Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57298
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 2,3, 1,4, 1,4
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Pseudomonas aeruginosa זיהום גורם תחלואה משמעותית מארחים פגיע. Nonredundant transposon ההכנסה מוטציה הספרייה של זן aeruginosa פ PA14, כמנהל PA14NR להגדיר, מקלה על ניתוח של ג'ין פונקציונליות בתהליכים רבים. המוצג כאן הוא פרוטוקול כדי ליצור עותקים באיכות גבוהה של ספריית מוטנטים PA14NR להגדיר.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa הוא phenotypically, genotypically מגוונת וישימה גראם שליליים חיידק נפוץ בסביבות אנושי. Aeruginosa פ הוא מסוגל ליצור biofilms לפתח עמידות לאנטיביוטיקה, לייצר הגורמים התקפה אלימה, להתפתח במהירות במהלך זיהום כרוני. לפיכך aeruginosa פ יכול לגרום הן אקוטית, כרונית, קשה לטפל בדלקות, וכתוצאה מכך תחלואה משמעותית באוכלוסיות מסוימות החולה. זן aeruginosa פ PA14 הוא בידוד קליני האדם עם מבנה הגנום שנשמרת מדביק מגוון רחב של מחשבים מארחים יונקים ו nonvertebrate, שהופך PA14 זן אטרקטיבי ללמוד את הפתוגן. בשנת 2006, נוצרה מוטציה nonredundant transposon ההכנסה ספריה המכילה מוטציות 5,459 המקביל 4,596 גנים PA14 החזוי. מאז, הפצה של הספרייה PA14 אפשרה את קהילת המחקר להבין טוב יותר את הפונקציה של גנים יחידניים מסלולים מורכבים של aeruginosa פ. שמירה על תקינות הספרייה באמצעות תהליך השכפול דורשת טכניקות טיפול נכונה ומדויקת. לשם כך, כתב יד זה מציג פרוטוקולים המתארים בפרוטרוט השלבים המעורבים ספריית שכפול, בקרת איכות ספריית ואחסון נאות של מוטציות בודדות.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa הוא phenotypically, genotypically מגוונת וישימה גראם שליליים חיידק נוכח קרקע, מים, סביבות האנושי ביותר, כמו גם microflora העור. בהשוואה למינים רבים של חיידקים, aeruginosa פ יש גנום גדולה יחסית של Mbp 5.5-7 עם גבוהה G + C תוכן (65-67%). יתר על כן, חלק ניכר את הגנים מעורבים הסתגלות מטבולית, חלק רשתות רגולטוריות, המאפשרות גמישות רבה בתגובה עקה1. פ aeruginosa מבטא שפע של הגורמים התקפה אלימה, תערוכות נטייה כדי ליצור biofilms, הנו היכולת לתאם בין תגובות דרך חישת מרובים מסלולים ו מציג קיבולת הבולטים לפתח עמידות לאנטיביוטיקה סובלנות2,3,4,5,6,7,8. תכונות אלה מציגים אתגרים משמעותיים לטיפול זיהומים הנגרמים על ידי aeruginosa פ.

כרוניות זיהומים aeruginosa פ יכול להתרחש מצבי מחלה רבים. סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה גנטית נגרמת על ידי מוטציה של הגן סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) , התוצאה היא הפרשות inspissated, נגועים בתוך האוויר, ברונכיאקטזיס מתקדמת ובסופו של דבר, למוות כשל נשימתי9. מאת לבגרות, הרוב המכריע של חולים עם CF כרוני נגוע aeruginosa פ, אשר ממלא תפקיד מפתח התחלואה והתמותה הקשורים למחלה זו10. בנוסף, חולים עם כוויות חמורות הפציעות11, tracheostomies12, החלפות פרקים13או קטטרים שכנה14 הם בסיכון לזיהום aeruginosa פ הקשורים ליכולת של החיידקים טופס biofilms ולברוח לארח תגובות דלקתיות15. יתרה מזאת, קולוניזציה מתרחשת ללא תחרות לאחר אוכלוסיה עמידים בפני אנטיביוטיקה מרובות או סובלנית נבחרה דרך טיפול מיקרוביאלית רחבת ספקטרום רציף12,16,17 , 18. הבנה טובה יותר בפתוגנזה של aeruginosa פ יהיו השלכות משמעותיות על מצבי מחלה רבים.

מספר aeruginosa פ קליניים מבודד, כולל זנים PAO1, PA103, PA14, פאק, נחקרו בהרחבה לחקור תכונות שונות של פתוגנזה aeruginosa פ . זן PA14 הוא בידוד קליניים שייך לאחד הנפוצים המשובטים קבוצות ברחבי העולם19,20 , לו לא היה בהרחבה passaged במעבדה. PA14is מאוד מידבק במודלים חוליות של זיהום, עם אנדוטוקסין הבולטים פרופיל21, pili מבנה22, פתוגניות איי23, הקלד מערכת הפרשת השלישי (TTSS), cytotoxicity כלפי מידע יונקים תאים24 ו פרופילים עמידות והתמדה לאנטיביוטיקה25. יתר על כן, PA14 הוא גם מאוד מידבק במערכות דגם פתוגן-פונדקאי רבים, כולל צמח העלה הסתננות מודלים26,27, זיהוםCaenorhabditis elegans מודלים28, 29, חרק מודלים30,31, כמו גם דלקת ריאות העכבר דגמי32,33 , צריבה בעור מודלים34.

ספריות מוטציה הגנום כולו הן אוספים של isogenic מוטציות בגנים חיוניים מהווה כלי רב עוצמה כדי להבין את הביולוגיה של אורגניזם בכך שהוא מאפשר ניתוח של ג'ין פונקציה בקנה מידה גנומית. שני transposon ליד, הרוויה ההכנסה מוטציה ספריות שנבנה ב פ aeruginosa זמינים כעת להפצה. האתרים ההכנסה של טרנספוזונים שנקבע עבור שתי ספריות. ספריות nonredundant כביכול אלה להקל על מחקרים ברמת הגנום של זני חיידקים על ידי להקטין במידה ניכרת את הזמן ואת עלות מעורב ההקרנה uncharacterized מוטציות אקראיות transposon. Aeruginosa פ PAO1 transposon מוטציה הספרייה, שנבנה ב MPAO1 לבודד את זן PAO1 באמצעות טרנספוזונים ISphoA/ הא והואlacZ/ הא35, היא נאצרה על ידי המעבדה Manoil, אוניברסיטת וושינגטון. הספרייה כוללת תבדוק-רצף אוסף של מוטציות transposon 9,437 מספק כיסוי הגנום רחב וכולל שתי מוטציות של גנים רוב36. מידע אודות ספריית מוטנטים של transposon PAO1 aeruginosa פ הוא ציבורי, נגישים לאינטרנט Manoil המעבדה באתר-http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. Aeruginosa פ זן PA14 nonredundant transposon ההכנסה מוטציה ספריה (מוגדר PA14NR) נבנה בזן PA14 באמצעות MAR2xT7 ו- Tn טרנספוזוניםphoA37 מופץ כיום על ידי המחלקה לרפואת בבית החולים הכללי במסצ'וסטס. ערכת PA14NR כוללת אוסף של יותר מ- 5,800 מוטציות עם הוספות transposon יחיד בגנים חיוניים37. פרטים על הקמה של ערכת PA14NR מתוארים http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB אתר ציבורי, אינטרנט נגיש, אשר כולל גם מגוון רחב של כלי חיפוש באינטרנט כדי להקל על השימוש PA14NR הגדר.

