele rechthoekig bord met LB agarmedia voor 30 seconden.
- Kort warm aluminium zegel van meester PA14NR stel plaat met uw hand vóór het peeling uit. Doe dit terwijl de koeling replicator pinnen. Aluminium zegel zorgvuldig om te voorkomen dat het zegel retoucheren van de plaat te verwijderen. Gebruik pincet schil af eventuele restanten van aluminium zegel.
- Replicator pinnen invoegen master plaat, zachtjes duwen en swingende replicator in alle vier de richtingen om ervoor te zorgen dat de pinnen maken contact met bevroren bacteriele kweken in elk van de 96-wells. Extra aandacht besteden aan putten gelegen in de buitenste rand van de plaat door duwen replicator pinnen tegen bevroren culturen in de putten, gelegen aan de rand van de plaat.
- Voorzichtig plaats replicator pinnen op het oppervlak van de agarplaat. Replicator verplaatsen in een lichte, cirkelvormige beweging naar formulier mini-gazons van ongeveer 4-5 mm voor elke gemuteerde stam. De mogelijkheid dat de mini-gazons overlappen kunnen, voorkom kruisbesmetting te voorkomen.
- Zegel master plaat PA14NR instellen met een nieuwe steriele aluminium zegel. Raak niet de zelfklevende kant van aluminium zegel op elk gewenst moment om verontreiniging te voorkomen. Zorg ervoor dat elk putje en de randen van de plaat zijn volledig verzegeld met behulp van een plaat-roller. Terugkeer 96-wells-plaat om droog ijs.
- Herhaal de procedure voor elke basispagina plaat.
- Veeg beneden alle werkzaamheden oppervlakken met 70% ethanol na het hanteren van de PA14NR Set.
- Overdracht agar platen gerepliceerd naar 37 ° C incubator en na een nacht bebroeden.
- Dag 2: Groei van het exemplaar van de PA14NR Set Master in vloeibare de pond-Bouillon
- Bereiden LB vloeibare Bouillon43 met beide gentamicine 15 µg/mL, voor mutanten met MAR2xT7 transposon invoegingen of 200 µg/mL kanamycine, for mutanten met TnphoA invoegingen.
- Schakel laminaire flow kap van geen onnodige apparatuur en kap blower inschakelen voor een minimum van 10 minuten voordat u begint met werk. Veeg beneden kap oppervlakken en andere items die zijn geplaatst in de kap met 70% ethanol.
- Vul 2 mL diep-well blokken met 525 µL van vloeibare de pond-Bouillon met passende antibiotica laminaire flow Hood met behulp van een precisiepipet 12-kanaals elektronische van 50-1200 µL. Breng media gevulde diep-well blokken naar ethanol-veegde Bank top. Hergebruik tips zolang steriele omstandigheden worden gehandhaafd.
- Draag handschoenen, laboratoriumjas en masker om PA14NR instellen.
- Schakel bankje en Navegen met 70% ethanol.
- Agar platen met overnachting geteelde gemuteerde stammen tot bank bovenkant brengen.
- Steriele velden maken met een bunsenbrander ethanol-veegde Bank bovenop en opzetten van containers met passende oplossingen voor replicator pin sterilisatie (zie volgende stap).
- Steriliseren de replicator "pinnen" na de stappen die hieronder worden beschreven. Tik op replicator iets na elke onderdompeling te verwijderen van de overtollige vloeistof.
- Onderdompelen pinnen in 250 mL 0.3-0.5% natriumhypochloriet gedurende 30 seconden. Minimaliseer replicator pin contact met natriumhypochloriet-oplossing, omdat het leiden kan tot schade van de pinnen. Dan, dompel pinnen in 250 mL steriele ddH2O of ultrazuiver water gedurende 10 seconden, vervolgens in in 250 mL 70% ethanol voor 30 seconden, vervolgens in 250 mL 95% ethanol gedurende 2 minuten.
- Vlam steriliseren replicator pinnen en cool pinnen in pinning in ongebruikte rechthoekige plaat met LB agarmedia voor 30 seconden.
Opmerking: Gebruik uiterste voorzichtigheid bij het werken met ethanol in de buurt van een vlam (zie 1.1.8).
- Voorzichtig plaats replicator pinnen op agar bord met mutant groei en controleer of pinnen in contact met alle 96 mutanten op agarplaat zijn en vervolgens pinnen onderdompelen in diepe putten met vloeibare de pond-Bouillon. Raak de zijkanten van de putjes met de pinnen.
- Zegel van het diep goed blok met een steriele afdichting ademend membraan. Een plaat roller gebruiken om ervoor te zorgen dat elk individu goed is deugdelijk afgesloten.
- Herhaal de procedure voor elke agarplaat.
- Veeg beneden alle werkzaamheden oppervlakken met 70% ethanol na het hanteren van de PA14NR Set.
