Summary
في هذا العمل، ويصف لنا الحشري الحاد والمزمن وبين الأجيال لدراسة آثار الإجهاد مفردة ومجتمعة على killifish الفيروز فورزيري نوثوبرانتشيوس. تم تصميم هذا البروتوكول لدراسة تاريخ حياة الصفات (معدل الوفيات، النمو، الخصوبة، الوزن) وأقصى الحرارية الحرجة.
Abstract
Killifish فورزيري نوثوبرانتشيوس كائن حي نموذجية ناشئة في مجال علم السموم الإيكولوجية وقد ثبت انطباقه في اختبار السمية الحادة والمزمنة. عموما، حساسية الأنواع للمركبات السامة في النطاق مع، أو أعلى، من الأنواع النموذجية الأخرى.
ويصف هذا العمل البروتوكولات للمقايسة الحادة والمزمنة، وبين الأجيال من آثار الضغوطات مفردة ومجتمعة على فورزيري أ.. نظراً للوقت القصير نضوج ودورة الحياة، يسمح هذا النموذج الفقاريات دراسة نهايات مثل وقت النضج والخصوبة في غضون أربعة أشهر. يمكن أن يؤديها تخذها دورة الحياة الكاملة التعرض للمحاكمات في أقل من 8 أشهر. منذ هذه الأنواع تنتج البيض التي تقاوم الجفاف وتظل قابلة للاستمرار لسنوات، الثقافة في الموقع للأنواع غير مطلوبة ولكن يمكن تجنيد الأفراد عند الاقتضاء. البروتوكولات مصممة لقياس سمات تاريخ حياة (معدل الوفيات، النمو، الخصوبة، الوزن) والحرجة الحرارية كحد أقصى.
Introduction
كانت ملامح حساسية طائفة واسعة من الأنواع إلى سميات استراتيجيا المحدد وصف1 للتشريعات "الأوروبية تصل إلى" (التسجيل والتقييم وترخيص وتقييد المواد الكيميائية). اختبارات السمية الحادة أو قصيرة الأجل كانت تستخدم في الغالب لهذا الغرض كما أنها تعطي إشارة سريعة للحساسية هي من الأنواع. ومع ذلك، في بيئتها الطبيعية، تتعرض الكائنات الحية على مدى فترات أطول بكثير ودورات حياة كاملة أو حتى عدة أجيال يمكن أن المتضررة2. وعلاوة على ذلك، يتعرض الكائنات الحية في البيئات الملوثة عادة إلى الضغوطات واحد أو أكثر في وقت، التي قد تتفاعل مع بعضها البعض، ربما ينتج عن آثار التآزر3. ومن ثم فقد نقلل من اختبارات السمية المحسوبة على أساس الضغوطات الحادة، وواحد آمنة تركيزات المخاطر الفعلية التي تفرضها سميات في البيئات الطبيعية. ولذلك يستحسن،، لدراسة آثار مزمنة ومتعددة الأجيال من التركيزات المقاسة من سميات في سياق بيئياً ذات صلة أيضا التي تدعو إليها "اللجنة الأوروبية"4،5 ووكالة حماية البيئة الأمريكية (المتحدة وكالة حماية البيئة في الولايات)6،7. لا سيما في بحوث الفقاريات، مرتفعة التكاليف من حيث العمل والمال والوقت عند إجراء دراسات التعرض المزمن وبين الأجيال بسبب عمر طويل نسبيا من الفقاريات بالمقارنة مع الكائنات اللافقارية النموذجي. ولذلك، فمن المستحسن اختيار أنسب الأسماك طراز الكائن الحي، واعتماداً على السؤال البحثي. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يكون مجموعة واسعة من الأنواع الفقارية المتاحة من أجل اختبار عمومية الردود عبر الأنواع لتكون قادرة على التكيف مع الأنظمة القائمة على الأنواع الأكثر حساسية. الآن، هناك حاجة إلى وضع جديد، بروتوكولات فعالة مع الأنواع النموذجية الفقارية تتميز بدورات حياة قصيرة لخفض تكاليف أداء التعرض المزمن وبين الأجيال على الفقريات7،8.