ערכת PA14NR המקורית כללה מוטציות 5,459, שנבחר מתוך ספרייה מקיפה של 34,000 transposon אקראיים ההכנסה מוטציות, התואמים 4,596 גנים PA14 החזוי המייצגים 77% של כל החזוי PA14 גנים37. מאז הקמת הספרייה בשנת 2006 נוספו המוטנטים החדשים וכוללת כיום ערכת PA14NR 5,800 יותר מוטציות38 המייצגים כ-4,600 מינים גנים PA14. רוב המוטציות transposon PA14 נוצרו על רקע פראי סוג37. פרטים על כל חבר של ספריית מוטנטים, כולל רקע גנטי, זמינים דרך חיפוש במסד הנתונים המקוון, או על-ידי הורדת את הגיליון האלקטרוני של ספריית Nonredundant, שתי תכונות זמין באתר האינטרנט של PA14 (http:// pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi). רוב המוטציות שנוצרו באמצעות MAR2xT7 של transposon (MrT7), עם קבוצה קטנה שנוצרו באמצעות transposon TnPhoA (phoA)37. בכל transposon יש קלטת של עמידות לאנטיביוטיקה, המאפשר בחירה מוטציה באמצעות גנטמיצין (MrT7) או kanamycin (phoA). ערכת PA14NR של מוטציות מאוחסן בשישים ושלוש 96-ובכן צלחות, כולל בקרה 96-ובכן נוספים שני לוחות, המורכבים מסקטור פראי סוג PA14 מחוסן, בארות uninoculated intercalated בתבנית מוגדרת מראש. התבנית 96-ובכן צלחת לזווג עם כלי החיפוש באינטרנט מאוד מקלה על התפתחות אישית הקרנת מבחני המאפשרים למשתמשים בקלות לזהות גנים הקשורים פנוטיפים מוטציה. כלי החיפוש המקוון להקל גם לחיפוש ובחירת ושכמותי רלוונטיים נוספים הנדרשים ללימודי.

PA14, PAO1 transposon מוטציה הספריות הן במשאבים גלובליים חשוב מאוד עבור הקהילה המדעית, הם משלימים אחד את השני אימות את התפקוד של הגנים לא ידוע מסלולים של פתוגן חיידקי הזה. בצירוף מקרים, מאז הקמת ספריות מוטציה transposon של PAO1 ו- PA14, מלא הגנום אנליזת רצפי דנ מבודד aeruginosa פ רבים הראו כי PAO1 ו- PA14 שייך שונים subclades הגדולות של aeruginosa עמ' האמיניות7,39,40,41. כי קליניים aeruginosa פ מבודד נמצאים מופצים ברחבי האמיניות, העובדה כי PAO1 ו- PA14 שייך שונים aeruginosa פ תת-קבוצות המעלה את ערכו של מוטציה transposon שתי ספריות עבור השוואתי מחקרים.

פרסומים המתארים את הבנייה וסינון של ספריות מוטציה חיידקיים, כולל ספריות aeruginosa פ 35,37,42, זמינים בקלות בספרות. עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, אין פרוטוקולים שפורסמו המתארת הליכים מפורטים ואת טכניקות המשמשות לצורך שכפול, תחזוקה, אימות של חיידקי ספריות מוטציה הינם זמינים.

המתודולוגיה המתוארים בפרסום זה מתאר קבוצה של פרוטוקולים שלושה המאפשרים שימוש ותחזוקה של ערכת PA14NR. הפרוטוקול הראשון מתאר שכפול של הספרייה כמומלץ לנמענים של ערכת PA14NR. פרוטוקול השני כולל הנחיות ומבטא, גדל, ואחסון מוטציות בודדות מזוהה באמצעות ערכת PA14NR. הפרוטוקול השלישי מתאר טכניקות בקרת איכות, כולל PCR הגברה של קטעים מן transposon מוטציות ורצף הבאים כדי לאשר את הזהות מוטציה. זו קבוצה של פרוטוקולים עשוי גם להיות מותאם שכפול ותחזוקה של חיידקי ספריות מוטציה או אוספים אחרים. השכפול של חיידקי ספריות מוטציה או אוספים מומלץ מאוד כדי לשמור על השלמות של "העותק הראשי" (העותק המקורי קיבל). שכפול של מספר עותקים של ערכת PA14NR לשימוש מעבדה שגרתיות ממזער את ההסתברות של זיהום interwell של העותק הראשי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

התראה: לנצל אמצעי בטיחות BSL-2 רגיל בעת טיפול aeruginosa פ, פתוגניות. אם אתה אדם immunocompromised או יש מצב רפואי מגביר את הרגישות שלך זיהום חיידקי, קח זהירות מיוחדת בעת עבודה עם פ . aeruginosa. להתייעץ עם המשרד אבטחה במוסד שלך ולקבל אישור מהרופא שלכם לפני שעבדה עם PA14 ע נ קבע או ספריות מוטציה של פתוגנים חיידקיים.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על פרוטוקול i: שכפול של PA14NR הגדר. יום 1: לשכפל קפוא תרבויות מוטציה מעותק"מאסטר" של הגדר PA14NR לתוך המדיה LB אגר ולגדול מוטציות בן לילה ב 37 º C. יום 2: העברת הצמיחה מוטציה ממדיה LB אגר לאבני עמוק טוב המכיל מרק נוזלי ליברות, גדלים בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-950 סל ד יום 3: לערבב תרבויות LB לילה עם גליצרול, ולאחר מכן להעביר ללוחות 96-ובכן היעד לאחסון לטווח ארוך. מקום 96-ובכן לוחות שטוחים במקפיא-80 ° C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מומלץ ההתקנה. עקרות וזרימת עבודה חלקה צריך להישמר באמצעות אמצעי זהירות מתאימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. פרוטוקול i: שכפול של PA14NR הגדר

הערה: שכפול של הספרייה יכולה להיות מושגת על ידי חלוקת ערכת PA14NR של ארבע קבוצות משנה של 16 צלחות בכל זאת ניתן יהיה לעבד ארבעה שבועות רצופים. דור 1 עד 6 עותקים לאנאפוליס שזרימת שבועיות המתוארים בטבלה 1, בעוד דור של יותר מ-6 עותקים עוקב אחר זרימת העבודה שבועיות המתוארים בטבלה מס ' 2. כדי ליצור עותקים 12 של ערכת PA14NR, לחסן המשנה PA14NR אותו לתוך נוזל מדיית LB ביום 2, שוב ביום השלישי (מתוך אותה קבוצה של אגר הגלופות ישוכפל על יום 1), העברה בין לילה תרבויות מוטציה לתוך צלחות העתק על יום 3 ו- 4 יום בהתאמה.

