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Immunology and Infection

Replicação do requisitado, biblioteca não redundante de estirpe Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon mutantes de inserção

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57298
* These authors contributed equally

Summary

Pseudomonas aeruginosa infecção causa morbidade significativa em hosts vulneráveis. A biblioteca de mutantes de inserção transposon não redundante da estirpe de p. aeruginosa PA14, designado como PA14NR definida, facilita a análise da funcionalidade do gene em inúmeros processos. Apresentado aqui é um protocolo para gerar cópias de alta qualidade da biblioteca mutante PA14NR definido.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa fenotipicamente e Leishmania diversificada e adaptável onipresente em ambientes humanos. P. aeruginosa é capaz de formar biofilmes, desenvolver resistência aos antibióticos, produzem fatores de virulência e evoluir rapidamente no decurso de uma infecção crônica. Assim, p. aeruginosa pode causar tanto aguda e crônica, difícil de tratar infecções, resultando em morbidade significativa em certas populações de pacientes. Estirpe de p. aeruginosa PA14 é um humano isolado clínico com uma estrutura de genoma conservada que infecta uma variedade de hospedeiros mamíferos e nonvertebrate fazendo PA14 uma estirpe atraente para estudar este patógeno. Em 2006, uma biblioteca de mutantes de inserção do transposon não redundante contendo 5.459 mutantes correspondente previsto 4.596 PA14 genes foi gerada. Desde então, a distribuição da biblioteca PA14 permitiu a comunidade de pesquisa compreender melhor a função de genes individuais e complexos caminhos de p. aeruginosa. Manutenção da integridade da biblioteca através do processo de replicação requer técnicas adequado manuseio e precisas. Para o efeito, este manuscrito apresenta protocolos que descrevem detalhadamente as etapas envolvidas em replicação de biblioteca, biblioteca de controle de qualidade e armazenamento adequado dos mutantes individuais.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa fenotipicamente e Leishmania diversificada e adaptável presente no solo, água e ambientes mais humanos, bem como a microflora da pele. Comparado a muitas espécies bacterianas, p. aeruginosa tem um genoma relativamente grande de 5.5-7 Mbp com conteúdo de alto G + C (% de 65-67). Além disso, uma parte significativa dos seus genes estão envolvida na adaptabilidade metabólica e fazem parte de redes de regulação, permitindo uma grande flexibilidade em resposta ao estresse ambiental1. P. aeruginosa expressa uma infinidade de fatores de virulência, apresenta tendência para a forma de biofilmes, possui a habilidade de coordenar as respostas através do quórum de múltiplos caminhos de detecção e exibe uma notável capacidade de desenvolver resistência aos antibióticos e tolerância de2,3,4,5,6,7,8. Esses atributos apresentam desafios significativos no tratamento de infecções causadas por p. aeruginosa.

Crônica infecções de p. aeruginosa podem ocorrer em vários Estados da doença. Fibrose cística (CF), uma doença genética causada pela mutação do gene da Fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) , resulta em secreções infectadas, inspissated dentro das vias aéreas, bronquiectasias progressiva e, finalmente, morte de insuficiência respiratória9. Pela idade adulta, a maioria dos pacientes com FC é cronicamente infectada com p. aeruginosa, que desempenha um papel fundamental na morbilidade e mortalidade associadas a esta doença10. Além disso, pacientes com lesões de queimadura grave11, traqueostomia12, as artroplastias13ou permanência de cateteres14 correm o risco de infecção p. aeruginosa , relacionada com a capacidade das bactérias para formar biofilmes e fuga de acolhimento respostas inflamatórias15. Além disso, colonização ocorre sem concorrência depois uma população tolerante ou resistente aos antibiótico multi é selecionada através do tratamento antimicrobiano de largo espectro, sequencial12,16,17 , 18. melhor compreensão da patogênese de p. aeruginosa terá implicações significativas para inúmeros Estados de doença.

Vários isolados clínicos de p. aeruginosa , incluindo cepas PAO1, PA103, PA14 e PAK, têm sido muito estudados para investigar diferentes características de p. aeruginosa patogênese. Estirpe PA14 é uma clínica isolada que pertence a um dos grupos clonal mais comum no mundo19,20 e não tem sido extensivamente passada no laboratório. PA14is altamente virulento em vertebrados modelos de infecção, com uma notável endotoxina perfil21, pili estrutura22, patogenicidade dos consoles23, tipo sistema do secretion de III (TTSS), citotoxicidade para mamíferos células24 e perfis em antibióticos de resistência e persistência25. Além disso, PA14 também é altamente virulento em numerosos sistemas de modelo do patógeno-hospedeiro, incluindo folha de planta infiltração modelos26,27, infecçãoCaenorhabditis elegans modelos28, 29, inseto modelos30,31, bem como pneumonia rato modelos32,33 e34modelos de queimadura da pele.

Bibliotecas de todo o genoma mutantes são coleções de mutantes isogénicas nos genes não essenciais que constituem ferramentas muito poderosas para compreender a biologia de um organismo, permitindo que a análise da função do gene em escala genômica. Dois perto de-saturação transposon inserção mutante bibliotecas construídas em p. aeruginosa estão atualmente disponíveis para distribuição. Os locais de inserção dos transposões foram determinados para ambas as bibliotecas. Essas bibliotecas não redundante chamadas facilitam estudos de todo o genoma de cepas bacterianas, diminuindo consideravelmente o tempo e custo envolvidos na triagem descaracterizada mutantes transposon aleatório. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteca, construída no MPAO1 isolar de estirpe PAO1 usando transposões ISphoA/ ha e élacZ/ ha35, é comissariada pelo laboratório Manoil, Universidade de Washington. A biblioteca consiste em uma coleção de 9.437 mutantes transposon sequência-verificado que oferece cobertura ampla do genoma e inclui dois mutantes para a maioria dos genes36. Informações sobre a p. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteca estão disponíveis para o site do laboratório Manoil público, acessível pela internet em http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. A p. aeruginosa estirpe PA14 não redundante transposon inserção mutante biblioteca (conjunto PA14NR) construída em tensão PA14 usando transposões MAR2xT7 e TnphoA37 atualmente é distribuída pelo departamento de Pediatria hospital geral de Massachusetts. O conjunto PA14NR é composto por uma coleção de mais de 5.800 mutantes com inserções de transposon único em genes não essenciais37. Detalhes sobre a construção do Set PA14NR são descritos no http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB local público, acessível pela internet, que também contém uma variedade de ferramentas de busca on-line para facilitar o uso da PA14NR Conjunto.