- Groeien geënte vloeibare culturen voor 15-16 h bij 37° C op 950 rpm met behulp van een shaker van hoge snelheid, indien beschikbaar.
Opmerking: Als een hoge snelheid shaker niet beschikbaar is, incubatie van diep goed blokken in shaker op 250-300 rpm is haalbaar. Er is echter een grotere kans op kleine kolonie varianten (SCVs)25 opkomende lage oxygenatie omstandigheden. Daarom is het zeer aan te raden om te houden van incubatie tijden onder 15-16 h bij het kweken van culturen in diep goed blokken bij lagere snelheden van de shaker. Ongewenste verspreiding van SCVs in mutant putten kan mutant fenotypes veranderen bij het gebruik van de bibliotheek voor het uitvoeren van genetische schermen.
Bepaalde putten in de PA14NR Set langzaam groeiende/niet-groeiende mutanten, klonen, ontbrekende of niet-geënte media bevatten. De locatie van deze putten geconstateerd en kan worden gevonden in het bestand van de aanvullende PA14NR Set Wells informatie opgenomen met deze publicatie.
- Dag 3: Overdracht van PA14NR ingesteld overnachting culturen in bestemming platen
- Schakel laminaire flow hood en kap blower inschakelen voor een minimum van 10 minuten voordat u begint met werk. Veeg beneden kap oppervlakken en andere items die zijn geplaatst in de kap met 70% ethanol.
- Zelfklevende waterdichte etiketten afdrukken (Zie aanvullende PA14NR Set etiketten bestand voor sjabloon). Verwijderen 96-wells-platen van plastic wikkel binnen een laminaire flow-kap. Peel-off plaat label en plaats deze langs de rand van de plaat zich het dichtst bij A1 aan H1 putjes van de plaat van de bestemming. Iets Open de klep van de bestemming-plaat en plaats het label op de onderste rand als label wilt weergeven wanneer de plaat is bedekt met deksel.
- 3,5 L 60% glycerol (v/v) voor te bereiden en 20 min in autoclaaf steriliseren.
- Draag handschoenen, laboratoriumjas en masker om de PA14NR Set. Diep goed blokken verwijderen voor hoge snelheid shaker of regelmatige shaker.
- Deep-well blokken overbrengen in steriele laminar flow hood en verwijder voorzichtig ademend afdichting membraan. Vervangen door aluminium zegel. Spin-down de diep-well blokken bij zeer lage snelheid voor het verzamelen van condensatie (30 seconden bij 50-150 x g, dan vertragen quicky door centrifuge rem op).
- Deep-well blokken ook terug overzetten naar steriele kap en met behulp van een precisiepipet 12-kanaals elektronische van 50-1200 µL en steriele gefilterde tips 525 µL van glycerol/LB vloeibare Bouillon mix (gelijke delen LB vloeibare Bouillon en 60% glycerol oplossing) toe te voegen aan elk putje. Meng door zachtjes pipetteren 300 µL omhoog en omlaag 3 keer met elektronische pipet. Touch tips om kant van goed voor tips om te voorkomen dat druipende uitwerpen. Uitwerpen tips en ga verder met de volgende rij totdat gedaan met hele diep goed blok.
- Met behulp van de 12-kanaals elektronische repetitieve pipet en gefilterde tips, om te voorkomen dat interwell besmetting tijdens aliquoting, 900 µL van mutant cultuur optrekken en afzien van 150 µL in elke bestemming van de 96-wells-platen voor het genereren van 6 kopieën van de bibliotheek-plaat. Te voorkomen dat de DRIP's door het aanraken van de muur van de putjes met tips voordat u begint uitwisselen van de cultuur in bestemming platen. Als geen herhaling pipet beschikbaar is, kunt een meerkanaalspipet afzien van 150 µL in elk van de zes 96-wells-platen, met behulp van de techniek hierboven beschreven om te voorkomen dat druipen.
- Gebruik van steriele Aluminium afdichtingen om dekking van de platen en een plaat roller volledig zegel plaatranden en alle putjes. Zorg ervoor dat niet ter dekking van de label-id met de aluminium-zegel. Schud de platen, niet als cultuur op de zijden van de putten of op aluminium zegel spatten kan.
- Verwijder verzegelde platen uit hood en plaats platen op een vlakke, zelfs oppervlakte in de vriezer-80 ° C.
- Veeg beneden alle werkzaamheden oppervlakken met 70% ethanol na het hanteren van de bibliotheek.
- Het uitvoeren van kwaliteitscontroles na bibliotheek replicatie en na het gebruik van de bibliotheek voor het uitvoeren van genetische schermen (Zie Protocol III).
2. protocol II: Hantering en opslag van individuele mutanten uit de PA14NR-Set
-
Dag 1: Streak mutant van belang
- Identificeren van de locatie van de mutant van belang via de link PA14NR Set http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS of met behulp van het Nonredundant Library.xls-bestand gedownload van de link http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/downloads.cgi). Maak een notitie van het antibioticum moest elke bijzondere mutant (gentamicine of kanamycine) selecteren.