יום 0 יום 1 יום 2 יום 3
יום הכנה צמיחה של PA14NR להגדיר מוטציות במדיה אגר ליברות צמיחה של PA14NR להגדיר מוטציות בתקשורת LB נוזלי העברה של תרבויות מוטציה PA14NR להגדיר ללוחות היעד

טבלה 1: לוח הזמנים עבור שכפול של 1-6 עותקים של ערכת PA14NR. שכפול של מספר קטן של עותקים עשויים לדבוק זרימת עבודה שבועי.

יום 0 יום 1 יום 2 יום 3 יום 4
יום הכנה צמיחה של PA14NR להגדיר מוטציות על אגר ליברות גדלים של PA14NR להגדיר מוטציות בתקשורת LB נוזלי העברה של תרבויות מוטציה ביום השלישי כדי ליצור ערכת 1 6 עותקים של הגדר PA14NR העברה של תרבויות מוטציה ביום הרביעי ליצירת סט של 6 עותקים של PA14NR להגדיר 2
צמיחה של PA14NR להגדיר מוטציות בתקשורת LB נוזלי

בטבלה 2: לוח הזמנים עבור שכפול של עד 12 עותקים של ערכת PA14NR. שכפול של מספר גדול יותר של עותקים ידרוש בשכבות בתוך זרימת עבודה שבועי.