O conjunto original de PA14NR composta por 5.459 mutantes, selecionados a partir de uma biblioteca abrangente de aproximadamente 34.000 transposon aleatório inserção mutantes, que correspondem a 4.596 genes PA14 previstos, representando 77% do PA14 previu todos os genes37. Desde a construção da biblioteca em 2006 foram adicionados novos mutantes, e atualmente o conjunto de PA14NR inclui mais de 5.800 mutantes38 que representam aproximadamente 4.600 PA14 genes. A maioria dos mutantes transposon PA14 foram gerada no selvagem tipo fundo37. Pormenores relativos a cada membro da biblioteca mutante, incluindo a base genética, estão disponíveis através de pesquisa de banco de dados on-line ou baixando a planilha de biblioteca não redundante, ambos os recursos disponíveis no site PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). A maioria dos mutantes foram criada usando o MAR2xT7 transposon (MrT7), com um pequeno conjunto criado usando o TnPhoA (phoA) transposon37. Cada transposon tem uma gaveta de resistência aos antibióticos, o que permite a seleção de mutantes usando gentamicina (MrT7) ou canamicina (phoA). O conjunto de PA14NR de mutantes é armazenado em sessenta e três placas de 96 poços e inclui controle de 96 poços adicionais duas placas, que consistem de tipo selvagem PA14 inoculadas e não inoculados poços intercalados em um padrão predefinido. O formato da placa de 96 poços emparelhado com as ferramentas de busca on-line muito facilita o desenvolvimento personalizado de ensaios que permitem aos usuários facilmente identificar genes associados com fenótipos mutantes de triagem. As ferramentas de busca on-line também facilitam a busca e seleção de mutantes de relevantes adicionais necessários para estudos adicionais.

As bibliotecas de mutante de transposon PA14 e PAO1 são muito importantes recursos globais para a comunidade científica, e eles se complementam na validação da função dos genes desconhecidos e os caminhos deste patógeno bacteriano. Coincidentemente, desde a construção das bibliotecas de mutação transposon PAO1 e PA14, análise de sequenciamento de DNA completo-genoma dos muitos isolados de p. aeruginosa mostrou que PAO1 e PA14 pertencem a diferentes subclados principais do P. aeruginosa 7,de filogenia39,40,41. Porque isolados clínicos de p. aeruginosa são encontrados distribuídos em toda a filogenia, o fato de que PAO1 e PA14 pertencem a diferentes p. aeruginosa subgrupos aumenta o valor das duas bibliotecas de mutação transposon para comparativo estudos.

Publicações descrevendo a construção e seleção de bactérias mutantes bibliotecas, incluindo p. aeruginosa bibliotecas35,,37,42, estão prontamente disponíveis na literatura. No entanto, o melhor de nosso conhecimento, não há protocolos publicados descrevendo os procedimentos detalhados e técnicas usadas para replicação, manutenção e validação das bactérias mutantes bibliotecas estão disponíveis.

A metodologia descrita nesta publicação descreve um conjunto de três protocolos que facilitam o uso e manutenção do PA14NR Set. O primeiro protocolo descreve a replicação da biblioteca como recomendado aos destinatários da PA14NR Set. O segundo protocolo inclui diretrizes para estrias, crescendo e armazenar individuais mutantes identificados usando o conjunto de PA14NR. O terceiro protocolo descreve técnicas de controle de qualidade, incluindo a amplificação por PCR de fragmentos de mutantes transposon e posterior sequenciamento para confirmar identidade mutante. Este conjunto de protocolos também pode ser adaptado para a replicação e a manutenção de outras bibliotecas mutantes bacterianas ou coleções. A replicação de bactérias mutantes bibliotecas ou coleções é altamente recomendada para preservar a integridade da cópia do"mestre" (cópia original recebida). Replicação de várias cópias do conjunto de PA14NR para uso em laboratório de rotina minimiza a probabilidade de contaminação interwell da cópia mestre.

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Protocol

Atenção: Utilize padrão BSL-2 medidas de segurança ao manusear a p. aeruginosa, um patógeno humano. Se você é um indivíduo imunocomprometido ou tem qualquer condição médica que aumenta sua susceptibilidade à infecção bacteriana, tome cuidado especial ao trabalhar com P. aeruginosa. Consulte o escritório de biossegurança na sua instituição e obter a aprovação do seu médico antes de trabalhar com o o PA14 NR definido ou bibliotecas mutantes de patógenos bacterianos.

Figure 1
Figura 1: visão geral da replicação i: protocolo do PA14NR definido. Dia 1: Replicar congeladas culturas mutantes de "cópia master" de PA14NR definida em meios de ágar LB e crescer mutantes durante a noite a 37 ° C. Dia 2: Transferência de crescimento mutante de media LB ágar para profundo bem blocos contendo líquido caldo LB, crescer durante a noite a 37 ° C, com agitação a 950 rpm. Dia 3: Misturar culturas LB durante a noite com glicerol e, em seguida, transferir para placas de 96 poços destino para armazenamento a longo prazo. Lugar de 96 poços chapas plana no congelador-80 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: recomendado instalação. Esterilidade e suave fluxo de trabalho devem ser mantidas através do uso de precauções apropriadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. protocolo i: replicação de PA14NR o conjunto

Nota: A replicação da biblioteca pode ser alcançada dividindo-se o conjunto de PA14NR nas quatro subconjuntos de dezesseis placas cada que podem ser processados em quatro semanas consecutivas. Geração de 1 a 6 cópias adere ao fluxo de trabalho semanal, descritas na tabela 1, enquanto a geração de mais de 6 cópias segue o fluxo de trabalho semanal, descrito na tabela 2. Para gerar 12 cópias do conjunto de PA14NR, de inocular o mesmo subconjunto de PA14NR em meio LB líquido no dia 2 e novamente no dia 3 (a partir do mesmo conjunto de placas de ágar replicada em 1 dia) e transferência pernoite culturas mutantes em chapas de cópia no dia 3 e dia 4 respectivamente.

Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3
Dia da preparação Crescimento de mutantes PA14NR definido em meios de ágar LB Crescimento de mutantes PA14NR definida em meio líquido LB Transferência de culturas mutantes PA14NR definido para placas de destino

Tabela 1: cronograma para replicação de 1-6 cópias do conjunto de PA14NR de. Replicação de um pequeno número de cópias pode aderir a um fluxo de trabalho semanal.

Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Dia da preparação Crescimento de mutantes PA14NR definido no ágar LB Crescer de mutantes PA14NR definida em meio líquido LB Transferência de culturas mutantes de dia 3 para gerar 1 conjunto de 6 cópias do conjunto de PA14NR Transferência de culturas mutantes dia 4 para gerar 2º conjunto de 6 cópias do conjunto de PA14NR
Crescimento de mutantes PA14NR definida em meio líquido LB

Tabela 2: cronograma para replicação de até 12 cópias do conjunto de PA14NR de. Replicação de um maior número de cópias exigirá camadas dentro de um fluxo de trabalho semanal.

  1. Dia 1: Crescimento de PA14NR conjunto mestre cópia em placas de ágar LB
    1. Use luvas, jaleco e máscara para manipular o conjunto de PA14NR.
    2. Limpar a bancada e limpe a superfície com etanol a 70%.
    3. Preparar LB ágar mídia43 e esterilizar em autoclave pela mídia legal de 25 min. a 55 ° C na água do banho e acrescentar ou gentamicina 15 µ g/mL, para mutantes contendo inserções de transposon MAR2xT7 , ou 200 canamicina µ g/mL, para mutantes contendo TnphoA inserções.
    4. Despeje fundido LB ágar em placas retangulares usando aproximadamente 60 mL de mídia por placa. Chapas secas em uma capa estéril para aproximadamente 1 h antes de usam. Certifique-se que não há nenhuma condensação de água na superfície do ágar. Armazenar as placas a 4 ° C, se necessário.
    5. Criar um campo estéril com um bico de Bunsen na bancada de etanol-limpou e configurar recipientes com soluções adequadas para a esterilização de pino replicator (consulte a etapa 1.1.9). Uso abrir recipientes plásticos (5.25" L x 4,25" W x 1.75 "H tamanho aproximado) para esterilização de pino replicator. Recipientes de plástico de autoclave antes de usar.
      Nota: O calor da chama de Bunsen cria uma convecção atual, que se aquece o espaço acima da chama e elevadores de partículas no ar e longe do ar mais frio por baixo, mantendo a área de trabalho estéril.
    6. Retire um máximo de quatro placas de mestre PA14NR conjunto do freezer-80 ° C (para evitar descongelamento desnecessário) e coloque-os em gelo seco em panela de gelo 4L.
    7. Pegue a placa de 96 poços mestre para ser replicado do gelo seco e colocá-lo no banco para permitir breve degelo, que só vai levar o tempo necessário para a esterilização dos pinos replicator (aproximadamente 3-4 min) (consulte a etapa 1.1.8). Marca a posição da A1 coordenada na placa de ágar antes do carimbo. Alinhe a placa mestra e placa de ágar com a coordenada de A1 de ambas as placas no canto superior esquerdo.
    8. Esterilize o replicador "pinos", seguindo os passos descritos abaixo. Torneira replicator ligeiramente depois de cada passo para remover o excesso de líquido.
      1. Mergulhe os pinos em 250 mL de 0,3-0,5% de hipoclorito de sódio (10% de alvejante doméstico) por 30 segundos. Minimize o contato com solução de hipoclorito de sódio, pois pode levar a danos de pinos. Mergulhe os pinos em 250 mL estéril ddH2O ou água ultrapura esterilizada durante 10 segundos, em seguida, em 250 mL de etanol a 70% por 30 segundos, em seguida, em 250 mL de etanol a 95% por 2 min.
      2. Chama esterilizar pinos replicator segurando replicator perpendicularmente para a chama do bico de Bunsen, lentamente se aproximando chama até etanol inflama e, em seguida, retirá-la imediatamente do fogo. Chama apaga-se uma vez todas as queimaduras do etanol fora. Uma tampa ou recipiente similar manter por perto para sufocar as chamas de etanol, se necessário.
        Nota: Muito cuidado quando trabalhar com etanol perto de uma chama. Não segure replicator diretamente sobre a chama.
      3. Legais pinos fixando-se em um prato retangular estéril não utilizado que contém a mídia LB ágar durante 30 segundos.
    9. Brevemente alumínio quente do mestre PA14NR definir a placa do selo com a mão antes descascando. Fazer isso enquanto pinos replicador de refrigeração. Remova o selo de alumínio com cuidado para evitar que o selo retoque a placa. Use uma pinça Retire todos os restos do selo de alumínio.
    10. Inserir replicator pinos placa mestra, empurrando suavemente e replicator balançando em todas as quatro direções para garantir que os pinos fazem contato com culturas bacterianas congeladas em cada um dos 96-poços. Preste atenção extra para poços localizados na borda externa da placa empurrando pinos replicator contra culturas congeladas nos poços localizados na borda da placa.
    11. Coloque delicadamente pinos replicator na superfície da placa de ágar. Mova o replicador em um ligeiro movimento circular de forma minigramados de aproximadamente 4-5 mm para cada estirpe mutante. Evite a possibilidade de que o minigramados podem sobrepor-se, para evitar a contaminação cruzada.
    12. PA14NR conjunto placa mestre do selo com um novo selo de alumínio estéril. Não toque o lado adesivo do selo de alumínio em qualquer ponto para evitar a contaminação. Certifique-se de que cada poço e as bordas da placa são completamente seladas usando um rolo de chapa. Placa de retorno de 96 poços de gelo seco.
    13. Repita o procedimento para cada placa mestra.
    14. Limpe todas as superfícies de trabalho com etanol a 70% após manusear o PA14NR definido.
    15. Transferência replicados placas de ágar para 37 ° C incubadora e incubar durante uma noite.
  2. Dia 2: Crescimento da cópia mestre de PA14NR definido no líquido caldo LB
    1. Prepare LB caldo líquido43 contendo gentamicina ou 15 µ g/mL, para mutantes contendo inserções de transposon MAR2xT7 , ou 200 canamicina µ g/mL, para mutantes contendo inserções dephoA Tn.
    2. Limpar a capa do fluxo laminar de equipamentos desnecessários e ligue o ventilador exaustor para um mínimo de 10 min antes de iniciar o trabalho. Limpe as superfícies de capuz e todos os itens colocados no bairro usando etanol a 70%.