- Voorbereiden van LB agarmedia, steriliseren in autoclaaf voor 20-25 min en afkoelen tot 55 ° C in waterbad. 15 µg/mL gentamicine toevoegen voor mutanten met MAR2xT7 transposon invoegingen, en 200 µg/mL kanamycine voor mutanten met TnphoA transposon invoegingen. Giet LB agarmedia op platen (ronde of rechthoekige platen zijn voldoende). Droge platen in steriele kap voor ongeveer 30 minuten tot 1 uur vóór gebruik.
- Autoclaaf alle plasticware en niet-steriele leveringen vóór gebruik.
- Draag handschoenen, laboratoriumjas en masker om de PA14NR Set. Schakel bankje en Navegen met 70% ethanol voordat u gaat werken met de PA14NR Set.
- Maak een steriel veld met een bunsenbrander.
- Verwijder PA14NR Set 96-wells-plaat met mutant van belang uit de diepvries-80 ° C en plaats het op droog ijs, nemen droog ijs container naar de Bank, en kort plaats 96-wells-plaat bovenop bankje om lichte ontdooien (ongeveer 1-2 min).
Opmerking: Een register bijhouden van alle PA14NR instellen 96-wells-platen gebruikte naar streak individuele mutanten, zoals meer toegang tot de bibliotheek platen is gecorreleerd met een groter risico voor interwell besmetting. - Warme aluminium zegel met hand vóór het peeling uit, voorzichtig om te voorkomen dat het zegel retoucheren van de plaat. Gebruik pincet schil af eventuele restanten van aluminium zegel.
- Zoek de mutant van belang op de 96-wells-plaat. Steriele houten stok of steriele pipette uiteinde gebruiken om te kiezen van een kleine hoeveelheid bevroren cultuur uit het individu putje met de mutant van belang.
- Streak bevroren cultuur op agarplaat voor één mutant koloniën als volgt: zachtjes verspreid de bacteriën over een deel van de plaat maken streak 1, met behulp van een verse, steriele houten stok of pipette uiteinde, sleep via streak 1 en de bacteriën verspreiden over een tweede deel van de plaat, streep 2 maken. Met behulp van een derde steriele houten stok of pipette uiteinde, sleep via streep 2 en de bacteriën verspreid over het laatste deel van de plaat, streep 3 maken.
- Zegel bron plaat met een nieuwe steriele aluminium zegel. Raak niet met de klevende kant van aluminium zegel op elk gewenst moment om verontreiniging te voorkomen. Zorg ervoor dat elk goed en de randen van de plaat zijn volledig verzegeld met behulp van een plaat-roller. Terugkeer 96-wells-plaat naar droogijs en vervolgens de vriezer-80 ° C.
- Na een agarplaat in 37 ° C incubator nacht bebroeden.
- Veeg beneden alle werkzaamheden oppervlakken met 70% ethanol na het hanteren van de bibliotheek.
-
Dag 2: Groei van mutant belangstelling voor vloeibare de pond-Bouillon
- Vloeibare de pond-Bouillon met 15 µg/mL gentamicine of 200 µg/mL kanamycine, volgens transposon plaatsingskosten voor te bereiden.
- Draag handschoenen, laboratoriumjas en masker om P. aeruginosa.
- Schakel bankje en Navegen met 70% ethanol. Maak een steriel veld met een bunsenbrander.
- Breng 3-5 mL van de pond-Bouillon met passende antibioticum in steriele cultuur buis met dop.
- Met behulp van een steriele applicator of een steriele Pipetteer tip, kies een één kolonie van gemuteerde stam en het enten in LB-media.
- Incubeer de vloeibare culturen LB bij 37 ° C in een shaker bij 225-250 TPM 's nachts.
- Veeg beneden alle werkzaamheden oppervlakken met 70% ethanol na het hanteren van P. aeruginosa.
-
Dag 3: Winkel mutant van belang in de vriezer-80 ° C
- Label cryovial met mutant naam, antibiotica toegevoegd aan de pond-Bouillon en datum van opslag.
- Bereiden van 500 mL 50% Glycerol (v/v) en steriliseren in autoclaaf.
- Draag handschoenen, laboratoriumjas en masker om P. aeruginosa.
- Duidelijke Bank en/of laminaire overstroming zonnekap en Navegen met 70% ethanol.
- Verwijder buis met mutant cultuur van shaker.
- Een kleine container met droog ijs bereiden.
- Gebruik van een laminaire flow-kap of maak een steriel veld met Bunsenbrander bovenop ethanol-veegde Bank.