  1. יום 1: צמיחה של עותק PA14NR להגדיר מאסטר על פלטות אגר ליברות
    1. ללבוש כפפות, חלוק ומסיכה להתמודד עם ערכת PA14NR.
    2. ברור משטח ספסל ולנגב עם 70% אתנול.
    3. להכין LB-אגר-מדיה-43 , עיקור אוטוקלב עבור מדיה מגניב מינימלית 25 עד 55 ° C במים אמבט ולהוסיף או גנטמיצין 15 µg/mL, למוטאנטים המכילה הוספות transposon MAR2xT7 או µg/mL 200 kanamycin, למוטאנטים המכיל TnphoA הוספות.
    4. יוצקים אגר LB מותכת בתוך צלחות מלבניות באמצעות כ- 60 מ של מדיה בכל צלחת. צלחות יבש בשכונה סטרילי עבור 1 h לפני שימוש. לוודא שאין שום עיבוי מים על פני השטח של אגר. חנות צלחות ב 4 ° C, במידת הצורך.
    5. ליצור שדה סטרילי בעזרת מבער בונזן על גבי ספסל מחה אתנול ולהגדיר מכולות עם פתרונות מתאימים עבור המשכפל pin עיקור (ראה שלב 1.1.9). שימוש לפתוח מיכלי פלסטיק (של 5.25" L x 4.25" W x 1.75 "H בגודל המשוער) עבור המשכפל pin עיקור. אוטוקלב מיכלי פלסטיק לפני השימוש.
      הערה: חום הלהבה מבער בונזן יוצר של הסעת חום הנוכחי, אשר מחמם את השטח מעל הלהבה, מרים את כל החלקיקים באוויר האוויר הקר מתחת, ולהרחיקו שמירה על אזור העבודה סטרילי.
    6. להסיר מספר מרבי של ארבעה לוחות ראשיים PA14NR להגדיר מהמקפיא-80 מעלות (כדי למנוע מפשיר מיותרים), ומניחים אותם על קרח יבש ב- 4 L קרח פאן.
    7. לוקח את הצלחת 96-ובכן האב ישוכפלו של קרח יבש ולמקם אותו על הספסל כדי לאפשר מפשיר קצר, אשר יקח את הזמן הדרוש עבור עיקור הפינים משכפל (כ 3-4 דקות) (ראה שלב 1.1.8). סמן את המיקום של הקואורדינטה A1 בצלחת אגר לפני החתמת. יישר מאסטר צלחת, צלחת אגר עם קואורדינטת A1 של שתי צלחות בפינה השמאלית העליונה.
    8. לחטא את המשכפל "סיכות" על-ידי ביצוע השלבים המתוארים להלן. הקש על המשכפלים מעט לאחר כל שלב כדי להסיר עודפי נוזלים.
      1. לטבול פינים 250 מ של 0.3-0.5% נתרן תת-כלורי (אקונומיקה ביתיים 10%) למשך 30 שניות. למזער מגע עם פתרון נתרן תת-כלורי, כמו זה יכול להוביל לנזק של סיכות. לטבול סיכות 250 מ ל ddH סטרילי2O או סטרילי מים הנדסה גנטית למשך 10 שניות, ואז 250 מ"ל אתנול 70% למשך 30 שניות, ואז ב- 250 מ של 95% אתנול למשך 2 דקות.
      2. להבה לעקר את המשכפלים סיכות על ידי מחזיק משכפל בניצב ללהבה מבער בונזן, לאט לאט מתקרבת הלהבה עד אתנול, מצית, ואז מיד פורש זה מהלהבה. הלהבה לכבות פעם כל אתנול ברנס חופש. לשמור על המכסה או מיכל דומה קרוב להיחנק שריפת אתנול, במידת הצורך.
        הערה: השתמש בזהירות בעת עבודה עם אתנול ליד להבה. ואינם מחזיקים משכפל ישירות מעל הלהבה.
      3. סיכות מגניב על-ידי הצמדת על צלחת מלבנית סטרילי שאינו בשימוש המכילה אגר LB מדיה למשך 30 שניות.
    9. בקצרה אלומיניום חמים חותם מהאדון PA14NR להגדיר צלחת עם היד שלך לפני פילינג זה ביטול. . לעשות את זה תוך כדי קירור משכפל סיכות להסיר את החותם אלומיניום בקפידה כדי למנוע את החותם של ליטוש את הצלחת. השתמש פינצטה לקלף את כל שרידים של החותם אלומיניום.
    10. הכנס משכפל סיכות לתוך צלחת הבסיס, דוחפים בעדינות, משכפל מתנדנדים בכל ארבעת הכיוונים כדי להבטיח כי פיני לגרום ליצירת קשר עם תרבויות חיידקי קפואים בכל אחד מן הבארות-96. שים לב נוסף בארות ממוקם הקצה החיצוני של הצלחת על ידי דחיפת משכפל סיכות נגד תרבויות קפוא ב בארות ממוקם בקצה של הצלחת.
    11. הנח בעדינות משכפל סיכות על גבי משטח של צלחת אגר. להעביר משכפל בתנועה סיבובית קלה כדי טופס מיני-מדשאות של 4-5 מ מ עבור כל זן מוטציה. למנוע את האפשרות כי המיני-המדשאות ייתכן חפיפה, כדי למנוע זיהום לחצות.
    12. חותם PA14NR להגדיר לוח אב חותם אלומיניום סטרילית חדשה. אל תגעו בצד דבק של אלומיניום חותם בכל נקודה כדי למנוע זיהום. ודא כי כל טוב ואת הקצוות של צלחת לחלוטין חתומות באמצעות גלגלת לצלחת. צלחת החזרה 96-ובכן קרח יבש.
    13. חזור על הליך עבור כל צלחת הבסיס.
    14. נגב את כל משטחי עבודה עם אתנול 70% לאחר טיפול ערכת PA14NR.
    15. העברת לשכפל פלטות אגר חממה 37 ° C, דגירה בין לילה.
  2. יום 2: צמיחה של העותק PA14NR להגדיר מאסטר במרק נוזלי ליברות
    1. להכין מרק נוזלי LB43 המכיל גם גנטמיצין 15 µg/mL, למוטאנטים המכילה הוספות transposon MAR2xT7 או µg/mL 200 kanamycin, למוטאנטים המכילה הוספותphoA Tn.
    2. נקה למינארי של ציוד מיותר, להפעיל מפוח הוד למשך תקופה מינימלית של 10 דקות לפני תחילת העבודה. לנקות משטחים הוד וכל הפריטים להציב בשכונה באמצעות אתנול 70%.
    3. למלא 2 מ"ל-באר רחובות µL 525 LB מרק נוזלי המכיל אנטיביוטיקה מתאימה על למינארי באמצעות פיפטה אלקטרוניים µL 12-ערוץ 50-1200. לאחר מכן, להעביר מלא מדיה רחובות באר העליון מחה אתנול ספסל. שימוש חוזר טיפים כל עוד נשמר בתנאים סטריליים.
    4. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה ואת מסיכת לטפל PA14NR להגדיר.
    5. ברור משטח ספסל ולנגב עם 70% אתנול.
    6. להביא צלחות אגר עם לילה זנים מוטציה בוגר ספסל העליון.
    7. ליצור שדה סטרילי בעזרת מבער בונזן על גבי ספסל מחה אתנול ולהגדיר מכולות עם פתרונות מתאימים עבור המשכפל pin עיקור (ראה שלב הבא).
    8. לעקר את המשכפלים "סיכות" ביצוע הפעולות המתוארות להלן. הקש על המשכפלים מעט לאחר כל טבילה כדי להסיר עודפי נוזלים.
      1. לטבול פינים 250 מ של 0.3-0.5% נתרן תת-כלורי למשך 30 שניות. מזער משכפל קשר pin עם פתרון נתרן תת-כלורי, כמו זה יכול להוביל לנזק של סיכות. לאחר מכן, לטבול סיכות 250 מ ל ddH סטרילי2O או הנדסה גנטית מים למשך 10 שניות, ואז ב 250 מ של אתנול 70% למשך 30 שניות, לאחר מכן ב- 250 מ של 95% אתנול למשך 2 דקות.
      2. להבה לעקר את המשכפלים סיכות, אז סיכות מגניב על-ידי הצמדת לתוך צלחת מלבנית שאינם בשימוש המכילה אגר LB מדיה למשך 30 שניות.
        הערה: לנקוט בזהירות בעת עבודה עם אתנול ליד להבה (ראה 1.1.8).
    9. בעדינות במקום סיכות המשכפלים על גבי צלחת אגר המכילה צמיחה מוטציה, בדוק כי סיכות נמצאים בקשר עם כל המוטציות 96 על צלחת אגר, ואז להטביע סיכות לתוך בארות עמוקים המכילות מרק נוזלי ליברות. להימנע מלגעת הצדדים מן הבארות עם הסיכות.
    10. חותם הרחוב עמוק טוב עם קרום איטום לנשימה סטרילי. השתמש גלגלת לצלחת כדי להבטיח כי כל אדם טוב אטום כראוי.
    11. חזור על הליך עבור כל צלחת אגר.
    12. נגב את כל משטחי עבודה עם אתנול 70% לאחר טיפול ערכת PA14NR.
    13. לגדול חוסנו נוזלי תרבויות במשך 15-16 h ב 37° C-950 סל ד בעזרת מטרף במהירות גבוהה, אם הם זמינים.
      הערה: אם מטרף במהירות גבוהה אינה זמינה, דגירה של בלוקים עמוק היטב בשייקר-250-300 סל ד זה ריאלי. עם זאת, יש סיכוי גדול יותר של המושבה הקטנה משתנים (SCVs)25 המתעוררים בתנאים חמצון נמוכה. לכן, מומלץ מאוד לשמור הדגירה פעמים מתחת לגיל 15-16 h גדל תרבויות בבלוקים עמוק טוב במהירויות נמוכות של שייקר. לא רצויים התפשטות SCVs בבארות מוטציה יכול לשנות מוטציה פנוטיפים בעת שימוש בספריה כדי לבצע מסכי גנטי.
      מסוימים בארות ערכת PA14NR מכילים מוטציות גדל/הלא-הגדלים לאט, חסר שיבוטים, או להכיל מדיה uninoculated. המיקום של בארות אלה נרשמו וכי ניתן למצוא בקובץ PA14NR משלימה להגדיר מידע בארות הכלולים בפרסום זה.
  3. יום 3: העברה של תרבויות לילה PA14NR להגדיר יעד לוחות
    1. נקה למינארי, להפעיל מפוח הוד למשך תקופה מינימלית של 10 דקות לפני תחילת העבודה. לנקות משטחים הוד וכל הפריטים להציב בשכונה באמצעות אתנול 70%.
    2. הדפס תוויות דבק עמיד למים (ראה קובץ משלים PA14NR הגדר תוויות עבור תבנית). הסר 96-ובכן צלחות פלסטיק עטוף בתוך תא למינארי. קילוף המבוססת צלחת תווית ולמקם אותו לאורך הקצה של הלוח הקרוב ביותר ל A1 H1 בארות של צלחת היעד. מעט להרים את המכסה של צלחת היעד ומניחים את התווית על הקצה התחתון כדי להציג תווית כאשר צלחת מכוסה עם מכסה.
    3. להכין 3.5 L של 60% גליצרול (v/v) ולחטא 20 דקות ב החיטוי.
    4. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה, מסיכה כדי להתמודד עם ערכת PA14NR. להסיר בלוקים עמוק טוב בשייקר במהירות גבוהה או שאכר רגיל.
    5. להעביר בלוקים באר למינארי סטרילי, הסר בזהירות לנשימה רפידה איטום. החלף את החותם אלומיניום. ספין-מטה רחובות באר במהירות נמוכה מאוד לאסוף עיבוי (30 שניות ב g x 50-150, ואז להאט quicky באמצעות צנטריפוגה בלם).
    6. להעביר בלוקים באר חזרה אל הוד סטרילי ולא באמצעות פיפטה אלקטרוניים µL 12-ערוץ 50-1200 ולהוסיף טיפים מסוננים סטרילי µL 525 של מיקס מרק נוזלי גליצרול/ליברות (בחלקים שווים LB נוזלי מרק ו- 60% גליצרול פתרון) כל טוב. מערבבים על ידי בעדינות pipetting 300 µL למעלה ולמטה 3 פעמים עם פיפטה אלקטרונית. לגעת טיפים לצד של היטב לפני הוצאת טיפים למניעת טפטוף. טיפים להוצאת ולהמשיך עם השורה הבאה, עד נעשה עם הבלוק טוב עמוק.
    7. באמצעות פיפטה חוזרות אלקטרונית ערוץ 12 טיפים מסוננים, כדי למנוע זיהום interwell במהלך aliquoting, תעלה 900 µL של תרבות מוטציה, לוותר על 150 µL כל לוחות 96-ובכן היעד כדי ליצור עותקים 6 של צלחת הספרייה. למנוע טיפות על-ידי נגיעה בקיר של הבארות עם טיפים לפני התחלת ההעברה של התרבות היעד לוחות. אם אין פיפטה חוזרת זמין, השתמש פיפטה רב-ערוצי כדי לשלול 150 µL לתוך כל הלוחות 6 96-ובכן, בטכניקה המתוארת לעיל כדי למנוע טפטוף.
    8. השתמש חותמות אלומיניום סטרילי כדי לכסות את הלוחות ולהשתמש גלגלת לצלחת לחלוטין חותם צלחת קצוות, כל בארות. ודא כי לא לכסות את התווית המזהה עם החותם אלומיניום. לא ללחוץ את לוחיות הרישוי, כפי תרבות עשוי תשפריץ על צידי הבארות או על החותם אלומיניום.
    9. הסר צלחות אטום צלחות הוד ומקום על דירה, אפילו משטח במקפיא-80 ° C.
    10. נגב את כל משטחי עבודה עם אתנול 70% לאחר טיפול הספרייה.
    11. לבצע בדיקות בקרת איכות אחרי השכפול ספריה ואחרי השימוש בספריה כדי לבצע מסכי גנטי (ראה פרוטוקול השלישי).