    3. Preencha blocos de poço profundo 2ml com 525 µ l de caldo líquido de LB contendo antibióticos apropriados no capô de fluxo laminar, usando uma pipeta eletrônica de 12 canais 50-1200 µ l. Em seguida, transferi blocos de fundo bem cheio de mídia para etanol-limpou a bancada. Reutilize dicas desde que sejam respeitadas as estéreis.
    4. Use luvas, jaleco e máscara para lidar com PA14NR definido.
    5. Limpar a bancada e limpe a superfície com etanol a 70%.
    6. Traz placas de ágar com cepas mutantes crescidas durante a noite para a bancada.
    7. Criar um campo estéril com um bico de Bunsen na bancada de etanol-limpou e configurar recipientes com soluções adequadas para a esterilização de pino replicator (ver próximo passo).
    8. Esterilize os pinos"replicador" seguindo os passos descritos abaixo. Torneira replicator ligeiramente depois de cada imersão para remover o excesso de líquido.
      1. Mergulhe os pinos em 250 mL de 0,3-0,5% de hipoclorito de sódio por 30 segundos. Minimize o contato de pino replicador com solução de hipoclorito de sódio, pois pode levar a danos de pinos. Em seguida, mergulhe os pinos em 250 mL estéril ddH2O ou água ultrapura durante 10 segundos, em seguida, em 250 mL de etanol a 70% por 30 segundos e, em seguida, em 250 mL de etanol a 95% por 2 min.
      2. Chama esterilizar pinos replicator e, em seguida, pinos legais fixando em chapa Retangular não utilizada que contém a mídia LB ágar durante 30 segundos.
        Nota: Muito cuidado quando trabalhar com etanol perto de uma chama (ver 1.1.8).
    9. Gentilmente colocar pinos replicator em placa de ágar contendo o crescimento de mutantes e verifique se os pinos estão em contacto com todos os 96 mutantes na placa de ágar e, em seguida, mergulhe os pinos contendo líquido caldo LB de poços profundos. Evite tocar os lados dos poços com os pinos.
    10. Selo do bloco poço profundo com uma membrana de vedação respirável estéril. Use um rolo de placa para garantir que cada indivíduo bem está devidamente selado.
    11. Repita o procedimento para cada placa de ágar.
    12. Limpe todas as superfícies de trabalho com etanol a 70% após manusear o PA14NR definido.
    13. Cultivar culturas líquidas inoculadas para 15-16 h a 37° C a 950 rpm usando um misturador de alta velocidade, se disponível.
      Nota: Se não houver um misturador de alta velocidade, incubação de poço profundo blocos em shaker a 250-300 rpm é viável. No entanto, há uma maior chance de colônia pequenas variantes (VCEs)25 emergentes sob condições de baixa oxigenação. Portanto, é altamente aconselhável manter incubação vezes abaixo dos 15-16 h quando crescer culturas em poço profundo blocos em velocidades mais baixas do agitador. Proliferação indesejada de VCEs em poços mutantes pode alterar fenótipos mutantes ao usar a biblioteca para executar telas genéticas.
      Alguns poços em conjunto o PA14NR contenham mutantes crescendo/não-crescimento lento, falta de clones, ou contenham mídia não inoculada. A localização desses poços foi gravada e pode ser encontrada no arquivo suplementar PA14NR definir informações de poços incluído com esta publicação.
  3. Dia 3: Transferência de PA14NR conjunto de culturas durante a noite em placas de destino
    1. Limpar o exaustor de fluxo laminar e ligue o ventilador exaustor para um mínimo de 10 min antes de iniciar o trabalho. Limpe as superfícies de capuz e todos os itens colocados no bairro usando etanol a 70%.
    2. Imprimir etiquetas adesivas à prova d'água (ver arquivo suplementar PA14NR definir rótulos para modelo). Remover 96 poços chapas de plástico enrole dentro de uma capa de fluxo laminar. Peel-off placa rotular e colocá-lo na borda do prato está mais próximo de A1 H1 aos poços da placa de destino. Ligeiramente, levante a tampa da placa de destino e coloque a etiqueta na borda inferior para exibir o rótulo, quando a placa é coberta com a tampa.
    3. 3,5 L de glicerol de 60% (v/v) de preparar e esterilizar 20 min em autoclave.
    4. Use luvas, jaleco e máscara para manipular o conjunto de PA14NR. Remova blocos de poço profundo do agitador de alta velocidade ou agitador regular.
    5. Transferir blocos de poços profundos para fluxo de laminar estéril hood e remova cuidadosamente a membrana respirável de selagem. Substitua com selo de alumínio. Desativação da rotação dos blocos bem profundo com velocidade muito baixa para coletar condensação (30 segundos a 50-150 x g, então desacelerar quicky tendo centrífuga freio no).
    6. Transferir blocos de fundo-bem volta para hood estéril e usando uma pipeta eletrônica de 50-1200 µ l 12 canais e dicas filtradas estéril adicionem 525 µ l de mistura de caldo líquido de glicerol/LB (partes iguais LB caldo e 60% glicerol solução líquida) a cada poço. Misture delicadamente pipetagem 300 µ l acima e para baixo 3 vezes com pipeta eletrônica. Toque em dicas para o lado do bem antes de ejetar dicas para evitar gotejamento. Dicas de ejetar e continuar com a próxima linha até terminar com todo bloco poço profundo.
    7. Usando o 12 canais eletrônica repetitiva pipeta e dicas filtradas, para evitar a contaminação interwell durante alíquotas, puxe 900 µ l de cultura mutante e dispense 150 µ l em cada placas de 96 poços de destino para gerar 6 cópias da placa da biblioteca. Prevenir gotejamentos tocando a parede dos poços com dicas antes de iniciar a transferência da cultura em placas de destino. Se não repetir pipeta está disponível, use uma pipeta multicanal para dispensar 150 µ l em cada uma das seis placas 96 poços, usando a técnica descrita acima para evitar gotejamento.
    8. Use selos de alumínio estéril para cobrir as placas e usar um rolo de placa completamente selo placa bordas e todos os poços. Certifique-se de não cobrir o identificador de etiqueta com o selo de alumínio. Não agite as placas, como a cultura pode salpicar nos lados dos poços ou no selo de alumínio.
    9. Remova placas seladas de placas capô e coloque um plano de superfície plana em congelador a-80 ° C.
    10. Limpe todas as superfícies de trabalho com etanol a 70% após a biblioteca de manipulação.
    11. Execute verificações de controlo de qualidade após a replicação de biblioteca e depois de usar a biblioteca para executar telas genéticas (ver protocolo III).