- Gelijke hoeveelheden van bacteriecultuur en 50% glycerol toevoegen aan het label cryovial met behulp van steriele condities, en voorzichtig mengen met Pipet (eindvolume 1-2 mL/ampul afhankelijk van de grootte van de cryovials gebruikt). Plaats cryovial op droog ijs aan de kipfilet.
- Plaats cryovial in gelabelde vak in de vriezer-80 ° C.
- Veeg beneden alle werkzaamheden oppervlakken met 70% ethanol na behandeling P. aeruginosa.
3. protocol III: controle van de kwaliteit van PA14NR Set
- Selecteer willekeurige set van mutanten in nieuwe gerepliceerde platen te detecteren van mogelijke interwell besmetting (testen van 30-40 mutanten wordt aanbevolen).
Opmerking: In gevallen waar het nodig is voor de identiteit bevestigen van een mutant die wordt gebruikt voor de karakterisering van een specifiek gen, is het raadzaam voor het uitvoeren van PCR amplifications met behulp van gen-specifieke primers ontworpen voor de bekende sequentie van het gen waarin de transposon inbrengen. Hoewel meer uitdagend, de voordelen van het gebruik van willekeurige omvatten PCR inleidingen in plaats van gen-specifieke PCR inleidingen als amplyfing DNA van transposon mutanten fragmenten gebruiksgemak grootschalige mutant bevestiging en de mogelijkheid om de aanwezigheid van potentieel verontreinigingen. Voor kwaliteitscontrole doeleinden is het niet nodig hoge kwaliteit PCR het rangschikken om gegevens te verkrijgen voor alle willekeurig slected mutanten, zo lang als een voldoende aantal mutanten worden gescreend om te kunnen beoordelen foutenpercentage. - Volg "Protocol II" Strijk en gemuteerde stammen groeien.
- Autoclaaf alle plasticware en niet-steriele leveringen vóór gebruik.
- Isoleer genomic DNA door voorkeursmethode. Bij de analyse beschreven in dit werk, werd een genomic DNA isolatie kit gebruikt fabrikant protocollen. Meerdere gemuteerde stammen kunnen gelijktijdig worden geanalyseerd.
- Genomic DNA-concentratie met behulp van een microvolume spectrofotometer meten. Genomic DNA-concentratie tot ongeveer 100 ng/µL aanpassen.
- Genomic DNA gebruiken als sjabloon "PCR1 reactie" uitvoeren, zoals beschreven in stap 1 van de tabel 3, het genereren van Arb1 PCR fragmenten (Figuur 3). In tabel 4 staan de inleidingen voor deze stap.
- Voeg 0,5 µL van 10 x het laden van de buffer met 5 µL van PCR1 reactie, laden in een 1,5-2% agarose gel en draaien van de gel op 80-150 V.
Opmerking: De lengte van een specifiek fragment of een bepaald fragment-bereik is niet te verwachten, en meer dan één band aanwezig kan zijn, zoals de willekeurige primer aan meerdere locaties binden kan. - DNA uit PCR1 reactie als sjabloon gebruiken "PCR2 reactie" uitvoeren, zoals beschreven in stap 2 van de tabel 3, het genereren van Arb2 PCR fragmenten (Figuur 3). In tabel 4 staan de inleidingen voor deze stap.
- Voeg 0,5 µL van 10 x het laden van de buffer met 5 µL van PCR2 reactie, in een 1,5-2% agarose gel laden en uitvoeren van de gel op 80-150 V.
Opmerking: De lengte van een specifiek fragment of een bepaald fragment-bereik is niet te verwachten, en meer dan één band aanwezig kan zijn, zoals de willekeurige primer aan meerdere locaties binden kan. - PCR2 reactie samen met passende transposon-specifieke primer voor het rangschikken verzendt.
- Analize rangschikkend resultaten byBLASTing hen tegen het volledige genoom van de PA14 via de BLAST-link op de website van de bibliotheek van de PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) of door direct stralen ze tegen de specifieke germinale genetische identiteit van verstrekt de mutant van belang.
Opmerking: Informatie over geselecteerde mutanten kan worden gevonden door te zoeken op de website van PA14NR instellen (zoek http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS of download de Nonredundant Library.xls bestand van de link http:/ / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).