2. פרוטוקול II: טיפול ואחסון של מוטציות בודדות מסידרת PA14NR

  1. יום 1: מוטציה רצף של עניין
    1. לזהות את מיקום המוטציה עניין דרך http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS קישור PA14NR להגדיר או באמצעות הקובץ Nonredundant Library.xls שהורדו מה-http:// קישור pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi). רשום של אנטיביוטיקה הדרוש לבחירת כל מוטציה מסוימת (גנטמיצין או kanamycin).
    2. להכין מדיה אגר ליברות, עיקור אוטוקלב למשך 20-25 דקות, מגניב עד 55 מעלות צלזיוס בתוך המים הרותחים. הוסף גנטמיצין µg/mL 15 למוטאנטים המכילה הוספות transposon MAR2xT7 , 200 µg/mL kanamycin למוטאנטים המכילה הוספות transposonphoA Tn. יוצקים LB אגר מדיה על צלחות (צלחות עגולות או מלבניות הן נאותה). צלחות יבש בשכונה סטרילי כ 30 דקות עד h 1 לפני שימוש.
    3. אוטוקלב plasticware וכל ציוד שאינו סטרילי לפני השימוש.
    4. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה, מסיכה כדי להתמודד עם ערכת PA14NR. לנקות ספסל ונגב משטח עם אתנול 70% לפני שעבדה עם ערכת PA14NR.
    5. ליצור שדה סטרילי בעזרת מבער בונזן.
    6. הסר את לוחית 96-ובכן PA14NR להגדיר עם מוטציה של עניין מ-80 מעלות צלזיוס מקפיא, הניחו אותו על קרח יבש, לקחת קרח יבש מיכל לספסל, ולמקם בקצרה 96-ובכן צלחת מעל הספסל כדי לאפשר קלה מפשיר (כ 1-2 דקות).
      הערה: לשמור תיעוד של כל PA14NR להגדיר 96-ובכן הצלחות לגשת פס המוטנטים בודדים, כמו יותר גישה ללוחות הספרייה הוא מתואם עם סיכון גדול יותר עבור זיהום interwell.
    7. חותם אלומיניום חם ביד לפני פילינג זה ביטול, נזהר למנוע את החותם של ליטוש את הצלחת. השתמש פינצטה לקלף את כל שרידים של החותם אלומיניום.
    8. אתר המוטציה עניין בצלחת 96-ובכן. להשתמש או מקל עץ סטרילי או פיפטה סטרילי טיפ לבחור כמות קטנה של תרבות קפואים מתוך הפרט טוב המכיל החשבונאי של עניין.
    9. פס קפוא תרבות על צלחת אגר על מושבות מוטציה בודדת כדלקמן: מורחים בעדינות החיידקים על מקטע של צלחת כדי ליצור פס 1, באמצעות טריים, סטרילי עץ מקל או פיפטה טיפ, לגרור פס 1 ו מורחים את החיידקים על קטע שני הצלחת, כדי ליצור רצף של 2. באמצעות השלישי סטרילי עץ מקל או פיפטה טיפ, גרור דרך פס 2 ולהפיץ את החיידקים מעל המקטע האחרון של הצלחת, כדי ליצור רצף של 3.
    10. חותם מקור לוחית אלומיניום עקר חותם חדש. אל תגעו צד דבק של אלומיניום חותם בכל נקודה כדי למנוע זיהום. ודא כל באר וקצוות של צלחת אטום לגמרי באמצעות גלגלת לצלחת. צלחת החזרה 96-ובכן קרח יבש ולאחר מכן במקפיא-80 ° C.
    11. דגירה צלחת אגר חממה 37 º C למשך הלילה.
    12. נגב את כל משטחי עבודה עם אתנול 70% לאחר טיפול הספרייה.
  2. יום 2: צמיחה של מוטציה עניין במרק נוזלי ליברות
    1. להכין מרק LB נוזלי המכיל גנטמיצין µg/mL 15 או 200 kanamycin µg/mL, לפי transposon ההכנסה.
    2. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה ואת מסיכת לטפל aeruginosa פ.
    3. ברור משטח ספסל ולנגב עם 70% אתנול. ליצור שדה סטרילי בעזרת מבער בונזן.
    4. להעביר 3-5 מ ל ציר ליברות עם אנטיביוטיקה מתאימה לתוך צינור תרבות סטרילי עם כובע.
    5. שימוש של המוליך סטרילי או טיפ פיפטה סטרילי, לבחור מושבה בודדת של זן מוטציה, לחסן אותו לתוך המדיה ליברות.
    6. דגירה LB תרבויות נוזלי ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר-225-250 סל"ד למשך הלילה.
    7. נגב את כל משטחי עבודה עם אתנול 70% לאחר טיפול aeruginosa פ.
  3. יום 3: לאחסן mutant הריבית במקפיא-80 ° C
    1. Cryovial תווית עם שם המוטציות, אנטיביוטי להוסיף ציר LB ואת התאריך של אחסון.
    2. הכנת 500 מ"ל של 50% גליצרול (v/v) ולחטא ב החיטוי.
    3. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה ואת מסיכת לטפל aeruginosa פ.
    4. לנקות ספסל ו/או שיטפון למינריות הוד ונגב משטח עם 70% אתנול.
    5. הסר את שפופרת המכילה תרבות מוטציה של שייקר.
    6. להכין את מיכל קטן עם קרח יבש.
    7. השתמש תא למינארי או ליצור שדה סטרילי על גבי ספסל אתנול-ניגבתי עם מבער בונזן.
    8. להוסיף כמויות שוות של התרבות חיידקי והגליצרול 50% cryovial עם תוויות תוך שימוש בתנאים סטריליים, ומערבבים בעדינות עם פיפטה (נפח סופי 1-2 מ ל/בקבוקון בהתאם לגודל cryovials בשימוש). במקום cryovial על קרח יבש עד quick-freeze.
    9. Cryovial מקום בתיבה תווית במקפיא-80 ° C.
    10. למחוק את כל משטחי עבודה עם אתנול 70% לאחר טיפול aeruginosa פ.