2. Protocolo II: Manipulação e armazenamento de mutantes individuais do conjunto de PA14NR

  1. Dia 1: Mutante de raia de interesse
    1. Identificar a localização do mutante de interesse através do conjunto PA14NR link http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS ou usando o arquivo Library.xls não redundante baixado o link http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/downloads.cgi). Tome nota do antibiótico necessário para seleccionar todos os mutantes particular (gentamicina ou canamicina).
    2. Preparar a mídia de ágar LB, esterilizar em autoclave por 20-25 min e fixe a 55 ° C em banho-maria. Adicione 15 gentamicina µ g/mL para mutantes contendo inserções de transposon MAR2xT7 e 200 µ g/mL canamicina para mutantes contendo inserções de transposon TnphoA . Despeje a media de ágar LB em placas (placas redondas ou retangulares são adequadas). Chapas secas na capa estéril para cerca de 30 min a 1 h antes de usam.
    3. Autoclave todos plasticware e suprimentos não esterilizados antes do uso.
    4. Use luvas, jaleco e máscara para manipular o conjunto de PA14NR. Limpar a bancada e limpe a superfície com álcool 70% antes de trabalhar com o conjunto de PA14NR.
    5. Crie um campo estéril com um bico de Bunsen.
    6. Remover placa de 96 poços de PA14NR conjunto com mutante de interesse do congelador-80 ° C e coloque-o em gelo seco, leve o recipiente de gelo seco para o banco e brevemente colocar placa de 96 poços em cima do banco para permitir ligeira de descongelamento (aproximadamente 1-2 min).
      Nota: Manter um registro de todos os PA14NR conjunto 96 placas boas acessado para mutantes individuais de raia, como mais acesso às placas de biblioteca está correlacionado com um maior risco de contaminação interwell.
    7. Selo de alumínio quente com a mão antes descascando, tendo o cuidado de evitar que o selo retoque a placa. Use uma pinça Retire todos os restos do selo de alumínio.
    8. Localize o mutante de interesse sobre a placa de 96 poços. Usar vara de madeira estéril ou ponta da pipeta estéril para escolherem uma pequena quantidade da cultura congelada o indivíduo bem contendo o mutante de interesse.
    9. Raia congelada cultura em placa de ágar para colônias mutantes única como segue: delicadamente espalhar bactérias sobre uma secção da placa para criar a raia 1, usando um fresca, estéril de madeira vara ou pipeta de ponta, arraste através de raia 1, espalhando as bactérias uma segunda seção de a placa, para criar a raia 2. Usando um terceiro estéril de madeira vara ou pipeta ponta, arraste através de raia 2, espalhando as bactérias a última seção da placa, para criar a raia 3.
    10. Placa de fonte do selo com um novo selo de alumínio estéril. Não toque o lado adesivo do selo de alumínio em qualquer ponto para evitar a contaminação. Certifique-se de que cada bem e as bordas da placa são completamente seladas usando um rolo de chapa. Placa de retorno de 96 poços de gelo seco e, em seguida, congelador a-80 ° C.
    11. Incube a placa de ágar em incubadora 37 ° C durante a noite.
    12. Limpe todas as superfícies de trabalho com etanol a 70% após a biblioteca de manipulação.
  2. Dia 2: Crescimento de mutantes de interesse em caldo líquido LB
    1. Prepare o caldo LB líquido contendo 15 gentamicina µ g/mL ou canamicina de 200 µ g/mL, conforme a inserção de transposon.
    2. Use luvas, jaleco e máscara para lidar com a p. aeruginosa.
    3. Limpar a bancada e limpe a superfície com etanol a 70%. Crie um campo estéril com um bico de Bunsen.
    4. Transferência de 3-5 mL de caldo LB com antibiótico apropriado em tubo de cultura estéril com tampa.
    5. Usando um aplicador estéril ou uma ponta de pipeta estéril, escolher uma única colônia da estirpe mutante e inoculá-lo em LB mídia.
    6. Incube as culturas de líquido de LB a 37 ° C em uma coqueteleira a 225-250 rpm, durante a noite.
    7. Limpe todas as superfícies de trabalho com etanol a 70% após a manipulação de p. aeruginosa.
  3. Dia 3: Armazenar mutante de interesse no freezer-80 ° C
    1. Cryovial de etiqueta com o nome de mutantes, antibióticos adicionados ao caldo LB e data de armazenamento.
    2. Preparar 500 mL de 50% (v/v) de glicerol e esterilizar em autoclave.
    3. Use luvas, jaleco e máscara para lidar com a p. aeruginosa.
    4. Limpar o banco e/ou capa de inundação laminar e limpe a superfície com etanol a 70%.
    5. Retire o tubo contendo a cultura mutante do agitador.
    6. Prepare um recipiente pequeno com gelo seco.
    7. Use uma capa de fluxo laminar ou criar um campo estéril na bancada etanol-limpou com bico de Bunsen.
    8. Adicionar quantidades iguais de cultura bacteriana e glicerol 50% para o cryovial etiquetado usando condições estéreis e misture suavemente com pipeta (volume final 1-2 mL/frasco dependendo do tamanho do cryovials usado). Lugar cryovial em gelo seco para congelamento rápido.
    9. Coloque cryovial na caixa rotulada no freezer-80 ° C.
    10. Limpe todas as superfícies de trabalho com etanol a 70% após a manipulação de p. aeruginosa.