Figuur 3: PCR versterking en sequentiebepaling van transposon insertiemutanten. Schematische weergave van de stappen betrokken bij PCR versterking en het rangschikken voor mutant identiteit verifiëren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| PCR reactie Set-up | |
| Stap 1 | Stap 2 |
| PCR1 reactie: | PCR2 reactie: |
| 23.25 µL water (moleculaire biologie grade) | 19.15 µL water (moleculaire biologie Grade) |
| 3µL 10 x polymerase Taq Buffer | 5 µL 10 x polymerase Taq Buffer |
| 0.5µL polymerase Taq | 0.6 µL polymerase Taq |
| 0.625 µL 20 µM primer Arb1D (tabel 4) | 0.625 µL 20 µM primer Arb2A (tabel 4) |
| 0.625 µL 20 µM transposon-specifieke Primer (PMFLGM. GB 3a of Tn5Ext) (tabel 4) | 0.625 mL 20 µM Transposon-specifieke Primer (PMFLGM. GB 2a of Tn5Int2) (tabel 4) |
| 1 µL 10 mM dNTPs | 1 µL 10 mM dNTPs |
| 1 µL genomic DNA, 100 ng | 5 µL PCR1 reactie |
| 30 µL definitieve reactie volume | 30 µL definitieve reactie volume |
| PCR reactie instellingen | |
| PCR1 Thermocycler voorwaarden: | PCR2 Thermocycler voorwaarden: |
| 95 ° C – 2 min | 95 ° C – 2 min |
| Herhaal 5 cycli: | Herhaal 30 cycli: |
| 95 ° C – 30 s | 95 ° C – 30 s |
| 30 ° C – 1 min | 54 ° C – 30 s |
| 72 ° C-1 min | 72 ° C – 1,5 min |
| Herhaal 30 cycli: | 72 ° C-10 min |
| 95 ° C – 30 s | 4 ° C-Hold |
| 45 ° C – 30 s | |
| 72 ° C-1 min | |
| 72 ° C-10 min | |
| 4° C-Hold |
Tabel 3: PCR reactie set-up en thermocycler voorwaarden gebruikt voor willekeurige PCR. Willekeurige PCR reacties worden opeenvolgend uitgevoerd, en fragmenten gegenereerd tijdens PCR1 reactie worden gebruikt als sjabloon in PCR2 reactie. Specifieke thermocycler instellingen worden gebruikt voor elke set van reacties.
| De naam van de primer | Primer volgorde |
| MAR2xT7 Transposon-specifieke Primers | |
| PMFLGM. GB-3a | TACAGTTTACGAACCGAACAGGC |
| PMFLGM. GB-2a | TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG |
| MAR2xT7 Transposon Sequencing Primer | |
| PMFLGM. GB-4a | GACCGAGATAGGGTTGAGTG |
| TNphoA Transposon-specifieke Primers | |
| Tn5Ext | GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC |
| Tn5Int2 | GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG |
| TNphoA Transposon Sequencing Primer | |
| Tn5Int | CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC |
| Willekeurige Primers | |
| ARB1D | GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT |
| ARB2A | GGCCAGGCCTGCAGATGATG |
Tabel 4: lijst van inleidingen gebruikt in kwaliteitscontrole Experimenten. Gebruikt inleidingen voor PCR versterking en sequentiebepaling van transposon insertiemutanten mutant identiteit te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twaalf nieuwe exemplaren van de PA14NR Set werden gerepliceerd met behulp van Protocol I, en een beoordeling van de kwaliteitscontrole van de nieuwe kopieën gegenereerd werd uitgevoerd met behulp van Protocol III.
PA14NR Set mutant platen samen met controle platen, die bestaan uit wild type PA14 geënt en niet-geënte wells tussenliggende in een vooraf ingesteld patroon (figuur 4A), werden gerepliceerd na methology beschreven in controle van Protocol I. platen zijn opgenomen in de PA14NR ingesteld op het evalueren van mogelijke interwell besmetting bij het uitvoeren van de replicatie van de plaat. Bovendien kunnen de controle platen worden gebruikt om praktijk replicatietechnieken voorafgaand aan toegang tot platen met transposon insertiemutanten. Groei van controle platen werd visueel geïnspecteerd na replicatie op LB agar platen en overnachting incubatie om de aanwezigheid van verwachte groeipatronen (figuur 4B). Aan- of afwezigheid van bacteriegroei in diep goed blokken geënt met Control plaat 1 evalueerden na een incubatieperiode van 's nachts door het lezen van de OD600 in spectrofotometer. Resultaten toonden een aanzienlijke groei in het wild type PA14 geïnoculeerd wells en het volledig ontbreken van groei in de niet-geënte putten (figuur 4C). Hoewel er sommige variabiliteit in de groei van wild type PA14 culturen, was er volledige afwezigheid van groei in de niet-geënte putten (Figuur 4 d).
Achtendertig gemuteerde stammen willekeurig uit een van de nieuw gegenereerde exemplaren van de PA14NR Set werden geanalyseerd door het rangschikken van DNA-fragmenten die worden gegenereerd door willekeurige PCR. Willekeurige PCR reacties werden uitgevoerd om te vergroten van DNA-fragmenten uit gebieden rond transposon inlassingen uit de 38 mutanten geselecteerd en de PCR-fragmenten verkregen werden vervolgens gesequentieerd. Een voorbeeld van PCR fragmenten verkregen na PCR versterking van negen verschillende transposon insertiemutanten is afgebeeld in Figuur 5. Zoals gloeien van willekeurige inleidingen willekeurig gebeurt, worden lengte van het fragment niet voorspeld. Wanneer geen bands zichtbaar waren, werden PCR reacties herhaald. De identiteit van de transposon inlassingen vervat in de 38 mutanten geanalyseerd werd gevonden met behulp van de PA14 Transposon invoeging Mutant Library link (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) om te selecteren van de nodig voor het uitvoeren van willekeurige PCR inleidingen reacties.