3. פרוטוקול השלישי: בקרת איכות של PA14NR סט

  1. בחר קבוצה אקראית של מוטציות צלחות המשוכפל החדש כדי לזהות זיהום אפשרי interwell (בדיקה של 30-40 מוטציות מומלץ).
    הערה: במקרים שבהם יש צורך לאשר את זהותה של מוטציה בשימוש עבור אפיון גנים ספציפיים, מומלץ לבצע PCR amplifications באמצעות תחל גנים ספציפיים המיועדים הרצף ידוע של הגן המכיל הכניסה transposon. למרות יותר מאתגר, היתרונות של שימוש שרירותי PCR תחל במקום תחל PCR גנים ספציפיים כאשר amplyfing DNA שברים מוטציות transposon כוללת את קלות את היכולת לזהות הנוכחות של פוטנציאל ואישור מוטציה בקנה מידה גדול מזהמים. למטרות בקרת איכות, זה לא הכרחי להשיג איכות גבוהה PCR רצף נתונים באקראי slected מוטציות, כל עוד מספר מספיק של מוטציות מוקרנים להערכת שיעור שגיאה.
  2. בצע "פרוטוקול II", צובעות ולגדול זנים מוטציה.
  3. אוטוקלב plasticware וכל ציוד שאינו סטרילי לפני השימוש.
  4. לבודד דנ א גנומי בשיטה המועדפת. לניתוח שתואר בעבודה זו, ערכת בידוד דנ א גנומי היה מנוצל בעקבות הפרוטוקולים של היצרן. יכול להיות מנותח זנים מוטציה מרובים בו זמנית.
  5. מודדים את ריכוז הדנ א הגנומי באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume. להתאים את ריכוז הדנ א הגנומי כ-100 ng/µL.
  6. השתמש דנ א גנומי כתבנית כדי להפעיל "תגובה PCR1" כפי שמתואר בשלב 1 של טבלה 3, יצירת שברים Arb1 PCR (איור 3). תחל בשלב זה מפורטים בטבלה 4.
  7. להוסיף 0.5 µL של 10 x טעינת מאגר ל 5 µL של תגובה PCR1, לטעון לתוך ג'ל agarose 1.5-2% ולהפעיל את הג'ל-80-150 V.
    הערה: אורך קטע ספציפי או טווח קטע מסוים לא צפוי, הלהקה אחד או יותר רשאי להיות נוכח כפי ומהצמיגים שרירותי עלול להיקשר למספר מיקומים.
  8. השתמש דנ א מתגובה PCR1 כתבנית כדי להפעיל "תגובה PCR2" כפי שמתואר בשלב 2 של טבלה 3, יצירת שברים Arb2 PCR (איור 3). תחל בשלב זה מפורטים בטבלה 4.
  9. להוסיף 0.5 µL של 10 x טעינת מאגר ל 5 µL של תגובה PCR2, לטעון לתוך ג'ל agarose 1.5-2%, ולהפעיל את הג'ל-80-150 V.
    הערה: אורך קטע ספציפי או טווח קטע מסוים לא צפוי, הלהקה אחד או יותר רשאי להיות נוכח כפי ומהצמיגים שרירותי עלול להיקשר למספר מיקומים.
  10. שלח תגובה PCR2 יחד עם transposon ספציפיים המתאימים, למתחילים רצף.
  11. Analize רצף תוצאות byBLASTing אותם נגד הגנום PA14 מלאה באמצעות הקישור הפיצוץ מסופק באתר האינטרנט של הספרייה PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) או על-ידי פיצוץ אותם ישירות נגד רצף גנים ספציפיים החשבונאי של עניין.
    הערה: מידע על מוטציות שנבחרו ניתן למצוא על ידי חיפוש באתר PA14NR להגדיר (חיפוש http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS או הורדה Library.xls Nonredundant קובץ מ http:/ הקישור / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

Figure 3
איור 3: PCR הגברה ורצף של מוטציות ההכנסה transposon. הצג סכימתי של שלבים מעורב הגברה PCR ורצף לצורך אימות זהות מוטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגדרת תגובת ה-PCR
שלב 1 שלב 2
תגובת PCR1 : תגובת PCR2 :
23.25 µL מים (ביולוגיה מולקולרית כיתה) 19.15 µL מים (ביולוגיה מולקולרית כיתה)
3µL 10 x. אנזימים מאגר µL 5 10 x. אנזימים מאגר
0.5µL אנזימים 0.6 µL. אנזימים
0.625 µL 20 מיקרומטר פריימר Arb1D (טבלה 4) 0.625 µL 20 מיקרומטר פריימר Arb2A (טבלה 4)
0.625 µL 20 מיקרומטר ספציפי transposon פריימר (PMFLGM. GB 3a או Tn5Ext) (טבלה 4) פריימר Transposon ספציפיים 0.625 mL 20 מיקרומטר (PMFLGM. GB 2a או Tn5Int2) (טבלה 4)
1 dNTPs 10 מ מ µL 1 dNTPs 10 מ מ µL
1 µL הדנ א, 100 ng התגובה PCR1 5 µL
נפח התגובה האחרונה 30 µL נפח התגובה האחרונה 30 µL
הגדרות תגובת ה-PCR
PCR1 Thermocycler תנאים: PCR2 תנאי Thermocycler:
95 ° C – 2 דקות 95 ° C – 2 דקות
חזור 5 מחזורים: חזור מחזורים:
95 ° C – 30 s 95 ° C – 30 s
30 ° C-1 דקות 54 ° C – 30 s
72 ° C – 1 דקות 72 ° C – 1.5 דקות
חזור מחזורים: 72 ° C – 10 דקות
95 ° C – 30 s 4 ° C – החזק
45 ° C – 30 s
72 ° C – 1 דקות
72 ° C – 10 דקות
4° C – החזק

טבלה 3: PCR thermocycler הקמה תנאי ריאקציה המשמש PCR שרירותי. תגובות PCR שרירותי מתבצעות ברצף, קטעים שנוצרו במהלך התגובה PCR1 משמשות כתבנית בתגובה PCR2. הגדרות ספציפיות thermocycler משמשות עבור כל ערכה של תגובות.