3. protocolo III: controle de qualidade do conjunto de PA14NR

  1. Selecione um conjunto aleatório de mutantes recém replicadas placas para detectar possível contaminação interwell (teste de 30-40 mutantes é recomendado).
    Nota: Em casos onde é necessário confirmar a identidade de um mutante sendo usado para a caracterização de um gene específico, é recomendável executar amplificações do PCR usando as primeiras demão gene-específico destinadas a sequência conhecida do gene que contém a inserção de Transposon. Embora mais desafiador, os benefícios do uso arbitrário iniciadores de PCR, ao invés de iniciadores de PCR do gene-específico quando amplyfing DNA fragmentos de mutantes transposon incluem a facilidade de confirmação mutante em grande escala e a capacidade de detectar a presença de potencial contaminantes. Para efeitos de controlo de qualidade, não é necessário obter dados de sequenciamento de PCR de alta qualidade para todos aleatoriamente escolhidas mutantes, contanto que um número suficiente de mutantes é selecionado para avaliar a taxa de erro.
  2. Siga o "Protocolo II" para a raia e crescer cepas mutantes.
  3. Autoclave todos plasticware e suprimentos não esterilizados antes do uso.
  4. Isole o DNA genômico por método preferido. Para a análise descrita neste trabalho, um kit de isolamento de DNA genômico foi utilizado seguindo o protocolo do fabricante. Várias cepas mutantes podem ser analisadas simultaneamente.
  5. Medir a concentração de DNA genômica usando um spectrophotometer microvolume. Ajuste a concentração de DNA genômica de aproximadamente 100 ng / µ l.
  6. Use o DNA genômico como modelo para executar "Reação de PCR1", conforme descrito na etapa 1 da tabela 3, gerando fragmentos de Arb1 PCR (Figura 3). Primers para esta etapa estão listados na tabela 4.
  7. Adicionar 0,5 µ l de 10x buffer para 5 µ l de reação PCR1 a carregar, carregar em um gel de agarose 1,5 a 2% e execute o gel em 80-150 V.
    Nota: Um comprimento de fragmento específico ou um intervalo de fragmento específico não é esperado, e mais do que uma banda pode estar presente como o primer arbitrário pode vincular a vários locais.
  8. Usar o DNA de reação de PCR1 como modelo para executar "PCR2 reação", conforme descrito na etapa 2 da tabela 3, gerando fragmentos de PCR Arb2 (Figura 3). Primers para esta etapa estão listados na tabela 4.
  9. Adicionar 0,5 µ l de 10x buffer para 5 µ l de reação PCR2 a carregar, carregar em um gel de agarose 1,5 a 2% e funcione o gel em 80-150 V.
    Nota: Um comprimento de fragmento específico ou um intervalo de fragmento específico não é esperado, e mais do que uma banda pode estar presente como o primer arbitrário pode vincular a vários locais.
  10. Envie PCR2 reação juntamente com a cartilha de transposon específicas apropriada para sequenciamento.
  11. Analisar resultados de sequenciamento byBLASTing-los contra o genoma completo de PA14 usando o link de explosão fornecidos no site da biblioteca de PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) ou explodindo-os diretamente contra a sequência do gene específico de o mutante de interesse.
    Nota: Informações sobre mutantes selecionadas podem ser encontradas pesquisando o site PA14NR definido (pesquisa http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS ou baixar o Library.xls não redundante do arquivo de http:/ o link / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

Figure 3
Figura 3: PCR amplificação e sequenciamento de mutantes de inserção de transposon. Visão esquemática das etapas envolvidas na amplificação por PCR e sequenciamento para verificação de identidade mutante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Afinação de reação de PCR
Etapa 1 Passo 2
Reação de PCR1 : PCR2 reação:
Água 23.25 µ l (grau de Biologia Molecular) 19.15 µ l água (grau de Biologia Molecular)
Polymerase de Taq 3µL 10x Buffer 5 µ l 10 x tampão da Taq polimerase
0.5µL polymerase de Taq 0,6 µ l Taq polimerase
0,625 µ l 20 µM primer Arb1D (tabela 4) 0,625 µ l 20 µM primer Arb2A (tabela 4)
Primeira demão de transposon-específica 0,625 µ l 20 µM (PMFLGM. 3a GB ou Tn5Ext) (tabela 4) primeira demão de Transposon-específica 0,625 mL 20 µM (PMFLGM. 2a GB ou Tn5Int2) (tabela 4)
1 µ l 10mm dNTPs 1 µ l 10mm dNTPs
1 µ l DNA genômico, 100 ng Reação de PCR1 de 5 µ l
Volume de reação final de 30 µ l Volume de reação final de 30 µ l
Configurações de reação de PCR
PCR1 Thermocycler condições: PCR2 Thermocycler condições:
95 ° C – 2 min 95 ° C – 2 min
Repita 5 ciclos: Repita 30 ciclos:
95 ° C – 30 s 95 ° C – 30 s
30 ° C – 1 min 54 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min 72 ° C – 1,5 min
Repita 30 ciclos: 72 ° C – 10 min
95 ° C – 30 s 4 ° C – Hold
45 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min
72 ° C – 10 min
4° C – Hold

Tabela 3: PCR reação set-up e thermocycler condições usadas para PCR arbitrária. Reações de PCR arbitrárias são executadas sequencialmente, e fragmentos gerados durante a reação de PCR1 são usados como modelo em PCR2 reação. Configurações específicas thermocycler são usadas para cada conjunto de reações.

Nome da primeira demão Sequência da primeira demão
MAR2xT7 específicos Transposon Primers
PMFLGM. GB-3a TACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2a TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon sequenciamento Primer
PMFLGM. GB-4a GACCGAGATAGGGTTGAGTG
Primers dephoA específicas do Transposon TN
Tn5Ext GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2 GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TNphoA Transposon Sequencing Primer
Tn5Int CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
Primers arbitrários
ARB1D GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2A GGCCAGGCCTGCAGATGATG

Tabela 4: lista dos Primers usados no controle de qualidade Experimentos. Primers utilizados para amplificação por PCR e sequenciamento de mutantes de inserção de transposon para confirmar identidade mutante.