Volgorde van de resultaten verkregen uit de 38 mutant stammen waren gestraald tegen het volledige genoom van stam PA14 met behulp van de ontploffing link op de website van de bibliotheek van de PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi). Sequencing resultaten van willekeurig geselecteerde mutanten waren ook uitgelijnd tegen de gensequenties die overeenkwam met elke individuele mutant (verkregen met behulp van de PA14NR ingesteld plaat positie search tool vinden op de PA14NR bibliotheek website http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS). Reeks aanpassingen werden uitgevoerd met het hulpprogramma voor het uitlijnen sequenties Nucleotide BLAST geboden door NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PAGINA = MegaBlast & programma = blastn & BLAST_PROGRAMS = megaBlast & PAGE_TYPE = BlastSearch & BLAST_SPEC = blast2seq & DATABASE = n/a & QUERY = & onderwerpen =).
Twee van de 38 mutanten gegenereerde lage kwaliteit reeks resultaten, waarschijnlijk vanwege de hoge GC-gehalte in de regio met het inbrengen van transposon, geselecteerd en niet verder kunnen worden geanalyseerd. Reeks resultaten uit 35 van de 36 succesfully sequenced mutanten gematched de sequenties van de genen die overeenkomt met de mutanten PA14NR instellen geselecteerd. Slechts één van de 36 sequenties niet overeenkomt met de reeks opdrachten voor de gene die correspondeert met de mutant geselecteerd. Het was echter niet vast als deze discrepantie resultaat is van een probleem dat zich heeft voorgedaan tijdens de replicatie van de nieuwe exemplaren van de PA14NR Set of kan worden toegeschreven aan de 2,8% beleidseenheden fout eerder geraamd voor de PA14NR Set37.
Figuur 4: PA14NR instellen controle platen. A) lay-out van PA14NR ingesteld controle platen 1 en 2. B) foto van PA14 NR ingesteld controle platen 1 en 2 op LB Agar (uitzicht vanaf top van agarplaat) worden gerepliceerd. C) gemiddelde bacteriële groei (+/-SD) gemeten in gevaccineerde en niet-geënte putjes van Control plaat 1 na een incubatieperiode van de overnachting in diepe goed blok. Lezingen werden uitgevoerd bij OD600. D) bacteriële groei gemeten in gevaccineerde en niet-geënte putjes van Control plaat 1 na een incubatieperiode van de overnachting in diepe goed blok. Lezingen werden uitgevoerd bij OD600 in individuele wells. Zelfs kolommen overeenkomen met metingen in niet-geënte putten; oneven kolommen komen overeen met metingen in putten PA14-geënt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: PCR1 en PCR2 fragmenten verkregen amplificatie reacties. Voorbeeld van de fragmenten die zijn verkregen met behulp van willekeurige PCR versterking reacties. Fragmenten in rijstroken 1-9 correspondeert met verschillende mutanten willekeurig gekozen voor het uitvoeren van kwaliteitscontroles van PA14NR Set gerepliceerd platen. MWM: DNA molecuulgewicht marker. DNA MWM maten zijn in basenparen.
PA14NR Set gemuteerde stammen getest: Lane 1: A10, lane 2 07_4: 07_4 B4, lane 3: 08_1 C3, lane 4: 08_1 H6, steeg 5: 08_3 G10, lane 6: 08_4 B8, lane 7: 08_4 H3, lane 8: 09_2 D12, lane 9 : 09_2 G5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De P. aeruginosa PA14NR ligt een waardevolle bron voor de wetenschappelijke gemeenschap. Volgens de maart 2017 dataset uit Clarivate Analytics belangrijke indicatoren van de Science database, Liberati et al. (2006) 37, waarin de bouw van de PA14NR Set, is gerangschikt in de top 1% van de publicaties van de microbiologie. Google Scholar rapporten meer dan 600 citaten van de Liberati et al. (2006) originele manuscript vanaf augustus 2017. De bibliotheek heeft een belangrijke rol in het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de P. aeruginosa pathogenese gespeeld. Nog belangrijker is, vergemakkelijkt de indeling van de 96-wells-plaat van de PA14NR Set hoge doorvoer genetische schermen ontworpen om te bestuderen van een verscheidenheid van P. aeruginosa mutant fenotypen44,45,46. Aangezien de PA14NR Set beschikbaar voor distributie is, moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden gebruikt voor het behoud van de integriteit van deze hulpbron.