פריימר שם פריימר רצף
MAR2xT7 Transposon ספציפיים תחל
PMFLGM. GB-3a TACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2a TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon רצף פריימר
PMFLGM. GB-4a GACCGAGATAGGGTTGAGTG
TnphoA ספציפי Transposon Primers
Tn5Ext GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2 GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TnphoA Transposon רצף פריימר
Tn5Int CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
צבעי יסוד שרירותי
ARB1D GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2A GGCCAGGCCTGCAGATGATG

בטבלה 4: רשימת תחל להשתמש בבקרת איכות ניסויים. תחל המשמש עבור הגברה PCR ורצף של מוטציות transposon הכניסה כדי לאשר את הזהות מוטציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

12 עותקים חדשים של ערכת PA14NR היו משוכפלות באמצעות פרוטוקול ואני הערכה בקרת איכות של העותקים החדש שנוצר נערך באמצעות פרוטוקול השלישי.

PA14NR להגדיר לוחות מוטציה יחד עם לוחות בקרה, המורכבים מסקטור פראי סוג PA14 מחוסן, uninoculated בארות intercalated ב כקביעת דוגמת מילוי (איור 4A), היו משוכפלות בעקבות methology תיאר פרוטוקול אני שולט צלחות כלולים PA14NR קבע להעריך אפשרות הידבקות interwell בעת ביצוע שכפול צלחת. בנוסף, ניתן להשתמש בקרת לוחות תרגול טכניקות שכפול לפני שתיכנסו צלחות המכיל transposon ההכנסה מוטציות. הצמיחה של לוחות הבקרה היה נבדק מבחינה ויזואלית לאחר שכפול על פלטות אגר ליברות, דגירה לילה כדי להבטיח הנוכחות של דפוסי הצמיחה הצפויה (איור 4B). נוכחות או היעדרות של התפתחות חיידקים בבלוקים עמוק טוב מחוסן עם שליטה בצלחת 1 הוערך על-ידי קריאת OD600 ב ספקטרופוטומטרים לאחר דגירה לילה. תוצאות המחקר הראו צמיחה משמעותי פראי סוג PA14 מחוסן בארות, העדר צמיחה הבארות uninoculated (איור 4C). למרות שהיה קצת השתנות בבית הגידול של פראי סוג PA14 התרבויות, הייתה העדר צמיחה הבארות uninoculated (איור 4D).

שלושים ושמונה מוטציה זנים נבחרים באופן אקראי מאחד מן ההעתקים החדש שנוצר של ערכת PA14NR נותחו על ידי קביעת רצף שברי DNA שנוצר על ידי ה-PCR שרירותי. תגובות PCR שרירותי בוצעו כדי להגביר את שברי DNA האזורים שסביב transposon הוספות של המוטציות 38 שנבחרו, שברי PCR שהושג לאחר מכן היו וסודרו. דוגמה של שברי PCR שהושג לאחר ה-PCR הגברה של מוטציות ההכנסה transposon נפרדות תשעה מוצג באיור5. כפי חישול של צבעי יסוד שרירותי מתרחשת באופן אקראי, לא ניתן לחזות אורך קטע. כאשר להקות היו גלויים, תגובות PCR חזרו על עצמן. זהותו של הוספות transposon הכלול המוטציות 38 ניתח נמצאה באמצעות הקישור PA14 Transposon ההכנסה מוטציה ספריה (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) כדי לבחור את צבעי בסיס צורך לבצע PCR שרירותי תגובות.

רצף תוצאות שהתקבלו החשבונאי 38 זנים היו פוצץ נגד הגנום המלא של זן PA14 באמצעות הפיצוץ הלינק המסופק באתר האינטרנט של הספרייה PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi). רצף תוצאות של מוטציות שנבחרו באקראי היו מיושרים גם נגד רצפי הגן שמשקף כל מוטציה בודדת (שהושג בעזרת PA14NR להגדיר צלחת חיפוש הכלי מיקום על ה-http:// באתר ספריית PA14NR pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS). היישורים רצף בוצעו באמצעות הכלי יישור רצפים נוקלאוטיד הפיצוץ שסופקו על-ידי NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? עמוד = MegaBlast & תוכנית = blastn & BLAST_PROGRAMS = megaBlast & PAGE_TYPE = BlastSearch & BLAST_SPEC = blast2seq & מסד הנתונים = n/a & שאילתה = & נושאים =).

שתי המוטציות 38 נבחרת באיכות נמוכה שנוצר רצף תוצאות, כנראה בגלל תכולה גבוהה GC באזור המכיל את הכניסה transposon, והמערכת לא ניתן לנתח עוד יותר. רצף תוצאות 35 של המוטציות בהצלחה וסודרו 36 התאימה את רצפי הגנים המתאימים המוטציות PA14NR להגדיר שנבחרו. רק אחד הרצפים 36 נכשלה שיתאים לרצף של הגן המתאים החשבונאי שנבחרו. עם זאת, לא נקבע אם אי-התאמה זו נבעה בעיה כי אירעה במהלך שכפול עותקים חדשים של ערכת PA14NR או שניתן היה לייחס את % 2.8 המטעות שגיאה מוערך קודם לכן עבור PA14NR להגדיר37.

Figure 4
איור 4: PA14NR להגדיר לוחות הבקרה. א) הפריסה של PA14NR להגדיר לוחות בקרה 1 ו- 2. B) תמונה של לוחות הבקרה PA14 ע נ קבע 1 ו- 2 משוכפלים על אגר ליברות (תצוגה מלמעלה צלחת אגר). התפתחות חיידקים ג) ממוצע (+ /-SD) הנמדד בבארות חוסנו ואת uninoculated של שליטה בצלחת 1 לאחר דגירה לילה בבלוק עמוק טוב. קריאות בוצעו על יתר600. ד) התפתחות חיידקים הנמדד בבארות חוסנו ואת uninoculated של שליטה בצלחת 1 לאחר דגירה לילה בבלוק עמוק טוב. קריאות בוצעו על יתר600 בבארות בודדים. אפילו עמודות תואמות מדידות שבוצעו בבארות uninoculated; מוזר עמודות תואמות מדידות שבוצעו בבארות מחוסן-PA14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: שברי PCR1 ו- PCR2 המתקבל הגברה תגובות. דוגמה של קטעים שהושג באמצעות PCR שרירותי הגברה תגובות. רסיסים הנמצאים בסמטאות 1-9 שיתאימו מוטציות שונות שנבחרו באופן אקראי כדי לבצע בקרת איכות של PA14NR להגדיר משוכפלות צלחות. עם אמא: סמן הדנ א משקל מולקולרי. הגדלים DNA MWM בסיסים.
PA14NR להגדיר זנים המוטציות שנבדקו: ליין 1: 07_4 A10, ליין 2: 07_4 B4, ליין 3: 08_1 C3, ליין 4: 08_1 H6, ליין 5: 08_3 G10, ליין 6: 08_4 B8, ליין 7: 08_4 H3, ליין 8: 09_2 D12, ליין 9 : 09_2 G5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P. aeruginosa PA14NR הינו משאב יקר ערך עבור הקהילה המדעית. לפי לערכת 2017/03 ממסד חיוני אינדיקטורים המדע של Clarivate Analytics,. Liberati et al. (2006) 37, אשר מתאר את בניית ערכת PA14NR, היא מדורגת במקום 1% העליונים של מיקרוביולוגיה פרסומים. Google Scholar דוחות. מעל 600 אזכורים של. Liberati, et al. (2006) לכתב היד המקורי החל באוגוסט 2017. הספרייה שיחק תפקיד חשוב שחקרתי המנגנונים aeruginosa פ פתוגנזה. חשוב, פורמט צלחת 96-ובכן ערכת PA14NR מקלה על תפוקה גבוהה גנטי מסכים המיועדים ללמוד מגוון רחב של P. aeruginosa פנוטיפים מוטציה44,45,46. כמו ערכת PA14NR זמין להפצה, יש להשתמש באמצעי זהירות מיוחדים כדי לשמור על השלמות של משאב זה.