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Representative Results

Doze novas cópias da PA14NR Set foram replicadas usando protocolo I e uma avaliação de controle de qualidade das cópias do novas gerado foi realizado utilizando protocolo III.

PA14NR conjunto placas mutantes, juntamente com as placas de controle, que consistem de tipo selvagem PA14 inoculado e não inoculadom poços intercalados em um padrão predefinido (Figura 4A), foram replicadas na sequência methology descrito no protocolo I. controle placas estão incluídas o conjunto de PA14NR para avaliar a possível contaminação interwell ao executar a replicação de placa. Além disso, placas de controle podem ser usado para praticar técnicas de replicação antes para acessar placas contendo os mutantes de inserção de transposon. Crescimento de placas de controlo foi inspeccionado visualmente após a replicação em placas de ágar LB e incubação durante a noite para garantir a presença de padrões de crescimento esperado (Figura 4B). Presença ou ausência de crescimento bacteriano em poço profundo blocos inoculadas com 1 placa de controle foi avaliada após incubação durante a noite lendo OD600 em espectrofotômetro. Os resultados mostraram um crescimento substancial no tipo selvagem PA14 inoculadas poços e completa ausência de crescimento nos poços não inoculados (Figura 4). Embora houvesse alguma variabilidade no crescimento do tipo selvagem PA14 culturas, houve completa ausência de crescimento nos poços não inoculados (Figura 4).

Trinta e oito cepas mutantes selecionadas aleatoriamente de uma das cópias do conjunto de PA14NR de recém-gerado foram analisadas por sequenciamento de fragmentos de DNA gerados por PCR arbitrário. Arbitrárias reações de PCR foram realizadas para amplificar fragmentos de DNA das regiões circundantes inserções de transposon da 38 mutantes selecionados, e os fragmentos PCR obtidos posteriormente foram sequenciados. Um exemplo de fragmentos do PCR obtidos após amplificação por PCR de mutantes de inserção nove distintas transposon é mostrada na Figura 5. Como recozimento de primers arbitrários ocorre aleatoriamente, comprimento do fragmento não pode ser previsto. Quando não há bandas eram visíveis, reações de PCR foram repetidas. Verificou-se a identidade das inserções de transposon contidos em 38 mutantes analisados usando o link PA14 Transposon inserção mutante biblioteca (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) para selecionar os primers necessários para realizar o PCR arbitrário reações.

Sequenciamento de resultados obtidos o mutante 38 estirpes foram BLASTed contra o genoma completo de link de estirpe PA14 usando a explosão fornecido no site da biblioteca de PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi). Resultados do sequenciamento de mutantes selecionados aleatoriamente também estavam alinhados contra as sequências de genes que correspondiam a cada indivíduo mutante (obtido usando a PA14NR conjunto placa posição ferramenta de pesquisa encontrada na biblioteca de PA14NR site http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Search.cgi?SearchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS). Alinhamentos de sequência foram realizados usando a ferramenta alinhar sequências do Nucleotide BLAST fornecida pelo NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PAGE = Megarajada & programa = blastn & BLAST_PROGRAMS = Megarajada & PAGE_TYPE = BlastSearch & BLAST_SPEC = blast2seq & banco de dados = n/a & QUERY = & assuntos =).

Dois dos 38 mutantes selecionado resultados de sequência gerado de baixa qualidade, provavelmente devido ao alto teor de GC na região que contém a inserção de transposon e não poderiam ser analisado ainda mais. Sequência de resultados de 35 dos 36 mutantes succesfully sequenciado correspondem as sequências dos genes correspondentes para os mutantes PA14NR conjunto selecionado. Apenas um em 36 sequências falhou coincidir com a sequência do gene que corresponde o mutante selecionado. No entanto, não foi estabelecido se essa discrepância resultou de um problema que ocorreu durante a replicação das novas cópias da PA14NR Set ou poderia ser atribuído à 2,8% tachar de erro estimado anteriormente para o PA14NR conjunto37.

Figure 4
Figura 4: PA14NR conjunto de placas de controle. A) layout de PA14NR conjunto de placas de controle 1 e 2. B) imagens de placas de controlo PA14 NR conjunto 1 e 2 replicada em ágar LB (vista superior da placa de ágar). Crescimento bacteriano C) média (+ /-SD) medido em poços inoculados e não inoculados de 1 placa de controle após incubação durante a noite no bloco bem profundo. As leituras foram realizadas no OD600. D) bacteriano crescimento medido em poços inoculados e não inoculados de 1 placa de controle após incubação durante a noite no bloco bem profundo. As leituras foram realizadas no OD600 em poços individuais. Até mesmo colunas correspondem às medições efectuadas em poços não inoculados; colunas ímpares correspondem a medições efectuadas em poços PA14-inoculados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: PCR1 e PCR2 fragmentos obtidos a partir de reações de amplificação. Exemplo de fragmentos obtidos utilizando as reações de amplificação do PCR arbitrário. Fragmentos em pistas de 1 a 9 correspondem aos diferentes mutantes selecionados aleatoriamente para realizar controles de qualidade de PA14NR conjunto replicado placas. MWM: Marcador de Peso Molecular de DNA. Tamanhos de DNA MWM estão em pares de bases.
PA14NR conjunto de cepas mutantes testaram: Lane 1: 07_4 A10, pista 2: 07_4 B4, pista 3: 08_1 C3, pista 4: 08_1 H6, pista 5: 08_3 G10, faixa 6: 08_4 B8, lane 7: 08_4 H3, faixa 8: 09_2 D12, faixa 9 : 09_2 G5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O P. aeruginosa Conjunto de PA14NR é um recurso valioso para a comunidade científica. De acordo com o conjunto de dados de março de 2017 de banco de dados de indicadores essenciais da ciência de Clarivate do Analytics, et al . Liberati (2006) 37, que descreve a construção de conjunto de PA14NR, é classificado no top 1% das publicações de microbiologia. Google Scholar relata mais de 600 citações da Liberati et al manuscrito original (2006) a partir de agosto de 2017. A biblioteca tem desempenhado um papel importante na elucidação dos mecanismos subjacentes a patogênese de p. aeruginosa . Importante, o formato da placa de 96 poços da PA14NR Set facilita telas genética alto throughput, destinadas ao estudo de uma variedade de P. aeruginosa fenótipos mutantes44,,45,46. Como o conjunto de PA14NR está disponível para distribuição, precauções especiais devem ser usadas para preservar a integridade deste recurso.