Killifish الفيروز فورزيري نوثوبرانتشيوس نموذج أسماك مثيرة لاهتمام لاستخدامها في مثل هذه التجارب التعرض الطويل الأجل بسبب الوقت القصير نضوج ودورة الحياة (جيل الوقت أقل من 4 أسابيع9). وهذا يعني أن النهاية ذات الصلة إيكولوجيا مثل وقت النضج والخصوبة يمكن دراستها في إطار زمني قصير بالمقارنة مع سائر النماذج الأسماك7. وعلاوة على ذلك، هذه الأسماك إنتاج البيض نائمة مقاومة للجفاف، وأن تظل قابلة للاستمرار لعدة سنوات عند تخزينها تحت ظروف قياسية، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى استمرار ثقافة9. في دراسات السمية البيئية، وهذا يعني أيضا أن تكرار الأسماك يمكن الجميع أن تحاك في نفس اللحظة الدقيقة، أسفر التزامن الوقت لجميع الحيوانات، وحتى بين مجموعات بيض المنتج في أوقات مختلفة. نحن ننصح باستخدام المختبر سلالة جرز للقيام بتجارب التعرض. هذه السلالة أداء جيدا في الظروف المختبرية، وهو متماثل (باستثناء كروموزومات الجنس) والجينوم هو كذلك تتسم10،11.
في دراسات السمية البيئية، من المهم لتحديد النطاق المناسب لتركيزات الاختبار. يمكن استخدام عدة أساليب مكملة لهذه الغاية. يمكن أن تستند نطاق التركيز الأسمى إلى حساسية الأنواع ذات الصلة، مثل جوينثيري نوثوبرانتشيوس12. بدلاً من ذلك، يمكن أن تستند النطاق حساسية النماذج القياسية الأسماك، مثل الزرد (دانيو rerio)2 التي لها حساسية مماثلة لمعظم سميات (فيليب et al. (في استعراض)). في تركيبة، مع كل من هذه الخيارات، ينبغي أن تجري مجموعة البحث عن التجربة لتحديد نطاق التركيز الأسمى. لاختبار حادة، ينبغي أن تهدف الباحثين لتركيز العلاج مع وفيات 100%، متوسط معدل الوفيات والوفيات 0% بعد 24 ساعة تعرض لأنها سامة. لاختبار المزمن، فمن المستحسن لتشغيل نطاق البحث عن تجربة لمدة أسبوعين للتحقق من إذا وفيات اليرقات في الشرط مع أعلى تركيزات اختبار لا يتجاوز نسبة 10 في المائة خلال هذه الفترة المرجعية.
يمكن البروتوكول بمثابة أساس لأداء التعرض الحاد والمزمن للملوثات المنقولة بالمياه في فورزيري أ، دراسة الآثار المحتملة لعوامل الإجهاد على حد سواء على المستوى الفردي والهاتف الخلوي. يمكن أيضا استخدامه لإجراء البحوث الضغوطات المتعددة لاستيعاب أعلى أهمية إيكولوجية، خلط مختلف المركبات السامة أو دراسة الآثار التفاعلية بين التلوث والإجهاد الطبيعية الأخرى (مثل اﻻفتراس) أو الاصطناعية عوامل الإجهاد (مثل الاحترار بسبب تغير المناخ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها اللجنة الأخلاقية من كوليوفين.
1-الفقس والصيانة العامة من فورزيري أ.
- إعداد الأسماك المتوسطة (pH 7) عند درجة حرارة 14 درجة مئوية وإضافة تنقية المياه "من النوع الثاني"، مع إضافة أملاح موحدة، للتوصيل من 600 المايكروثانيه/سم (24 درجة مئوية).
- حدد البيض من الخط المختبر جرز (الجونة-ستراتهم-تشو) التي تم تخزينها تحت ظروف قياسية13. حدد البيض في مرحلة ديي (أي استعداد للتظليل)، يمكن التعرف عليها بوجود العيون الذهبية9 ولطف نقلها مع زوج لينة من الملقط إلى خزان ل 2 بلاستيك (أي أكثر من حوالي 30 بيضة في خزان).