מספר פרסומים להפגין את. התועלת באמצעות ערכת PA14NR גנטי מסכי37,38,47,48. לדוגמה, כמו מבחן הראשונית של השירות של הספרייה, Liberati. ואח שבוצעה מסך מצורף PVC (פוליוויניל כלוריד), אשר עולה בקנה אחד עם יכולתו של החיידק על טופס biofilms37,38, 47 , 48. התבנית של הספרייה מאפשרת גם המחקר של תכונות גנטיות מורכבים כגון שורצים תנועתיות, שמעידים הזיהוי של מאות גנים עניין ב- מסך פשוט48. ערכת PA14NR היה בשימוש גם מסך מבוססי ספקטרומטר מסה MALDI-TOF בקנה מידה גדול כדי לרכוש, ספקטרה פרופיל שלם-תא פרוטאום והערכת האפקטיביות של MALDI-TOF Biotyping47. החלת טכניקה זו, החוקרים הצליחו לקבוע אם ההבדלים גנומית משניות, כגון אלה הנובעים transposon הוספות, שחצנית למאמצים biotyping אשר משמשים בסביבות קליניים וטיפוליים. בנוסף, ערכת PA14NR שימש לביצוע מסך הגנום כולו עבור הנחתה של התקפה אלימה PA14 במודל זיהום של C. elegans , המאפשר הזיהוי בעבר uncharacterized גנים הקשורים התקפה אלימה aeruginosa פ 38, ובכך מספק דוגמה של השימוש בספריה PA14 ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי.

ערכת PA14NR משמש גם משאב חשוב עבור המחקר של מוטציות בודדות. כדי למנוע זיהום של הספרייה, לגישה מוטציות עניין המומלצות. כי הטיפול של ספריית מעלה את האפשרות של זיהום, מומלץ לאחסן מוטציות עניין בבקבוקונים בודדים כדי להגביל גישה עבודה PA14NR להגדיר, מאסטר עותקים. זה מונע זיהום, משפר את תוחלת החיים של הספרייה, מגן על ההשקעה.

על מנת לשמור על השלמות של המשאב החשוב PA14NR להגדיר, מומלץ כי כל הנמענים של ערכת PA14NR ליצור עותקים של הספרייה עם קבלת. למרות המאמצים פוטנציאל זיהום בהיסח הדעת במהלך הליכי שכפול לא ייכללו. לכן, מומלץ מאוד שאת בקרת איכות מלאה משתמשים בודק אחרי השכפול ספריה ואחרי השימוש בספריה כדי לבצע מסכי גנטי. מומלץ מאוד גם כי המשתמשים ליצור עותקים נוספים של ערכת PA14NR לבצע מסכי גנטית כמו ההסתברות של זיהום interwell גדל. בנוסף, עותקים ספריית המשמש לביצוע יותר מ 2-3 מסכי גנטי צריך להיות נתון בקרת איכות מקיפה הערכות. למרבה הצער, אין שום דרך נאותה לשחזר ספריות לחוות אובדן של שיבוטים או interwell זיהום. חייב להיות מושלך עותקים פרוצים או מזוהמים. כתוצאה מכך, מומלץ כי למשתמשים לשכפל מספר עותקים של הספרייה לשימוש מעבדה שגרתיות, בהתחשב בעובדה החיים השימושיים של עותק היא מוגבלת. גם מומלץ למשתמשים להגביל את הגישה "העותק הראשי" כדי לשמור על השלמות של ערכת PA14NR.

הפרוטוקולים המובאת כאן מספקים הסבר מפורט של טכניקות שכפול, כולל הקמה, פרוטוקולים של שיטות עבודה מומלצות. הפרוטוקולים לשכפול המתוארות עבור ערכת PA14NR ניתן להתאים להפיק עד 12 עותקים של הספרייה, ניתן גם ברצון להתאים שכפול ספריות מוטציה חיידקי אחרות. לפי מיטב ידיעתנו, ישנם פרוטוקולים שפורסם לא זמין עד כה עם תיאורים מפורטים של נהלים, טכניקות המשמשות עבור שכפול, תחזוקה, אימות של ספריות מוטציה חיידקי. אנו מקווים שפרוטוקולים אלה תספק למשתמשים של ערכת PA14NR וספריות אחרות חיידקים מוטנטים עם המידע הדרוש לבצע משימות חשובות אלה.

אם הספריה משמשת עבור מסכי תפוקה גבוהה או כמקור עבור מוטציות בודדות, חשוב להעריך את התקינות של העותק בשימוש מעת לעת. כדי לעשות זאת, אילוף של אנשי והערכה מחדש שכפול או מוטציה טכניקות הבחירה צריכה להיעשות מעת לעת. השימוש PA14NR להגדיר לוחות הבקרה ואת הביצועים של הגברה PCR שגרתית, רצף של מוטציות אקראיות כדי לאשר את הזהות שלהם מומלץ מאוד. . Liberati el al... (2006) 37 העריך כי 2.8 אחוז המספר הכולל של מוטציות בערכת PA14NR היה לתווית שגויה, אשר מדגיש את הצורך רצף ספציפי transposon מוטציות כדי ליצור מוטציות במסגרת מחיקה לפני שמתחילים בכל מחקר מקיף ו/או פרסום מחקרים. גנים ספציפיים. בהתחשב פרוטוקולים נכונה ופעולות שירות עבור ספריית שכפול וברירה של מוטציות בודדות ללימוד נוסף, ערכת PA14NR יתרום להבנת פתוגניות aeruginosa פ ושיפור התוצאות הקליניות לאלו שנדבקו מטופלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים כספיים. אליאנה Drenkard ו פרדריק Ausubel השתתפו ביצירת ספריית מוטנטים של nonredundant transposon PA14. בריאן הארלי, היידי באש Lael-חרוד כיום בית ולהפיץ את ספריית מוטנטים כחלק מחלקת ילדים בבית החולים הכללי במסצ'וסטס.

Acknowledgments

ברצוננו להודות ליסה Philpotts של הספריה הווירטואלית טריידוול MGH להנחיה שלה חפש את מסד הנתונים. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד סיסטיק פיברוזיס (YONKER16G0 ו- HURLEY16G0) NIH NIAID (BPH ואייד: R01 A1095338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. Foundation, C. F. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report. , Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016).
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 135 Pseudomonas aeruginosa transposon המלח ספריית מוטנטים מוטגנזה מכוונת מיקרוביולוגיה זיהום סתגלני אימונולוגיה
שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של <em>Pseudomonas aeruginosa</em> זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu,… More

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter