Summary
والهدف من هذا البروتوكول لإثبات حقن خلايا سرطان البروستاتا، مع عملية الاخصاء اللاحقة داخل البروستاتا. نماذج أورثوتوبيك قبل الإكلينيكية المعتمدة على الاندروجين والاخصاء مقاومة سرطان البروستاتا بالغة الأهمية لدراسة المرض في سياق ذات صلة سريرياً وورم المكروية ومضيف الأشخاص.
Abstract
أورثوتوبيك الورم النمذجة أداة قيمة لأبحاث سرطان البروستاتا قبل الإكلينيكية، كما أن لديها مزايا متعددة على حد سواء تحت الجلد والمحورة وراثيا نماذج الماوس. على عكس أورام تحت الجلد، تحتوي الأورام أورثوتوبيك المفرج سريرياً أكثر دقة وورم المكروية، والاستجابات للعلاجات المتعددة. وفي المقابل إلى نماذج الماوس المهندسة وراثيا، أورثوتوبيك نماذج يمكن أن يؤديها بتكلفة أقل، وفي وقت أقل، تنطوي على استخدام الماوس معقدة للغاية وغير متجانسة أو خطوط خلايا السرطان البشرية، بدلاً من أن واحد التعديلات الوراثية، وهذه الخلية خطوط يمكن أن يكون وراثيا، مثل للتعبير عن وكلاء التصوير. نقدم هنا، بروتوكولا لحقن خط خلية سرطان البروستاتا مورين الإعراب عن لوسيفراس ومشري جراحيا في الفص البروستاتا الأمامي من الفئران. هذه الأورام أورثوتوبيك الفئران المتقدمة التي تم رصدها غير إينفاسيفيلي في فيفو وكذلك تحليل لحجم الورم والوزن، وبقاء الماوس وتسلل محصنة. علاوة على ذلك، الفئران الحاملة للورم أورثوتوبيك كانت جراحيا مخصي، مما يؤدي إلى تراجع الورم الفوري وتكرار اللاحقة، ويمثل سرطان البروستاتا المقاوم للخصي. بالرغم من المهارة التقنية القيام بهذا الإجراء، هذا النموذج أورثوتوبيك سينجينيك من سرطان البروستاتا المقاوم للخصي والمعتمدة على الاندروجين من فائدة كبيرة لجميع المحققين في الميدان.
Introduction
ويقدر سرطان البروستاتا لديها أعلى معدل لانتشار (الرجال 161,360) وتتسبب في وفيات السرطان ثالث أهم الذكور (الرجال 84,590) في عام 20171. عند التشخيص، وأورام البروستاتا المعتمدة على الاندروجين، وتتم معاملتها بواسطة عملية استئصال غدة البروستاتا الجراحي، العلاج بالإشعاع، و/أو العلاج الاندروجين الحرمان (ADT)، بعد كل معاملة غير مقترنة مع متعددة مضاعفات والمراضات الكبرى2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-وعلى الرغم من تراجع الورم بعد ADT، تتكرر ما يقرب من جميع الأورام كسرطان البروستاتا المقاوم للخصي (قانون الإجراءات الجنائية). وفي هذه المرحلة، تشمل العلاجات الموافق عليها دوسيتاكسيل، تي سيبوليوسيل المناعي، والجزيئات الصغيرة المضادة للالاندروجين انزالوتاميدي abiraterone، بعد العلاج الفردي لا يمنح فائدة البقاء على قيد الحياة لأكثر من11شهرا 5.2، 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17-ولذلك تحتاج الرجال في جميع مراحل الإصابة بسرطان البروستاتا خيارات تحسين العلاج وإدارة المراضات، لمرض ما قبل السريرية المثلى التي النمذجة أمر حاسم.
مع الإجراء الصحيح، يمكن أن تغرس خطوط خلايا سرطان البروستاتا جراحيا في البروستاتا مورين، مما يؤدي إلى تطوير أورام أورثوتوبيك سينجينيك أو إكسينوجينيك على حد سواء. النمذجة الورم أورثوتوبيك مثالي لكل ورم البيولوجيا والمخدرات بحوث التنمية، مما يسمح للتنمية الورم مع ممثل سريرياً وورم المكروية (TME). قد أثبتت الدراسات السابقة أن تحت الجلد (الليبي) الأورام المفرج غيرت ورم، مما يؤدي إلى استجابات سريرياً دقيقة التفاضلية وأقل للأوعية مكافحة العلاجات18،19. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات متعددة قد لاحظ تزايد أو تناقص فعالية تشريعات متعددة في علاج نفس الخط الخليوي، اعتماداً على ما إذا كان يدير الليبي أو أورثوتوبيكالي، هذه الأخيرة التي تمثل أفضل ما يرى في الإنسان سرطان20،،من2122. علاوة على ذلك، فقط في نموذج أورثوتوبيك لسرطان القولون، ولكن ليس في النموذج الليبي، الأورام تنتج إنزيمات بوليمرات الصحيحة اللازمة لحمل خبيث23. وأخيراً، كما إيمونوثيرابيس تستمر في الظهور في طليعة علاج السرطان، وخاصة وأنها لم تقدم فائدة كبيرة لسرطان البروستاتا24،25، نماذج ما قبل السريرية سينجينيك مع TME دقيقة و تجفيف الغدد الليمفاوية في الأشخاص المضيفين الحاسمة.