Een aantal publicaties tonen het nut van het gebruik van de PA14NR Set in genetische schermen37,,38,,47,48. Bijvoorbeeld, als een eerste test voor het nut van de bibliotheek, Liberati et al. uitgevoerd een PVC (polyvinylchloride) bijlage scherm, die met de bacteriën in de mogelijkheid om formulier biofilms37,38, correleert 47 , 48. de indeling van de bibliotheek maakt het ook mogelijk de studie van complexe genetische eigenschappen zoals de motiliteit, blijkt uit de identificatie van genen van belang in een eenvoudige scherm48honderden zwermen. De PA14NR Set werd ook gebruikt in een grootschalige MALDI-TOF massa spectrometrie gebaseerde scherm te verwerven en intact-cel Proteoom profiel spectra analyseren en evalueren van de doeltreffendheid van de MALDI-TOF Biotyping47. Het toepassen van deze techniek, konden onderzoekers om te bepalen of kleine genomische verschillen, zoals die uit transposon invoegingen voortvloeien, storend aan de inspanningen van de biotyping die worden gebruikt in de klinische en therapeutische omgevingen. Bovendien, werd de PA14NR Set gebruikt voor het uitvoeren van een genoom-brede scherm voor demping van PA14 virulentie in een C. elegans infectie model, zodat de identificatie van eerder genfunctieonderzoek P. aeruginosa virulentie-gerelateerde genen 38, en waardoor een voorbeeld van het gebruik van de bibliotheek PA14 te bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties.
De PA14NR Set fungeert ook als een belangrijke bron voor de studie van individuele mutanten. Beste praktijken voor de toegang tot van mutanten van belang zijn om besmetting te voorkomen van de bibliotheek, aanbevolen. Omdat de behandeling van de bibliotheek verhoogt de kans op verontreiniging, is het raadzaam om op te slaan van mutanten belangstelling voor individuele flesjes te beperken van de toegang tot de werken PA14NR instellen en de originele exemplaren. Dit voorkomt vervuiling, verbetert de levensduur van de bibliotheek, en beschermt de investering.
Oog op het behoud van de integriteit van de belangrijke bron van PA14NR ingesteld, is het raadzaam dat alle ontvangers van de PA14NR Set kopieën van de bibliotheek na ontvangst maken. Ondanks beste inspanningen, worden het potentieel voor onbedoelde besmetting tijdens replicatie procedures niet uitgesloten. Daarom is het sterk aanbevolen dat gebruikers volledige kwaliteitscontrole controleert na bibliotheek replicatie en het gebruik van de bibliotheek voor het uitvoeren van genetische schermen. Het is ook raadzaam dat gebruikers extra exemplaren van de PA14NR ingesteld maken op het uitvoeren van genetische schermen als de waarschijnlijkheid van interwell besmetting toeneemt. Kopieën van de bibliotheek gebruikt voor het uitvoeren van meer dan 2-3 genetische schermen moeten daarnaast onderworpen aan uitvoerige kwaliteitscontrole evaluaties. Helaas, er is geen goede manier om te herstellen van bibliotheken die ervaring van verlies van klonen of interwell besmetting. Besmette of verontreinigde kopieën moeten worden verwijderd. Dientengevolge is het aanbevolen dat gebruikers gerepliceerd meerdere kopieën van de bibliotheek voor routinematige laboratoriumgebruik, gezien het feit dat de gebruiksduur van een kopie beperkt is. Ook is het aanbevolen dat gebruikers toegang tot de "master copy" beperken tot het behoud van de integriteit van de PA14NR Set.
De hier gepresenteerde protocollen bieden een gedetailleerde uitleg van de replicatietechnieken, waaronder set-up, protocollen en beste praktijken. De protocollen van de replicatie beschreven voor het instellen van de PA14NR kunnen worden aangepast voor het genereren van maximaal 12 kopieën van de bibliotheek en ook gemakkelijk kunnen worden aangepast voor het repliceren van andere bacteriële mutant bibliotheken. Tot de beste van onze kennis zijn er geen gepubliceerde protocollen beschikbaar met gedetailleerde beschrijvingen van de procedures en technieken die worden gebruikt voor replicatie, onderhoud en validatie van bacteriële mutant bibliotheken tot nu toe. Wij hopen dat deze protocollen zorgt voor gebruikers van de PA14NR Set en andere bacteriële mutant bibliotheken met de informatie die nodig is voor het uitvoeren van deze belangrijke taken.
