Summary
In dit werk beschrijven we een acute, chronische en multigeneratie bioassay om te bestuderen van de effecten van gemeenschappelijke en gecombineerde stressoren op de Turquoise poolfish Nothobranchius furzeri. Dit protocol is ontworpen om te bestuderen levensgeschiedenis eigenschappen (sterfte, groei, vruchtbaarheid, gewicht) en kritieke thermische maximum.
Abstract
De poolfish Nothobranchius furzeri is een opkomende model-organisme in het gebied van ecotoxicologie en de toepasbaarheid ervan in de acute en chronische ecotoxiciteit testen heeft aangetoond. Over het geheel genomen is de gevoeligheid van de soorten aan giftige stoffen in het bereik met, of hoger dan die van andere soorten model.
Dit werk beschrijft protocollen voor acute, chronische en multigeneratie bioassays van enkelvoudige en gecombineerde stressor effecten op N. furzeri. Vanwege de korte rijpingstijd en levenscyclus kunnen dit gewervelde model de studie van eindpunten zoals rijpingstijd en vruchtbaarheid binnen vier maanden. Transgenerationele volledige levenscyclus blootstelling proeven kunnen worden uitgevoerd in slechts 8 maanden. Aangezien deze soort produceert eieren die droogte-resistente zijn en levensvatbaar blijven jarenlang, de eigen cultuur van de soorten is niet nodig maar individuen kunnen worden aangeworven, wanneer dit nodig is. De protocollen zijn ontworpen om de maatregel levensgeschiedenis eigenschappen (sterfte, groei, vruchtbaarheid, gewicht) en kritieke thermische maximum.
Introduction
Profielen van de gevoeligheid van een matrix voor toxische stoffen in strategisch geselecteerde soorten zijn beschreven1 voor de Europese REACH wetgeving (registratie, evaluatie, autorisatie en beperking van chemische stoffen). Acute of op korte termijn toxiciteitstesten werden meestal gebruikt voor dit doel als ze een snelle indicatie van een soort gevoeligheid geven. Echter in hun natuurlijke omgeving, organismen worden blootgesteld gedurende veel langere en volledige levenscyclus of zelfs meerdere generaties kon worden getroffen2. Bovendien worden organismen in vervuilde omgevingen meestal blootgesteld aan meer dan één stressor tegelijkertijd, die met elkaar samenwerken kunnen, mogelijk resulterend in synergetische effecten3. Vandaar, veilige concentraties berekend op basis van acute, één stressor toxiciteitstesten kunnen onderschatten de werkelijke risico's die worden opgelegd door toxische stoffen in natuurlijke omgevingen. Het is daarom aan te raden om ook het bestuderen van de chronische en multigeneratie effecten van subletale concentraties van toxische stoffen in een milieu relevante context zoals bepleit door de EuropeseCommissie4,5 en de USEPA (United States Environmental Protection Agency)6,7. Vooral in gewervelde onderzoek zijn de kosten op het gebied van arbeid, geld en tijd hoog bij het uitvoeren van studies van de chronische en multigeneratie blootstelling vanwege de relatief lange levensduur van gewervelde dieren ten opzichte van ongewervelde modelorganismen. Daarom is het raadzaam om te kiezen van de meest geschikte modelorganisme voor vis, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Bovendien moet een breed scala van gewervelde dieren beschikbaar om te testen van de algemeenheid van reacties over soorten om het aanpassen van de verordeningen op basis van de meest gevoelige soorten te kunnen zijn. Voor nu moet er een nieuwe, efficiënte protocollen met gewervelde model soorten gekenmerkt door korte levenscyclus te verlagen van de kosten van het uitvoeren van chronische en multigeneratie posities op gewervelde dieren7,8te ontwikkelen.
De turquoise poolfish Nothobranchius furzeri is een interessant model van vis in dergelijke langdurige blootstelling experimenten vanwege de korte rijpingstijd en levenscyclus (generatietijd minder dan 4 weken9) gebruiken. Dit betekent dat ecologisch relevante eindpunten zoals rijpingstijd en vruchtbaarheid binnen een kort tijdsbestek in vergelijking met andere vis modellen7kunnen worden bestudeerd. Bovendien, deze vissen produceren droogte-resistente, slapende eieren die levensvatbaarheid jarenlang wanneer opgeslagen onder standaardvoorwaarden, daardoor eliminerend de behoefte aan een continue cultuur9. In ecotoxicologisch onderzoek impliceert dit ook dat repliceren vis kunnen allemaal worden uitgebroed op exact hetzelfde moment, wat resulteert in tijd synchrony voor alle dieren, zelfs onder partijen eieren geproduceerd op verschillende tijdstippen. Wij adviseren met behulp van het laboratorium GRZ stam uit te voeren van de experimenten van de blootstelling. Deze spanning presteert goed onder laboratoriumomstandigheden, is homozygoot (met uitzondering van geslacht chromosomen) en het genoom is goed gekarakteriseerd10,11.