هناك العديد من العوامل المسؤولة عن هذه النتائج غير متناسقة استناداً إلى موقع الورم. مع TME مختلفة، الخلايا السرطانية تتعرض لمختلف الأنسجة على حدة البطانة وغيرت الأوعية، مما يؤثر على الورم التنمية26،27. الأورام أورثوتوبيك مع TME الصحيح تسمح بإيصال الأدوية ذات الصلة سريرياً وظروف التاكسج، وتقييم العلاجات المضادة-الأوعية28. بينما تحتوي نماذج المهندسة وراثيا (الأحجار الكريمة) على TME دقيقة، أنها تتطلب فترة طويلة مرات لتربية وتكلفة عالية، وهي غالباً ما تستند إلى التلاعب الجينات واحد أو عدد قليل من خرج أو أوفيريكسبريسيد ما يتجاوز المستويات ذات الصلة سريرياً. وفي المقابل، خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية أو مورين المستخدمة في الأورام أورثوتوبيك، مثل الأورام البشرية، معقدة أكثر وراثيا سواء داخل خلايا مفردة أو في عرض عدم التجانس بين الخلايا29،30. أيضا خلافا للأحجار الكريمة، أورثوتوبيك سرطان الخلية خطوط يمكن إجراء هندسة عكسية للتعبير عن طرائق التصوير أو زيادة أو انخفاض مستويات جزيئات أخرى من الاهتمام، و في المختبر و في فيفو النتائج التجريبية يمكن مقارنتها مباشرة. يمكن أيضا أن تشكل الأورام أورثوتوبيك من الخلايا الأولية المستمدة من المريض. هنا، نحن التقرير منهجية إجراء الحقن داخل البروستاتا من خلايا سرطان البروستات التي تشكل أورثوتوبيك المعتمدة على الاندروجين الأورام، وبعد عملية الاخصاء، تتكرر أورثوتوبيك قانون الإجراءات الجنائية.
Protocol
كلها الحيوان الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول التي يتعين القيام بها وفقا للقواعد الأخلاقية والموافقة على "رعاية الحيوان المؤسسية" الجامعة المناسبة واستخدام اللجنة (إياكوك).
1-إعداد المواد الجراحية والخلايا السرطانية
- قبل اليوم من الجراحة، اﻷوتوكﻻف مقص تشريح الصغرى، الملقط جرايفى، جرايفى ملقط الأنسجة، مع قطع خياطة حامل الإبرة، والعدد المناسب من الستائر. تعقيم 50 ميليلتر المحاقن والإبر 28-قياس بغاز أكسيد الإيثيلين (الشكل 1).
- قبل اليوم الجراحة، وثقافة الحد الأقصى لحركة الخلايا في أطباق 10 سم في ربمي تكملة مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين/ستربتوميسين (P/S) في 37 درجة مئوية 5% CO2 حاضنة. لرصد الورم طرحه و/أو الفلورسنت، ترانسفيكت الخلايا 293T مع متجهات مناسبة وبعد ذلك ترانسدوسي كاب حركة الخلايا مع 0.45 ميكرومتر تصفية lentivirus31. فرز الخلايا لتوليد خط خلية مستقرة مع الإيجابية توصيل 100%.
ملاحظة: تنفيذ جميع زراعة الأنسجة تحت ظروف معقمة، والتحقق من أن جميع خطوط الخلايا الحرة مفطورة. هو ترانسدوسيد خط خلية سرطان البروستاتا مورين المستخدمة في هذه الدراسة، والحد الأقصى لحركة32، للتعبير عن ستابلي لوسيفراس اليراع ومشري على حد سواء. الحد الأقصى لحركة الخلية خط المحطة الفضائية الدولية المعزولة من ج-حركة-overexpressing مرحبا-حركة الماوس، وهذه الخلايا تحتوي مستقبلات الاندروجين تضخيم (ع)، التي هي المعتمدة على الاندروجين32 وتشكل الأورام اللجنة بعد عملية الاخصاء مورين33. جميع الفئران في هذه الدراسة هي القديمة في الأسبوع 6-8 ذكور الفئران ففب/نيو جيرسي. يمكن استخدام خطوط خلايا سرطان البروستاتا مورين البديلة مع الفئران الخلفية الوراثية المناسبة، فضلا عن خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية أو خلايا سرطان البروستاتا الأولية المستمدة من المريض مع الفئران العوز. وينبغي تحديد العدد الأمثل للخلايا للحقنة تجريبيا لخطوط خلايا بديلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تستخدم التصوير الطرائق البديلة لتصور الأورام، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) أو التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) أو التصوير المقطعي (CT)، فضلا عن التجارة والنقل كبديل مشري. - في الليلة السابقة للجراحة، ووضع مصفوفة الغشاء ماتريجيل وخالية من الفينول الحمراء على الجليد في 4 درجات مئوية لإذابة الجليد.