Of de bibliotheek wordt gebruikt voor hoge-doorvoer schermen of als een bron voor individuele mutanten, is het belangrijk om periodiek beoordelen de integriteit van het exemplaar in gebruik. Hiervoor moeten adequate opleiding van personeel en het opnieuw beoordelen van replicatie of mutant selectietechnieken periodiek worden gedaan. Het gebruik van controle-platen PA14NR instellen en prestaties van routine PCR versterking en sequentiebepaling van willekeurige mutanten om hun identiteit te bevestigen wordt sterk aanbevolen. Liberati el al. (2006) 37 geschat dat 2,8% van het totale aantal mutanten in de PA14NR Set werd benoemd, die wijst op de noodzaak te reeks specifieke transposon mutanten en te genereren in-frame verwijderen mutanten voordat een uitgebreide studie en/of publicatie van het onderzoek met betrekking tot specifieke gen. Gezien de juiste protocollen en methoden voor bibliotheek replicatie en selectie van individuele mutanten voor verdere studie, zal de PA14NR Set bijdragen tot het begrip van P. aeruginosa pathogeniteit en de verbetering van de klinische resultaten voor besmet patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen financiële belangenconflicten. Eliana Drenkard en Frederick Ausubel deelgenomen aan de oprichting de PA14 nonredundant transposon mutant bibliotheek. Bryan Hurley en Lael Yonker momenteel house en de mutant bibliotheek distribueren als onderdeel van de afdeling kindergeneeskunde in het Massachusetts General Hospital.
Acknowledgments
We bedank Lisa Philpotts van de MGH Treadwell virtuele bibliotheek voor haar begeleiding in de database zoeken. Dit werk werd gesteund door de Cystic Fibrosis Stichting (YONKER16G0 en HURLEY16G0) en NIH NIAID (BPH en ADE: R01 A1095338).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Library Replication | |||
| Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 | Corning Life Sciences | 353072 | via Fisher Scientific |
| Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 | Corning Life Sciences | 3960 | via Fisher Scientific |
| Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 | Thermo Scientific Rochester | 242811 | via Fisher Scientific |
| Rectangular Ice Pan, Midi (4L) | Corning Life Sciences | 432104 | via Fisher Scientific |
| Secure-Gard Cone Mask, case of 300 | Cardinal Health | AT7509 | via Fisher Scientific |
| AluminaSeal, pack of 100 | Diversified Biotech | ALUM-100 | via Fisher Scientific |
| Breathe-Easy membrane, pack of 100 | Diversified Biotech | BEM-1 | via Sigma-Aldrich |
| Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 | Sorenson | S50100 | via Westnet Incorporated |
| Plate roller | VWR | 60941-118 | via VWR |
| Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets | GA International | RCL-11T1-WH | via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com) |
| 96-well replicator | V & P Scientific, Inc. | Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long | via V & P Scientific, Inc. |
| Multitron Pro, 3mm Shaking incubator | Infors HT | l10003P | via Infors HT |
| Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette | Sartorius | 735491PR | via Sartorius |
| Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 | Biohit | 14-559-512 | via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips |
| Dry Ice | User-specific vendor | ||
| Materials for Individual Mutant Storage | |||
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| Pipettes (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Gilson |
| Materials for Quality Control PCR | |||
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | via ThermoFisher |
| PCR Thermocycler | |||
| Omnistrips PCR Tubes with domed lids | Thermo Scientific | AB0404 | via Fisher Scientific |
| ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) | Molecular BioProducts, Inc. | Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) | via Sigma-Aldrich |
| Pipettes (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Gilson |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| MasterPure DNA Purification Kit | Epicentre | MCD85201 | via Epicentre Technologies Corp |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Scientific | SM1333 | via ThermoFisher |
| RediLoad Loading Buffer | Invitrogen | 750026 | via ThermoFisher |
| Chemicals | |||
| Chemicals for Library and Individual Mutant Storage | |||
| Glycerol MB Grade, 1L | Sigma Aldrich | G5516 | via Sigma-Aldrich |
| LB Broth | Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, 1994.) | ||
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | via Sigma-Aldrich |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | via Sigma-Aldrich |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | via Sigma-Aldrich |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S8045 | via Sigma-Aldrich |
| LB agar | See preparation above, add 15g Bacto Agar | ||
| Bacto Agar | Sigma Aldrich | A5306 | via Sigma-Aldrich |
| Gentamicin sulfate, 10g | BioReagent | 1405-41-0 | via Sigma-Aldrich |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815024 | via ThermoFisher |
| Ethanol, 190 proof | Decon | 04-355-221 | via Fisher Scientific |
| Chemicals for Quality Control PCR | |||
| Primers | User-preferred vendor | See primers listed in Table 3 | |
| Corning cellgro Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | via Fisher Scientific |
| Taq Polymerase Buffer | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| dNTPs | Invitrogen | 10297018 | via ThermoFisher |
| Agarose | Sigma | A9539 | via Sigma-Aldrich |
References
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
- Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
- Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
- Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
- Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
- Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
- Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
- Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
- Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
- Foundation, C. F. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report. , Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016).
- Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
- National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
- Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
- Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
- Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
- Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
- Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
- Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
- Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
- Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
- He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
- Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
- Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
- Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
- Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
- Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
- Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
- Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
- Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
- Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
- Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
- Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
- Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
- Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
- Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
- van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
- Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
- Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. (1994).
- Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
- Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
- Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
- Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).