ملاحظة: من أجل الحصول على عدد كاف من اختبار صحة الكائنات الحية، يفقس البيض مرتين كثيرة كعدد يرقات السمك المطلوب. - أضف 1 سم الوسط الأسماك عند 12 درجة مئوية والسماح لدرجة حرارة الماء تتقارب تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة (24 درجة مئوية)9. وسوف يفقس الأسماك ضمن ح 12 الأولى.
- بعد 24 ساعة، تغذية hatchlings جرعة مركزة من فقست حديثا أرتيميانوبلي (للاطلاع على مزيد من التفاصيل عن التردد وكمية من المواد الغذائية، الرجوع إلى بروتوكول تربية Polačik et al. عام 20169) وزيادة عمق المياه إلى 5 سم من إضافة متوسطة السمك.
- بعد 36 ساعة، تغذية hatchlings آخر جرعة مركزة من طازجة مظلل الارتيميا النوبليوس وإضافة الأسماك المتوسطة لزيادة عمق المياه إلى 10 سم.
- احتضان حاويات الأسماك تحت ظروف درجة حرارة ثابتة (مثلاً في حاضنة أو المناخ غرفة أو حمام الماء الساخن) تحت ح 14 h:10 نظام الضوء: الظلام.
- قبل البدء التجربة، حاويات الأسماك المعقدة (دون الأسماك) بتعرض مجمع بملئها بتركيز أعلى من متوسط التعرض وتركها بين عشية وضحاها من أجل الحد من نقل سميات إلى الحاوية في الفعلية التجربة.
- ح 48 بعد الفقس، حدد اليرقات المزدهر صحية لبدء التجربة التعرض. تجاهل ما يسمى منزلقات البطن التي كانت غير قادر على ملء المثانة السباحة بها، ونتيجة لذلك الطفو البصر (بالوعة باستمرار إلى الأسفل).
2-المدى القصير التعرض البروتوكول
ملاحظة: ينبغي أن تهدف الباحثين على الأقل 20 replicates (الأسماك 20 في الجرار منفصلة) كل معاملة. بالإضافة إلى علاج تحكم كامل، ينبغي إدراج عنصر تحكم موسر إذا أعد الحل الأسهم المجمع باستخدام المذيبات. ينبغي أن تحتوي على عنصر التحكم المذيبات كمية المذيب تساوي تركيز المذيبات في أعلى تركيز التعرض.
- إعداد الحاويات التجريبية (0.5 لتر زجاج الجرار) بوضع العلامات عليها وملئها بمتوسط التعرض المناسبة (تركيزات السمية مختلفة). إضافة المجمع للحصول على التركيز الصحيح.
- نقل اليرقات (48 ساعة بعد الفقس) منفردة للحاويات (الأسماك 1 كل حاوية لرصد الفردية).
ملاحظة: يتم كشفها أسماك منفردة للتقليل من آثار الخلط المحتملة للتفاعل الاجتماعي مثل التنافس على الغذاء والعدوان. ومع ذلك، يسمح الأسماك للتفاعل بصريا وفقا للمعايير الأخلاقية لاستخدام الحيوانات المختبرية. - متابعة هذا التعرض الحاد لمدة تصل إلى أسبوعين. وخلال ذلك الوقت، تغذية الأسماك libitum الإعلانية مع الارتيميا النوبليوس مرتين في اليوم، 7 أيام في الأسبوع الواحد.
- تحديث المتوسط يوميا للحفاظ على نوعية المياه والتقليل من الآثار المحتملة لتدهور المركبة. رصد المتغيرات المائية الرئيسية (يجب أن تتجاوز مستويات الأوكسجين الذائب 80%، الموصلية يجب أن تتراوح بين 600 و 700 المايكروثانيه/سم، الأس الهيدروجيني بين 7.8 و 8.2، وصلابة (ككربونات الكالسيوم3) بين 350 و 450 مغ/لتر، التي تقع داخل نطاق شروط التربية المثلى فورزيري أ. 9). أخذ عينات المياه قبل وبعد تحديث المتوسط إلى تحديد تركيزات المركب الفعلي.
- نقاط النهاية
- فحص الأسماك للوفيات، والإجهاد (مثل السلوك المنحرف: السباحة رأسا على عقب) أو المرض يوميا (الصباح والمساء). راجع المنشور من الأطلال et al. (1999) 12 لمزيد من التفاصيل على ملاحظة معدلات الوفيات أو الإجهاد أو المرض.
- حساب LC50 القيم استناداً إلى معدل الوفيات عند نقاط زمنية مختلفة باستخدام منحنيات الاستجابة للجرعة (ريتز وستريبيج، 2005). استخدم الدالة drm في الحزمة جمهورية الكونغو الديمقراطية في v3.2.3 R (فريق آر التنمية الأساسية، 2016) أو نهج إحصائية مماثلة.
3. بروتوكول التعرض المزمن
ملاحظة: تهدف إلى الحد أدنى من الأسماك 25/الشرط في بداية التجربة، للتقليل من فرص نسبة الجنس المنحرف وتلبية المحتملة خلفية الوفيات الناجمة عن أسباب طبيعية (أي. الوفيات المرتبطة بالسن).
- الفقس (انظر القسم 1)
- المرحلة الأولى (2 أيام بعد الفقس-16 يوما بعد الفقس)
- اتبع البروتوكول كما هو موضح في 2، 1-2-4
- كما حدث أثناء المرحلة الثانية من التجربة، سوف تتحلل المتوسطة طوال الأسبوع (لا المرطبات، انظر أدناه). تخزين الكمية المطلوبة من المتوسطة لمدة أسبوع في حاويات خاملة كبيرة بغية السماح بتدهور مماثل في المجمع.
- المرحلة الثانية (16 يوما ما بعد الفقس-نهاية)
- إعداد 2 لتر زجاج التجريبية الجرار من إلى لهم مع المجمع. تعبئة الزجاجات مع متوسط التعرض الصحيح وإضافة أنبوب هواء تهوية الجرة. الأسماك منزل على حدة في هذه الجرار لما تبقى من هذه التجربة. السماح بالتفاعل المرئي لاستيعاب المعايير الأخلاقية.
- تحديث المتوسط مرة واحدة في الأسبوع. نقل الأسماك بالشباك بجرة جديدة تحتوي على متوسط التعرض نفسه. أخذ عينات المياه كل يوم طوال أسبوع لرصد تدهور المجمع في كل معاملة تركيز. حساب اختبار منحنى تدهور لكل معاملة إذا ضغوطات متعددة (مثل سمية المركب في أنظمة درجات الحرارة المختلفة). قياس بارامترات اللاأحيائية (درجة الحموضة، درجة الحرارة، والأكسجين المذاب في المائة، الموصلية) ثلاث مرات في الأسبوع.
- من 3 أيام بعد الفقس (dph) حتى 23 dph، تغذية الأسماك مرتين يوميا، 7 أيام في الأسبوع متواصلة ad الارتيميا النوبليوس. من 24 dph-dph 37، تكمل النظام الغذائي ليبيتومارتيميا الإعلانية مع المقطعة Chironomus اليرقات. من 38 dph في، تغذية الأسماك مرتين يوميا، 7 أيام في الأسبوع إعلانية libitum تجميد اليرقات Chironomus .
- نقاط النهاية
- الأسماك الاختيار اليومي ل الوفيات، والإجهاد أو المرض12.
- تحديد النمو، وقياس حجم الجسم على أساس أسبوعي (dph 9-16 dph-21 dph-...) بنقل الأسماك إلى طبق بتري مليئة بالمتوسطة من هذه المكامن. 4-5 حجم معايرة الصور من الأسماك من أعلى (على ارتفاع ثابت) وتحليلها رقمياً باستخدام برنامج قياس مكانية (مثل إيماجيج).
ملاحظة: للسمك الكبار، استخدام طبق بيتري أعلى لتقليل التعامل مع الإجهاد بحفظ جميع الأسماك المغمورة خلال قياس العملية بأكملها. - بصريا نضج الذكور، تفقد الأسماك يوميا لتلوين من dph 15 فصاعدا. تحقق من الزعانف للبوادر الأولى لتلوين الزواج (الخصائص الجنسية الثانوية). استخدم في اليوم الأول الذي هذا مرئياً كوكيل لوقت نضوج الذكور.