Um número de publicações demonstra a utilidade do usando o conjunto de PA14NR em telas genética37,38,,47,48. Por exemplo, como um teste inicial do utilitário da biblioteca, Liberati et al realizaram uma tela de fixação de PVC (policloreto de vinila), que se correlaciona com a capacidade das bactérias para formulário biofilmes37,38, 47 , 48. formato da biblioteca também permite o estudo de características genéticas complexas tais como swarming motilidade, evidenciada pela identificação de centenas de genes de interesse em uma simples tela de48. O conjunto de PA14NR foi usado também em uma tela em grande escala de massa baseado em espectrometria de MALDI-TOF para adquirir e analisar células intactas proteome espectros de perfil e avaliar a eficácia de MALDI-TOF Biotyping47. Aplicando esta técnica, os pesquisadores foram capazes de determinar se diferenças genômicas menores, tais como aquelas que resultam de inserções de transposon, são perturbadoras para os esforços de biotyping que são usados em ambientes clínicos e terapêuticos. Além disso, o conjunto de PA14NR foi usado para executar uma tela de todo o genoma para atenuação da virulência PA14 em um modelo de infecção de c. elegans , permitindo a identificação de anteriormente descaracterizada genes relacionados com a virulência de p. aeruginosa 38e obtendo-se um exemplo do uso da biblioteca PA14 para estudar interações patógeno-hospedeiro.

O conjunto de PA14NR também serve como um recurso importante para o estudo dos mutantes individuais. Para evitar a contaminação da biblioteca, as melhores práticas para acessar mutantes de interesse são recomendadas. Porque a manipulação da biblioteca aumenta a possibilidade de contaminação, recomenda-se armazenar os mutantes de interesse em frascos individuais para acessar limite para o trabalho conjunto de PA14NR e mestre cópias. Isto impede a contaminação, melhora a longevidade da biblioteca e protege o investimento.

A fim de preservar a integridade do recurso importante PA14NR definida, recomenda-se que todos os destinatários do conjunto de PA14NR de fazem cópias da biblioteca em cima do recibo. Apesar dos esforços, o potencial de contaminação inadvertida durante os procedimentos de replicação não pode ser excluído. Portanto, é altamente recomendável que usuários completo controle de qualidade verifica após a replicação de biblioteca e depois de usar a biblioteca para executar telas genéticas. É também altamente recomendável que os usuários fazer cópias adicionais do PA14NR Set para executar telas genéticas como a probabilidade de contaminação interwell aumenta. Além disso, cópias de biblioteca usadas para executar mais de 2-3 telas genéticas devem ser submetidas a avaliações de controlo de qualidade exaustivo. Infelizmente, não há nenhuma maneira correta de recuperar bibliotecas que experimentam perda de clones ou interwell contaminação. Cópias comprometidas ou contaminadas devem ser descartadas. Como consequência, é recomendável que os usuários replicam várias cópias da biblioteca para uso de rotina laboratorial, Considerando que a vida útil de uma cópia é limitada. Também é recomendável que os usuários acessar limitam para a cópia"mestre" para preservar a integridade do PA14NR Set.

Os protocolos aqui apresentados fornecem uma explicação detalhada das técnicas de replicação, incluindo set-up, protocolos e práticas recomendadas. Os protocolos de replicação descritos para o conjunto de PA14NR podem ser adaptados para gerar até 12 cópias da biblioteca e também podem ser facilmente adaptados para replicar outras bibliotecas mutantes bacterianas. O melhor de nosso conhecimento, existem sem protocolos publicados disponíveis até à data com descrições detalhadas dos procedimentos e técnicas usadas para replicação, manutenção e validação das bibliotecas mutantes bacterianas. Esperamos que estes protocolos irão fornecer aos usuários do conjunto de PA14NR e outras bibliotecas mutantes bacterianas com as informações necessárias para executar essas tarefas importantes.

A biblioteca é utilizado para telas de alto rendimento ou como uma fonte para mutantes individuais, é importante avaliar periodicamente a integridade da cópia em uso. Para fazer isso, uma formação adequada do pessoal e re-avaliar a replicação ou mutante técnicas de seleção deve ser feita periodicamente. É altamente recomendável o uso de PA14NR conjunto de placas de controle e desempenho de rotina amplificação por PCR e sequenciamento dos mutantes aleatórios para confirmar sua identidade. El Al . Liberati (2006) 37 estima-se que 2,8% do número total de mutantes no PA14NR Set foi erroneamente, que destaca a necessidade de mutantes de transposon específico de sequência e gerar mutantes em-frame exclusão antes de iniciar qualquer estudo abrangente e/ou publicação de pesquisas envolvendo genes específicos. Dada protocolos apropriados e métodos para replicação de biblioteca e seleção de mutantes individuais para um estudo mais aprofundado, o conjunto de PA14NR contribuirá para a compreensão da patogenicidade de p. aeruginosa e a melhoria dos resultados clínicos para os infectados pacientes.

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Disclosures

Os autores relatam que não há conflitos de interesses financeiros. Eliana Drenkard e Frederick Ausubel participaram da criação biblioteca mutante PA14 transposon não redundante. Bryan Hurley e Lael Yonker atualmente casa e distribuem a biblioteca mutante como parte do departamento de Pediatria do hospital geral de Massachusetts.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Lisa Philpotts da MGH Treadwell Biblioteca Virtual para sua orientação na busca de dados. Este trabalho foi financiado pela Fundação de fibrose cística (YONKER16G0 e HURLEY16G0) e NIH NIAID (BPH e ADE: R01 A1095338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

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Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).

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