- في يوم الجراحة، جمع الخلايا بغسلها مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل مع التربسين-يدتا 0.25%. تحييد التربسين مع ربمي مع 10% FBS و 1% P/s.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x لمدة 5 دقائق.
- تغسل الخلايا مع 10 مل ربمي دون FBS أو P/s.
- عد الخلايا وريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز 6.67x107 خلايا/مل (1 × 106 خلايا/15 ميليلتر).
- إضافة وحدة تخزين متساوية من ماتريجيل لإنشاء تعليق خلية برنامج تلفزيوني/ماتريجيل 1:1 بتركيز 1 × 106 خلايا/30 ميليلتر نهائية، وإبقاء الخلايا على الجليد حتى الحقن لمنع التجميد.
ملاحظة: إجراء الحقن داخل البروستاتا داخل ح 3 من إعداد ماتريجيل تعليق خلية. إذا كان أداء الحقن داخل البروستاتا في الفئران أكثر من 5، كرر الخطوات المذكورة أعلاه لإعداد تعليق خلية ماتريجيل طازجة.
2-إعداد الماوس قبل العملية
ملاحظة: البيت الفئران في مرفق جامعة الحيوان لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل الجراحة للسماح للتكيف الملائم وتقليل الإجهاد الحيوانية. يتم تنفيذ الخطوات 2.1-2.6 مساعد الجراح. يتم تنفيذ جميع الخطوات الجراحية اللاحقة بالجراح باستخدام قفازات معقمة والأدوات الجراحية مع تقنية تعقيم.
- تخدير الفئران مع إيسوفلوراني (2-5% لتحريض عبر الدائرة، 1-3% للصيانة عن طريق الآنف مخروط). تحقق من الاستقراء الكامل بفقدان إصبع قرصه العاكسة.
- وزن الفئران وإدارتها على الأقل 0.05 مغ/كغ البوبرينورفين مسكن الليبي
ملاحظة: وزن الماوس إيه تو زيرو ز مثالي لنجاح الحقن داخل البروستاتا. - تطبيق مرهم العيون تزييت لكلتا العينين لمنع تجفيف القرنية.
- حلق جميع الفراء من البطن.
- تعقيم البطن بثلاث جولات من تطبيق التعميم فرك الجراحية استخدام منصات العقيمة غير الملتزمة تليها مناديل الكحول العقيمة. السماح للبطن لتجف.
ملاحظة: لبقية العملية الجراحية، يمكن فقط قفازات معقمة والأدوات الجراحية اتصل البطن الماوس معقمة. - نقل الماوس مستلق على سطح نظيف على وسادة تدفئة مباشرة تحت مجهر جراحي نظيفة والهدف.
- تغطية الماوس مع ثني عقيمة مع ثقب صغير قص على البطن.
3-داخل البروستاتا حقن
ملاحظة: جميع الخطوات الجراحية تحت ظروف معقمة. ضبط المجهر، موضع الماوس، أو أي يجب أن يتم كائنات أخرى غير معقمة بمساعد الجراح.
- القيام حوالي 1 سم في شق الجلد الخارجي على طول خط الوسط البطن متفوقة على القضيب والغدد بريبوتيال (الشكل 1).
- فصل النسيج الضام بين الجلد الخارجي البطن وعضلات البطن الداخلية عن طريق فتح المقص بين الطبقات.
- تنفيذ شق مماثلة لعضلات البطن الداخلية أثناء استخدام الملقط لرفع الجهاز العضلي لتجنب ثقب الأمعاء أو المثانة (الشكل 1).
- تحديد موقع أحد الحويصلات ثنائية (الشكل 1A، الأبيض)/الفصوص البروستاتا الأمامي (الشكل 1A، الأسود)، التي غالباً ما تكون الخلفي والجانبي أعلى قليلاً بالمثانة (الشكل 1A، الأصفر)، ولكن هذا قد تختلف بين الفئران . الفصوص البروستاتا الأمامي المرفقة إلى انحناء أقل من الحويصلات بيضاء وشفافة.
- وتثير بلطف غيض حويصلة استخدام الملقط الأنسجة جرايفى لخلق التوتر في الأنسجة دون ثقب حويصلة (الشكل 1E).
- خلط الحل ماتريجيل الحد الأقصى لحركة بالغير اليهود بيبيتينج (التي تؤديها مساعد الجراح)، كما قد يكون القريبون الخلايا، ونضح 30 ميليلتر (1 × 106 خلايا) ببطء إلى الإبرة لتجنب فقاعات الهواء.
- إدراج المجسم مشطوف الحواف الموازية إبرة المحور الطويل للفص البروستاتا الأمامي بعناية. ببطء بحقن 30 ميليلتر الفص وتتراجع ببطء الإبرة لمنع التسرب (الشكل 1F). تحقق من حقن الكافية التي تحفل الفص الأمامي البروستاتا (الشكل 1).
- عقد بعناية في حويصلة وحقن الفص البروستاتا خارج الماوس لحوالي 30 ثانية للسماح ماتريجيل على ترسيخ جزئيا داخل الفص. وخلال هذا الوقت، جمع أي تسرب حل الخلية في البطن استخدام من بوليستر عقيمة يميل قضيب لمنع حدوث تطور الورم غير أورثوتوبيك، دون الضغط على الفص البروستاتا حقن.
- بعناية العودة حويصلة والفص البروستاتا حقنه في البطن دون الضغط على الفص. استبدال أي الأنسجة الخارجية.
- إجراء خياطة الجروح المستمر لإغلاق عضلات البطن الداخلية مع 5-0 فيكريل القطع عكس الامتصاص إبرة خياطة الجروح.
- إجراء خياطة الجروح توقف لإغلاق الجلد البطن الخارجي مع 4-0 شعيرات النايلون غير امتصاص قطع عكس إبرة خياطة الجروح.
ملاحظة: دبابيس عيار 9 ملم معقمة يمكن أيضا استخدام لإغلاق الجلد البطن الخارجي. ومع ذلك، خلافا لخياطة الجروح، أنها تتداخل مع أي ورم طرحه ونيون اللاحقة التصوير إشارة. - تنظيف جميع الأدوات مع مناديل معقمة الإيثانول (افتتح مساعد الجراح) ووضعها في معقم حبة زجاج للسماح س. 30 الأدوات تجف قبل استخدام الماوس القادم.
- مسح المحاقن والإبر في المحلول الملحي العقيمة (افتتح مساعد الجراح) لمنع انسداد ببقايا ماتريجيل.
ملاحظة: مساعد جراح أن يكون حاضرا لجميع العمليات، القيام بإعداد الماوس قبل العملية كلها غير معقمة والرعاية الماوس بعد العمليات الجراحية، وكذلك فيما يتعلق بالمزيج الحل ماتريجيل كاب حركة قبل الحقن. لتقليل الوقت، كما سيتطلب إجراءات الماوس داخل البروستات كل 20-30 دقيقة، يمكن أن يبدأ مساعد الجراح إعداد الماوس التالية كما هو خياطة الجراح الماوس الحالي.
4-بعد العمليات الجراحية الماوس الرعاية
- إدارة 1 مغ/كغ ميلوكسيكام مسكن الليبي فورا وح 24 48 ساعة بعد الجراحة.
- السماح للفئران لاسترداد في قفص مع الأسرة لا توضع في منتصف الطريق على وسادة تدفئة. مراقبة الفئران لمدة 30 دقيقة على الأقل بعد الجراحة حتى أنها تستعيد التنقل العادي والنشاط، بعد التي وضعها في قفص نظيف مع المواد الغذائية على أرضية القفص.
- كذلك رصد الفئران يوميا لالتئام سليم ووزن الجسم والاستمالة وأمبوليشن بعد عملية جراحية. منفصلة من الفئران في أقفاص فردية على أي أدلة للقتال.
- قم بإزالة أية خيوط المتبقية في غضون 14 يوما بعد الجراحة.
5-طرحه الورم التصوير
- إعداد العقيمة التي تمت تصفيتها نا+ أو ك+ د-لوسيفرين، كما وصف من قبل الشركة المصنعة والمحمية من الضوء.
- حقن الفئران داخل بيريتونيلي مع 10 ميليلتر/غرام من وزن الجسم من لوسيفرين.
- على الأقل 10 دقيقة في وقت لاحق، الفئران الصورة مع "نظام التصوير الطيف إيفيس"، كما تم وصفه سابقا34،35.
- تحليل الصور باستخدام "البرمجيات الصورة الحية"، كما هو موضح سابقا34،35.
ملاحظة: إيفيس التصوير تحليل مفيد لتحديد نجاح الحقن داخل البروستاتا والتنمية الورم الأولى لتطبيع العبء الورم بين المجموعات التجريبية. بيد اعتماداً على كثافة إشارة طرحه أو الفلورسنت، قد يسبب تشبع هضبة في التحديد الكمي الصورة على الرغم من زيادة حجم الورم الفعلية. ولذلك، في المراحل المتأخرة من نمو الورم، تصوير إيفيس قد يكون أكثر فائدة لتحديد الانخفاض في حجم الورم عند نجاح العلاج بدلاً من الزيادات في حجم بعد تشبع الصورة.
6-ورم في جمع وتحليل الورم وبقاء نقطة النهاية
- إذا جمع الورم لتحليلها، معاملة إنسانية euthanize الفئران بالتعرض2 CO والتفكك عنق الرحم الثانوي، أو بأساليب بديلة IACUC وافق، وتشريح الأورام من البطن. وينبغي أن الأورام أورثوتوبيكالي الموجود في البروستاتا.
ملاحظة: الأورام تعلق على جدار البطن الأمامي أو تبذر في جميع أنحاء البطن تشير إلى الحقن داخل البروستاتا الفقراء أو راشح، ولا ينبغي أن تعتبر الأورام أورثوتوبيك. - وزن الأورام.
- حساب حجم الورم ك π/6 × ل × ث × ح (L = طول المحور أطول من الورم، ث = عرض عمودي، ح = الارتفاع عمودي).
- الأورام يمكن تحليلها بعلم الأنسجة (الإصلاح في الفورمالين مخزنة محايدة 10%)، والتدفق الخلوي (إنشاء تعليق خلية مفردة)، البروتين (إعداد الأنسجة في المخزن المؤقت للمعهد الملكي)، أو الحمض النووي الريبي (فورا مكان الأنسجة في رنالاتير).
- لتحليل المناعية، كما جمع البروستاتا تجفيف الورم الفقرة الابهري الليمفاوية (الشكل 1B، البرتقالي) والطحال.
ملاحظة: إذا بعد الفئران للبقاء على قيد الحياة، نقطة النهاية لهذا النموذج يعرف بأنه المظهر لاستسقاء البطن النزفية36 و/أو انخفض أمبوليشن والاستمالة، و/أو بيلوريكشن37. تلقي التسكين قبل وبعد العمليات الجراحية (خطوات البروتوكول 2، 2، 4، 1) الفئران لتحليل البقاء على قيد الحياة ويجب أن تراقب بانتظام. يجب فصل الفئران في أقفاص فردية إذا كان أي قتال يحدث، وينبغي أن تكون إنسانية euthanized عند ظهور أي من قراءات نقطة النهاية أعلاه.
7-العمليات الجراحية الاخصاء نموذج قانون الإجراءات الجنائية
- نموذج قانون الإجراءات الجنائية، لتنفيذ ما ورد أعلاه الحقن داخل البروستاتا البروتوكول (بروتوكول الخطوات 1-5).
- وبعد أسبوع واحد على الأقل بعد تطور الورم، إجراء الاخصاء الجراحي عن طريق الكي، كما هو موضح سابقا38.
- رصد الانحدار الورم وتكرار بتصوير طرحه. بعد الاخصاء، الانحدار الورم سوف تحدث في غضون 3 أيام وتكرار الورم سوف تحدث داخل 30 يوما تقريبا، يمثل قانون الإجراءات الجنائية.
Representative Results
وفي هذه المخطوطة، نحن جراحيا حقن خط خلية سرطان البروستاتا مورين، حركة الحد الأقصى، في الفص البروستاتا الأمامي (الشكل 1A)، مما يؤدي إلى تطوير أورام البروستاتا أورثوتوبيك مع TME ذات صلة سريرياً والصحيح تجفيف البروستاتا الغدد الليمفاوية (الشكل 1B). تم إجراء هذا باستخدام مقص تشريح الصغرى جرايفى الملقط وجرايفي ملقط الأنسجة، وحامل الإبرة مع قطع خياطة، وحقنه 50 ميليلتر بإبرة 28-قياس (الشكل 1). بعد القيام حوالي 1 سم خط الوسط شق البطن أعلاه الغدد بريبوتيال (الشكل 1)، حويصلة واحدة والمرفقة من الفص الأمامي البروستاتا كانت موجودة وتخريجها (الشكل 1E) و 30 ميليلتر (1 × 106 خلايا) من كان حقن تعليق خلية برنامج تلفزيوني/ماتريجيل 1:1 في البروستاتا (الشكل 1F)، تحققت أصلاً تحفل الفص وعدم التسرب (الشكل 1).
لمراقبة نمو الورم أورثوتوبيك، نحن ستابلي transfected خلايا حركة-كاب للتعبير عن لوسيفراس اليراع ومشري، مما يسمح للأورام يعقبه غير الغازية في فيفو الإضاءة الحيوية (الشكل 2A) والأسفار (الشكل 2B)، على التوالي. واحد الحد من هذا التصوير أنه، اعتماداً على قوة الإشارة، التصوير الكمي قد تشبع في حين تواصل الورم زيادة في الحجم. ولذلك، مع إشارة عالية الشدة، هذا التصوير في فيفو أكثر فائدة لتطبيع عبء الورم في البداية عبر المجموعات التجريبية وبعد تحديد النقصان في حجم الورم بعد العلاج التجريبي. ويمكن أيضا استخدام طرائق التصوير إضافية، مثل الحيوانات الصغيرة التصوير بالرنين المغناطيسي، والحيوانات الأليفة، أو قيراط
تم تشريح الأورام أورثوتوبيك من البطن يوم 30 بعد الحقن داخل البروستاتا (الشكل 3A). ينبغي أن يكون أورام أورثوتوبيك يقع في موقع الفص البروستاتا الأمامي. ورم الجماهير في جميع أنحاء البطن أو يعلق على جدار البطن الأمامي تشير إلى الحقن داخل البروستاتا غير لائق والتسرب. مع الأسلوب السليم، يمكن تسجيل حجم الورم (الشكل 3B) والوزن (الشكل 3) مع الخطأ القياسي صغيرة نسبيا. ومع ذلك، كما لاحظ، سيكون هناك بعض التباين مع الجماهير الأورام الصغيرة والكبيرة. ولذلك، الاستخدام الأولى للمعالجة المسبقة التصوير الكمي لتحقيق التعادل عبء الورم بين الأسلحة التجريبية حاسم بالنسبة لجميع التجارب. علاوة على ذلك، كما تم حقن هذه الخلايا السرطانية مورين الأشخاص ففب/نيو جيرسي الفئران، يمكن تحليلها TME immunohistochemistry (المدينة) (أو التدفق الخلوي أو تقنيات أخرى) للخلايا التائية CD3 (3D الشكل) (أو أنواع الخلايا المناعية الأخرى). وأخيراً، هذا النموذج يوفر نقطة موضوعية البقاء على قيد الحياة، ك استسقاء البطن النزفية الأسباب جماعية كبيرة الورم الرئيسي36 (الرقم 3E) و/أو انخفض أمبوليشن والاستمالة، و/أو بيلوريكشن37. أحياناً، قد يكون سبب الوفاة أيضا بنمو الأورام تمنع إخراج البول.