- الزوجين غير مسحه الأسماك مع الذكور في نفس المجموعة المعاملة أو الذكور غير التجريبية ثلاث مرات في الأسبوع من 30 dph فصاعدا بغية تحديد وقت نضوج الإناث (يوم تودع البيضة الأولى). لهذا، تستخدم بروتوكول التفريخ الموصوفة في 3.4.5.
- للخصوبة، نضوج الزوجين الإناث مع الذكور الناضجة 3 مرات/الأسبوع من 30 dph فصاعدا، داخل هذه العلاجات استخدام نظام عبور.
- إعداد خزان التفريخ (1 لتر) لكل زوجين، باستخدام متوسط التعرض من الحوض الذكور وتستكمل مع تفريخ الركيزة (غرامة الرمال < 500 ميكرومتر).
- نقل كل من الذكور والإناث في خزان التفريخ والسماح لهم بالبيضة لمدة ساعتين. تقليل النشاط البشري أو اضطراب حول الحاويات التفريخ خلال هذه العملية.
- وبعد ذلك، نقل بلطف الأسماك مرة أخرى إلى داخل الحاويات الأصلية للسكن، دون خلط غير الضرورية من المياه التي سوف الدوران بيض في الركيزة التفريخ.
- تصفية البيض بصب الركيزة التفريخ أكثر 500 ميكرون. عد البيض ونقلها (باستخدام الملقط لينة) إلى موس الخث رطبة في أطباق بتري9،14.
- إزالة البيض الميت يوميا. بعد أسبوع، ختم بيتري طبق مع ختم الفيلم وتخزينها في درجة حرارة تسيطر حاضنة في 28 درجة مئوية و 14:10 ح الضوء: الظلام دورة التنمية فورا إلى مرحلة ديي (أي استعداد تفقس بعد حوالي ثلاثة أسابيع). للتخزين على المدى الطويل، تخزين البيض في 17 درجة مئوية في ظلام مستمر على أساسها البيض يدخل في مرحلة سبات عميق وتظل قابلة للاستمرار لسنوات متعددة. عند الاستعانة بالأسماك من هذه البيض نائمة للتجارب، نقل البيض نائمة لظروف 28 درجة مئوية مع 14:10 ح الضوء: الظلام دورة لمدة ثلاثة أسابيع تقريبا للسماح للتنمية إلى مرحلة ديي.
- قياس الحد الأقصى الحرارية الحرجة (كتماكس) (وهو تدبير لأداء15) من الأسماك الكبار.
- استخدام حمام مائي يتم تسخين 0.33 درجة مئوية/دقيقة بمعدل ثابت والذي يعمم الماء بشكل مستمر. إضافة عدة أحواض 1 لتر لكل الأسماك الفردية.
ملاحظة: نظراً لضيق المساحة في حوض ماء، من الضروري العمل في العديد من المسلسلات. وينبغي مراعاة الاختلافات المحتملة في الظروف بين سلسلة عند إجراء التحليل الإحصائي بتضمين 'سلسلة' كعامل عشوائي. - بدء المحاكمة بإضافة السمك إلى الحوض عندما المياه في الحوض وصلت درجة حرارة تجريبي تربية الأسماك (عموما 28 درجة مئوية). رصد درجة الحرارة في أحواض 1 لتر من حمام كتماكس كل 5-دقيقة باستخدام مقياس حرارة رقمي (مقياس 0.1 درجة مئوية).
- نهاية المحاكمة عندما أخفق في الحفاظ على موقف تستقيم دورسو بطنيا الأسماك أو يبدأ الوخز بشكل كبير16،17. قياس درجة الحرارة في الحوض 1 لتر، وهو درجة الحرارة القصوى الحرجة. نقل الأسماك إلى الإسكانية التجريبية للانتعاش.
- استخدام حمام مائي يتم تسخين 0.33 درجة مئوية/دقيقة بمعدل ثابت والذي يعمم الماء بشكل مستمر. إضافة عدة أحواض 1 لتر لكل الأسماك الفردية.
- قياس الوزن (دقة 0.1 مغ) من الأسماك في اليوم الأخير من التجربة الربت أنها جافة ونقلها على متن قارب وزنها. ملاحظة: جميع الأسماك ينبغي قياس أربع ساعات بعد إطعام الماضي على توحيد وزن الغذاء في الأمعاء.