وأخيراً، يمكن أن تستخدم هذا الطراز لدراسة سرطان البروستاتا المعتمدة على الاندروجين وقانون الإجراءات الجنائية، هذه الأخيرة التي تمنح سوء التشخيص وهو في حاجة إلى خيارات العلاج رواية. بعد تطور الورم أورثوتوبيك، جراحيا مخصي الفئران، كما هو موضح سابقا38. هذا هو عملية جراحية بقاء الرئيسية الثانية، يجب إيلاء الرعاية الإضافية لرصد للانتعاش وأي أحداث سلبية أو مضاعفات. خلال 3 أيام بعد عملية الاخصاء، لوحظ تراجع الورم قوية متبوعاً بتكرار الورم اللاحقة بعد 30 يوما تقريبا، تمثل اللجنة (الشكل 4 أ). أورام قانون الإجراءات الجنائية يمكن تشريح وتحليل الأشيع، ولا يتم عرض أي تمايز الغدد الصم العصبية، كما أنها الحفاظ على مستويات عالية من ع وهي سلبية بالنسبة لعلامة الغدد الصم العصبية، سينابتوفيسين (الشكل 4 باء).
رقم 1: الفص الأمامي البروستاتا والغدد الليمفاوية تجفيف وتقنية الممثل لحقن الخلايا داخل البروستات. صور للفص البروستاتا الحق الأمامي (A) (أسود، *)، تعلق حق حويصلة منوية (أبيض)، حق لوحة الدهون (الأخضر)، الخصية والمثانة (أصفر)، (ب) الثنائية استنزاف البروستاتا الفقرة الابهري الليمفاوية (برتقالي)، (ج) مقص تشريح الصغرى جرايفى الملقط، جرايفى ملقط الأنسجة، حائز إبرة مع قطع خياطة و 50 ميليلتر حقنه بإبرة 28-قياس (من اليسار إلى اليمين)، (د) خط الوسط شقوق وحويصله (ه) والفص الأمامي البروستاتا تخريج، (و)، والحقن داخل البروستاتا، وتحفل (ز) من الفص البروستاتا الأمامي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: في فيفو تصوير الورم طرحه ونيون. (أ) لوسيفراس و (ب) مشري-وإذ يعرب عن الأورام أورثوتوبيك كاب حركة تم تصويرها باستخدام "نظام التصوير الطيف إيفيس". وكان كمياً الإضاءة الحيوية بالتدفق الإجمالي (الفوتونات/s). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: تحليل الورم أورثوتوبيك بحجم الورم، والوزن، علم الأنسجة لتسلل المناعية، والبقاء على قيد الحياة- الأورام أورثوتوبيك تم تشريح يوم 30 بعد الحقن داخل البروستاتا وتحليلها من قبل (أ) إجمالي التصوير، (ب) ورم حجم (π/6 × ل × ث × ح؛ L = طول المحور أطول من الورم، ث = عرض عمودي، ح = الارتفاع عمودي)، وزن الورم (ج) ، (د) CD3 المدينة (شريط مقياس = 100 ميكرومتر)، والبقاء على قيد الحياة (E) ، مع نقطة النهاية الهدف كمظهر البطن نزفية استسقاء. (أ-ب) بيانات يتم تمثيلها ك ± يعني الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: حقن داخل البروستات مع الاخصاء الجراحي اللاحقة نموذج سرطان البروستاتا المعتمدة على الاندروجين وقانون الإجراءات الجنائية- (أ) تم تصويرها الفئران التي تحمل أورثوتوبيك لوسيفراس-الإعراب عن الأورام بالإضاءة الحيوية ما قبل وما بعد عملية الاخصاء (Cx)، وتكررت (ب) قانون الإجراءات الجنائية تم تشريح الأورام (أسود = أورثوتوبيك ورم البروستات؛ والأصفر = المثانة) وتحليلها بواسطة ح & ه، ع المدينة، وسينابتوفيسين المدينة (مع مراقبة مورين الإيجابية) (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
في هذه المخطوطة لنا الخطوط العريضة للبروتوكول للقيام بحقن خلايا سرطان البروستاتا داخل العمليات الجراحية. أننا استخدمت المعتمدة على الاندروجين و حركة-أوفيريكسبريسينج (يعتبرحركة overexpression يصل إلى 80-90% من سرطان البروستاتا البشرية39) خط خلية سرطان البروستاتا مورين، حركة الحد الأقصى، معزولة أصلاً من مرحبا-حركة الماوس32 ،33. وكان ترانسدوسيد هذا الخط خلية ستابلي للتعبير عن لوسيفراس ومتشيري، لغير الغازية في فيفو تصوير الورم طرحه ونيون، على التوالي. كما أنجز عملية الاخصاء الجراحي، وكذلك بعد التنمية المعتمدة على الاندروجين الورم، مما يؤدي إلى تراجع الورم وتكرار اللاحقة. ولذلك، نحن نقدم تفاصيل طراز أورثوتوبيك المعتمدة على الاندروجين سرطان البروستاتا وقانون الإجراءات الجنائية في مضيف الأشخاص.
تم حقن الخلايا الحد الأقصى لحركة الفص البروستاتا الأمامي من الفئران. البروستاتا الماوس يتكون من الفصوص البروستاتا الأمامي والبطني ودورسولاتيرال، والبروستاتا البشرية يتكون من المنطقة المحيطة والمنطقة الانتقالية، والمنطقة المركزية داخل فلقة واحدة40. في حين أن الدراسات السابقة قد تشريحيا والأشيع مقارنة الفص الماوس dorsolateral إلى الطرفية البشرية المنطقة، موقع غالبية41من سرطان البروستاتا، والفص الأمامي الماوس ل المنطقة المركزية البشرية42، 43، أثبت تحليل أكثر حديثة وشاملة أن الفص الأمامي والفص dorsolateral عرض أنماط تعبير الجينات ارتباطاً وثيقا، بالمقارنة مع الفص البطني. 44 أنه قد لوحظ كذلك، تطوير سرطان البروستاتا في الفص الأمامي من الأحجار الكريمة40، و للإجراء داخل البروستاتا، يسمح الفص الأمامي لحقن حجم سرطان الخلية الحل مع تسرب الحد الأدنى اللازم والتقلبات المناخية.
الليبي وجوهره المحورة وراثيا باستخدام نماذج السرطان لديها العديد من العيوب وأوجه القصور. أورام الليبي نمت في TME اصطناعية قد ردود التفاضلية على تشيموثيرابيس، وعلى النقيض من الأورام أورثوتوبيك كلا من نفس خطوط الخلايا والأمراض البشرية20،،من2122. قد يكون هذا بسبب المفرج غيرت الأورام الليبي، كما يتضح من استجابتها التفاضلية لمكافحة الأوعية العلاج18،19. على العكس من ذلك، أورام أورثوتوبيك تطوير مع TME سليم وتجفيف الغدد الليمفاوية والمفرج، ويمكن تنفيذها مع خطوط الخلايا مورين، يسمح ذلك أيضا لتحليل المناعة الورم والرد على إيمونوثيرابيس.
وضع الأحجار الكريمة المعدلة وراثيا الأورام مع TME سليم في مضيف الأشخاص، ومع ذلك تبسيط هذه النماذج عادة سرطان البشرية بتطوير أورام مع واحد أو عدد قليل من التعديلات الوراثية29. وكشف تحليل الحد الأقصى لحركة وخطوط خلايا سرطان البروستاتا الأخرى أنها تتضمن الكثير أكبر نسخة جسدية عدد التعديلات والتعديلات الصبغية من الأورام من الفئران مرحبا-حركة وغيره من الأحجار الكريمة التي كانت مشتقة29. علاوة على ذلك، تقتصر الأحجار الكريمة بزيادة التكلفة والوقت اللازم للفئران تربية للقيام بتجارب لطاقة كافية. النمذجة الورم أورثوتوبيك ويمكن التغلب على هذه القيود. خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية ومورين تحتوي على العديد من التعديلات الوراثية ذات الصلة بالمرض البشري29، ومثل السرطان البشري، وتبين أيضا عدم تجانس كبير بين الخلايا الفردية30. الأورام سينجينيك مورين أورثوتوبيك تسمح للتحاليل المناعية، بينما أورثوتوبيك الأورام إكسينوجينيك البشرية تسمح لإجراء تحليلات للمداواة في الخلايا البشرية. أخيرا، على خلاف مع الأحجار الكريمة، الخلية يمكن تعديل خطوط قبل الحقن، مما يسمح للتعبير عن طرحه أو الفلورسنت التصوير الجزيئات لرصد نمو الورم، تطبيع العبء الورم بين المجموعات التجريبية، رصد استجابة للعلاج، وإلى تتبع الانحدار الورم وتجدد اللجنة بعد عملية الاخصاء الجراحي.
وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول تحديد مكان وتتستر حويصلة والمرفقة من الفص الأمامي البروستاتا دون الأضرار بالانسجة الأخرى أو ثقب حويصلة، القيام حقن داخل البروستاتا ناجحة من 30 ميليلتر من الخلية الوقف عن العمل دون التسرب، وجمع أي تسرب لمنع حدوث تطور الورم غير أورثوتوبيك في جميع أنحاء البطن بشكل صحيح. هو بلوغ الحد الرئيسية من الحقن داخل البروستاتا المهارة التقنية اللازمة للحد من تقلب ورم بين الفئران. وهذا مهم بشكل خاص للنمذجة قانون الإجراءات الجنائية، الذي قد أضاف متغير للخصي الجراحي. الفئران حقن داخل بروستاتيكالي ومخصي يجب أيضا أن يتابع عن كثب للانتعاش والأحداث السلبية، كما أنها قد تعرضت للعمليات الجراحية الكبرى بقاء اثنين. قيد آخر هو وقت كل الحقن داخل البروستاتا. ويمكن تخفيض هذا إلى منخفضة ك 20 دقيقة، والجراح مساعد يمكن إعداد الماوس التالية كما هو يجري خياطة الماوس الحالي. وأخيراً، الأورام أورثوتوبيك الحد الأقصى لحركة عدوانية، سريعة النمو الأورام التي تصل إلى نقطة النهاية بالبقاء على قيد الحياة في حوالي 46 يوما (وأقرب وقت 35 يوما) بسبب الورم الرئيسي الشامل. الدراسات التي تتطلب التنمية الورم أبطأ أو علاجات طويلة الأجل ينبغي أن يكون الأمثل تجريبيا لنظام العد ومعاملة خلية حقن الأولية. على النقيض من قيود الأورام الليبي والأحجار الكريمة، كل القيود المذكورة أعلاه نموذج الورم أورثوتوبيك يمكن التغلب عليها، ويمكن إجراء تعديلات إضافية للبروتوكول استناداً إلى الاحتياجات التجريبية الفردية.
كما أورثوتوبيك الورم نموذج ينطوي على استخدام في المختبر-التعامل مع الخلايا، وهذه الخلايا يمكن تعديلها تبعاً لاحتياجات الدراسة. وهنا، قمنا بتعديل هذه الخلايا للتعبير عن ستابلي لوسيفراس ومشري في فيفو رصد الورم. نحن أيضا بإجراء بالضربة قاضية Cas9 كريسبر القامع الورم، فتنلإنشاء خط خلية ذات الصلة سريرياً أكثر عدوانية، والتي تنمو أسرع كالأورام أورثوتوبيك (مخطوطة في الاستعراض). مع مزايا نموذج الورم أورثوتوبيك، والقدرة على دراسة سرطان البروستاتا المعتمدة على الاندروجين وقانون الإجراءات الجنائية، والقدرة على التعبير عن طرائق التصوير أو ضربة قاضية أو أوفيريكسبريس تحديد الجينات، وهذا البروتوكول بمثابة موردا قيماً للجميع أبحاث سرطان البروستاتا.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح برافين ثومبيكات (نيدك R01 DK094898)، وعبد القادر سركي (NCI R01 CA167966، CA123484 R01 NCI، NCI P50 CA180995) وجوناثان Anker (NCI F30 CA203472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
| Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
| Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
| 50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
| 28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
| RPMI | Gibco | 18875-093 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
| 26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
| Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
| Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
| Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
| Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
| Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
| Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
| 5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
| 4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
| D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
| Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
| Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
| Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
| Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306 (11), 1205-1214 (2011).
- Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97 (20), 1525-1532 (2005).
- Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27 (24), 3916-3922 (2009).
- Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. , (2015).
- Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110 (2), 213-228 (2014).
- Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368 (5), 436-445 (2013).
- Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352 (2), 154-164 (2005).
- Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97 (5), 963-968 (2006).
- Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9 (9), e107516 (2014).
- Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26 (2), 242-245 (2008).
- Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376 (9747), 1147-1154 (2010).
- Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13 (10), 983-992 (2012).
- Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363 (5), 411-422 (2010).
- Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369 (3), 213-223 (2013).
- Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66 (5), 815-825 (2014).
- Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367 (13), 1187-1197 (2012).
- Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63 (5), 723-726 (1991).
- Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34 (3), 357-360 (1995).
- Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13 (3), 627-630 (1993).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13 (2), 209-222 (1994).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3 (3), 413-422 (1993).
- Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10 (3), 229-243 (1991).
- Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15 (7), 700-712 (2014).
- Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366 (26), 2443-2454 (2012).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5 (2), 207 (2004).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55 (4-5), 547-555 (2011).
- Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13 (2), 339-347 (2015).
- Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87 (3-4), 225-232 (1999).
- Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29 (17), 2477-2487 (2010).
- Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65 (24), 11565-11571 (2005).
- Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72 (6), 587-591 (2012).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1 (10), 609-613 (2014).
- Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41 (2), 87-93 (2000).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1 (6), 617-628 (2010).
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12 (12), 897-906 (1988).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
- Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11 (2), 225-254 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. J Biol Chem. 280 (43), 36442-36451 (2005).