- Euthanize الأسماك باستخدام 0.1% تريكيني.
4-تخذها التعرض البروتوكول
ملاحظة: لقياس تخذها آثار الملوثات على فورزيري أ، يتبع البروتوكول التعرض المزمن المبينة أعلاه للجيل الأول.
- مرتين أسبوعيا، التحقق من وضع البيض المنتجة (أي الجيل الثاني) المخزنة في 28 درجة مئوية 14:10 ح الضوء: الظلام دورة شروط بتفتيش أطباق بيتري للأجنة في مرحلة ديي (انظر Polačik وآخرون 9من عام 2016). عندما يتم وضع replicates أكثر من 50 من كل معاملة الوالدين تماما، هاتش لهم بعد على البروتوكول في 1.1.
- كشف الأسماك صحية ومزدهرة بالضبط نفس الإعداد والمعالجة كالسمك الأبوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حساب نتائج التعرض الحاد من فورزيري أ لتركيزات مختلفة من النحاس، كما هو الحال في 2.5.2، وإظهار العلاقات بين كليردوسي-الاستجابة (الشكل 1). وهناك زيادة في معدلات الوفيات مع زيادة تركيز السمية. إنقاص القيم LC50 مع مرور الوقت، مما يعني أن المزيد من الوقت مع تناقص تركيزات، يمر قبل 50% يموت replicates. للحصول على النتائج التفصيلية في التعرض الحاد والمزمن من فورزيري أ للنحاس، فضلا عن المقارنة بين حساسية الأنواع مقارنة بالأنواع الأخرى، ونحن نشير إلى فيليب et al. عام 20177.
في التعرض المزمن للمحاكمة، حجم الجسم والخصوبة نقاط حساسة. يمكن أن يكون هناك تغييرات واسعة النطاق في نمو الأسماك، تبعاً لدرجة الحرارة18. أحجام الكبار بين 30 و 50 مم تعتبر طبيعية في هذا التشكيل. السماح الإنشاء العثور على الاختلافات بين العلاجات (الشكل 2A). في مقايسة تعرض مزمن استخدام النحاس التي تنقلها المياه، كان هناك تأثير كبير من النحاس التعرض خلال الأسبوع الثالث (χ²5,34 = 40.7، ف < 0.001)، مع فورزيري أ يتعرض إلى 19.38 ميكروغرام/لتر Cu يجري أصغر من جميع الأسماك الأخرى (جميع ف < 0.001) (الشكل 2). للخصوبة، قيم عنصر التحكم يجب أن تتقلب بين حوالي 50 بيضة في الأسبوع لكل أنثى في الذروة إنتاج البيض7. استخدام والكلوربيريفوس المنقولة بالمياه وارتفاع درجة حرارة 2 درجة مئوية، وجدنا في تجربة أخرى، هناك تفاعل كبير بين التعرض والكلوربيريفوس وارتفاع درجة الحرارة في الخصوبة (2χ2,202 = 25.3، ف < 0.001). في 28 درجة مئوية، تنتج الأسماك تتعرض إلى 4 ميكروغرام/لتر البيض أقل مقارنة بالأسماك تتعرض إلى 2 ميكروغرام/لتر ومراقبة الأسماك (سواء ف < 0.001) (الشكل 2). عند 30 درجة مئوية، مراقبة الأسماك تنتج المزيد من البيض مقارنة بجميع والكلوربيريفوس تتعرض الأسماك (سواء ف < 0.007). كلا الأثر الرئيسي للتعرض إلى والكلوربيريفوس (χ22,202 = 96.8، ف < 0.001) والأثر الرئيسي لدرجة الحرارة (χ21,202 = 10.18، ف < 0.001) انخفاض كبير في الخصوبة. القياس تستغرق وقتاً طويلاً جداً بسبب تناول الأسماك والطلاء من البيض في الخث9، بل أنها غالباً ما تكون نقطة النهاية الأكثر حساسية.
وقت النضج في أغلب الأحيان تتأثر بالملوثات في الذكور. وقت نضوج الذكور كان تأثرا كبيرا بالتعرض المزمن والكلوربيريفوس المنقولة (χ22,41 = 11.79، ف = 0.003)، مع الذكور يتعرضون إلى 4 ميكروغرام/لتر التعاونية (C2) بعد نضج أبطأ 18% مقارنة بالذكور التحكم (الشكل 3 ألف ). هذه الاستجابة ينبغي، مع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند تفسير منذ وقت النضج هو سجل غير مباشر عن طريق تحديد بداية التلون الزواج كوكيل. على الرغم من أن الذكور تعتبر ناضجة بعد ظهور التلون9أيام قليلة، قد يكون هناك بعض الخطأ في التوقيت الدقيق للنضج باستخدام هذا الإجراء.
قرب الحد الأقصى الحرارية، ويحمل الأسماك السباحة خاطئ، وزيادة حركة أوبيركولار وفقدان القدرة على البقاء في وضع مستقيم دورسو بطنيا 16،17. تختلف قيم كتماكس بين سلالات فورزيري أ . السكان الطبيعية تحتوي على قيم كتماكس بين 39 درجة مئوية و 42 درجة مئوية عند تربيتها في درجات حرارة تتراوح بين 24 و 28 درجة مئوية (الشكل 3B). سلالة جرز الفطرية، إلا أن الفعل يصل إلى الحد الأقصى الحرارية في حوالي 37-38 درجة مئوية، حتى عندما تمت تربيتها في 28 درجة مئوية. في حين أن هذا الإجراء غير قاتلة للأسماك، وتحدث حالات نادرة من الوفيات. هذه الأسماك أفضل مستبعدة من تحليل كتماكس، كما أنها تمثل على الأرجح الأسماك الموجودة في الحالة العامة للفقراء نسبيا.
النتائج السابقة معظمها أظهر أن كتماكس يمكن أن تتأثر بالملوثات، وفي هذه الحالة، 3 و 4-DCA (χ22,71= 17.65، ف < 0.001) مع الأسماك تتعرض إلى 0.1 مغ/لتر 3 و 4-DCA بعد أقصى حرارية انخفاض 0.32 درجة مئوية مقارنة بالأسماك التحكم (P < 0.001). كما تأثر كتماكس درجة الحرارة تربية (χ21.71= 322.0، ف < 0.001)، والأسماك التي كانت تربى في 28 درجة مئوية 1.3 درجة مئوية كتماكس أعلى مقارنة بالأسماك التي كانت تربى في 24 درجة مئوية.
رقم 1: منحنى الجرعة والاستجابة للتعرض النحاس. منحنيات الاستجابة للجرعة تظهر وفيات التراكمي من فورزيري نوثوبرانتشيوس في الدالة لتركيز التعرض النحاس (Cu ميكروغرام/لتر وفيما يخص وقت التعرض). تشير النقاط إلى القيم LC50 . لقد تم تعديل هذا الرقم من فيليب et al. عام 20172. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الآثار على حجم وخصوبتها كنقاط النهاية. A) حجم (سم) من فورزيري نوثوبرانتشيوس المعرضين لتركيزات مختلفة من النحاس في الأسبوع 3، 7 و 11 و 15. تشير العلامة النجمية إلى أن الأسماك C5 أصغر بعد ثلاثة أسابيع على مستوى الأهمية ف < 0.05. يتم عرض القيم كما يعني ± sem. عينة أحجام هي n = 6؛ 6؛ 7؛ 7؛ 7؛ 7 في الأسبوع 3، n = 6؛ 6؛ 7؛ 7؛ 4 في الأسبوع 7, n = 5؛ 4؛ 5؛ 5؛ 3 في الأسبوع 11 و n = 5؛ 3؛ 3؛ 5؛ 2 في الأسبوع 15. ب) الخصوبة من خلال وقت الأسماك عرضه لتركيزات مختلفة من والكلوربيريفوس، عبرت مع اثنين من العلاجات درجة الحرارة، يقاس بعدد من البيض في الأسبوع. لتحسين قابلية القراءة وتفسيرها لهذا الرقم، لا تظهر أشرطة الخطأ على الرسوم البيانية. يشار أن عدد الإناث في كل معاملة في بداية ونهاية من البيض مد فترة استخدام الحرف 'ن'. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الآثار في وقت النضج وكتماكس. A) متوسط عمر (بالأيام) التي ظهرت البوادر الأولى لتلوين لدى الذكور من فورزيري نوثوبرانتشيوس يتعرضون لتركيزات مختلفة والكلوربيريفوس (0 ميكروغرام/لتر (C0), 2 ميكروغرام/لتر (C1) و 4 ميكروغرام/لتر (C2) CPF) واثنين من درجات الحرارة (28 درجة مئوية و 30 درجة مئوية). ب) يعني أقصى الحرجة الحرارية (كتماكس) من الأسماك المعرضة لتركيزات مختلفة من DCA 3 و 4 (0 مغ/لتر 3 و 4-DCA (C0)، 0.05 مغ/لتر 3 و 4-DCA (C1)، و 0.1 مغ/لتر 3 و 4-DCA (C2)) وبين درجات الحرارة (24 درجة مئوية و 28 درجة مئوية). وترد تركيزات الاسمية كمتوسط قيمة ± SE. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف الحشري جديدة استخدام فورزيري نوثوبرانتشيوس، كائن حي نموذجية ناشئة، لدراسة الفرد هذا العمل والجمع بين الآثار الطويلة الأجل سميات والعوامل الأخرى المسببة للإجهاد. تم بنجاح تطبيق البروتوكولات المقدمة لقياس حساسية الأنواع إلى صفيف من سميات (النحاس، الكادميوم، 3 و 4-ديتشلوروانيليني ووالكلوربيريفوس). بسبب دورة حياتها سريعة، يسمح هذا الطراز الفقاريات لتقييم المقاسة وآثار تخذها في غضون أربعة أشهر. ميزة كبرى أخرى لاستخدام هذه الأنواع السمكية كنموذج لفحص سمية هو حقيقة أن تنتج البيض مقاومة للجفاف. وهذا يتيح للباحثين تخزين البيض أو الحصول عليها من مورد ويلغي الحاجة لثقافة في الموقع مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. وعلاوة على ذلك، يمكن تخزين الأجنة لعدة سنوات حتى يتم hatchlings اللازمة12.
بعد دراسة حساسية فورزيري أ لعدد من سميات مرجع، يمكن أن نضيف أن حساسية الأنواع في النطاق مع، أو نموذج أعلى، من سائر الأنواع، اعتماداً على المجمع تم اختبارها. قياس الآثار المترتبة على الخصوبة، على وجه الخصوص، يمكن أن تزيد إمكانية المقارنة بين حساسية الأنواع المدروسة، كما أنها نقطة يقاس بشكل روتيني في الأنواع النموذجية الأخرى. وأخيراً، مدى التي تمارس ضغوطات متعددة الآثار السلبية، عندما تدار منفردة أو مجتمعة، يتوقف على نقطة النهاية بتقييمها وتركيز التعرض.
لا تزال هناك بعض القيود عند العمل مع فورزيري أ. أحد أوجه القصور الأكثر أهمية هو توحيد المواد الغذائية. دفعات من الخراجات الارتيميا أو بلودورمس يمكن أن تختلف في الجودة، ويمكن أن تؤثر على هذا النحو، نتائج الدراسة. ولذلك يستحسن أن تأمر بمجموعة كبيرة من المواد الغذائية لاستخدامها أثناء طول التجربة.
ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول لا ينطبق على نطاق واسع لفحص السمية البيئية. أ. فورزيري يتطور بسرعة إلى نوع اختبار المعياري في علم السموم الإيكولوجية. توافر هذا البروتوكول القياسي قد تذكي بإنشائها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نحن ممتنون لمجموعة المجال في أوانتويربين ودائرة حماية المحاصيل من أوجينة لتحليل عينات المياه. وقدمت الدعم المقدم من خلال هذا المشروع مركز التميز 'الإيكولوجية والديناميات الاجتماعية التطورية (PF/10/007) من"صندوق أبحاث وفين كو". الدخيل (11Q0516N) ومولت آسيت (فو-SB151323) الدكتوراه و TP (12F0716N) كزميل ما بعد الدكتوراه قبل "فو فلاندرز" (Fonds ويتينشابيليجك أونديرزوك).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