Ecotoxicologisch onderzoek is het belangrijk de juiste reeks testconcentraties wilt selecteren. Te dien einde kunnen verschillende complementaire methoden worden gebruikt. De nominale concentratiebereik kan worden gebaseerd op de gevoeligheid van een aanverwante soorten, zoals Nothobranchius guentheri12. U kunt ook kan het bereik worden gebaseerd op de gevoeligheid van standaard vis modellen, zoals zebravissen (Danio rerio)2 , die een vergelijkbare gevoeligheid voor toxische stoffen in de meeste (Philippe et al. (in review)). In combinatie, met beide opties, moet een oriënterend experiment worden uitgevoerd als de nominale concentratiebereik wilt selecteren. Voor het testen van de acute, moeten onderzoekers streven naar concentratie behandelingen met 100% mortaliteit, tussentijdse mortaliteit en 0% sterfte na 24 uur blootstelling aan de veroorzaken. Voor chronische testen, is het raadzaam om uit te voeren van het oriënterend experiment voor twee weken om te verifiëren als larvale sterfte in de staat met de hoogste testconcentraties niet hoger is dan 10% gedurende deze referentieperiode.
Het protocol kan dienen als een basislijn voor het uitvoeren van acute and chronische blootstelling aan drijvende/varende verontreinigende stoffen op N. furzeri, behandeling van de potentiële effecten van stressoren, zowel op het niveau van individuele en cellulaire. Het kan ook worden gebruikt voor het uitvoeren van meerdere stressor onderzoek zodat een hogere ecologische belang, dat het mengen van verschillende toxische verbindingen of studeren interactieve effecten tussen vervuiling en andere natuurlijke stressoren (bijvoorbeeld predatie) of antropogene stressoren (bijvoorbeeld opwarming van de aarde als gevolg van de klimaatverandering).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de KULeuven.
1. broedeieren en het algemene onderhoud van N. furzeri
- Bereiden vis medium (pH 7) bij een temperatuur van 14 ° C en gezuiverd water Type II, met toegevoegde gestandaardiseerde zouten, toevoegen aan een geleiding van 600 µS/cm (24 ° C).
- Selecteer eieren in de GRZ (Gona-Rhe-Zhou) laboratorium lijn die zijn opgeslagen onder gestandaardiseerde condities13. Selecteer eieren in de Terugmatch fase (dat wil zeggen klaar om uit te komen), herkenbaar door de aanwezigheid van gouden ogen9 en zachtjes overbrengen met een zachte pincet naar een kunststof 2 L tank (niet meer dan ongeveer 30 eieren per tank).
Opmerking: Om een voldoende aantal gezonde testorganismen, uitkomen tweemaal zoveel eieren als het aantal vereiste vissen larven. - Voeg 1 cm van het vis-medium bij 12 ° C en laat de temperatuur van het water geleidelijk convergeren naar kamertemperatuur (24 ° C)9. Vis zal uitkomen binnen de eerste 12 uur.
- Na 24u, feed de hatchlings een geconcentreerde dosis van vers gearceerde Artemianauplii (voor meer informatie over de frequentie en de hoeveelheid voedsel, verwijzen naar het protocol van de fokkerij van Polačik et al. 20169) en verhogen de waterdiepte tot 5 cm door het toevoegen van het vis-medium.
- Na 36 h, voeden de hatchlings nog een geconcentreerde dosis van vers gearceerde Artemia naupliën en toevoegen van vis medium te verhogen van de waterdiepte tot 10 cm.
- Incubeer vis recipiënten onder constante temperatuurvoorwaarden (bijvoorbeeld in een incubator, klimaat kamer of verwarmd waterbad) onder een 14 h:10 h licht: donker regime.
- Vóór het begin van het experiment, complexe vis containers (zonder vissen) met de blootstelling samengestelde door ze te vullen met de hoogste concentratie van blootstelling medium en laat het 's nachts ter beperking van de overdracht van toxische stoffen aan de container in de werkelijke experiment.
- 48 uur na het uitkomen, selecteer gezonde uitbundige larven om te beginnen met het experiment van de blootstelling. Negeren van de zogenaamde buik-schuifregelaars die konden te vullen hun zwemblaas en hebben dus een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan drijfvermogen (continu naar de bodem zinken).
2. korte blootstelling Protocol
Opmerking: Onderzoekers moeten streven naar ten minste 20 replicatieonderzoeken (20 vis in aparte potten) per behandeling. Naast een volledige controle behandeling, moet een oplosmiddel besturingselement worden opgenomen als de stockoplossing van de compound is opgesteld op basis van een oplosmiddel. Het oplosmiddel besturingselement moet bevatten de hoeveelheid oplosmiddel evenaren de oplosmiddelen concentratie in de hoogste concentratie van de blootstelling.
- De experimentele containers (0.5 L glazen potten) voor te bereiden door labelen hen en ze te vullen met de juiste belichting medium (verschillende toxische concentraties). Voeg de verbinding om te verkrijgen van de juiste concentratie.
- Larven (48u na uitkomen) afzonderlijk overbrengen naar de containers (1 vis per container voor individuele monitoring).
Opmerking: Vissen blootstaan individueel om te minimaliseren van mogelijke storende effecten van sociale interactie zoals concurrentie voor voedsel en agressie. Nochtans, zijn vis mag visueel communiceren in overeenstemming met ethische normen voor laboratoriumgebruik dierlijke. - Follow-up van deze acute blootstelling voor een duur van maximaal 2 weken. Gedurende die tijd, voeden de vis ad libitum met Artemia naupliën tweemaal per dag, 7 dagen per week.
- Vernieuw het medium om de andere dag waterkwaliteit te behouden en om te minimaliseren van de potentiële effecten van samengestelde afbraak. Belangrijkste water variabelen controleren (opgeloste zuurstofniveaus moeten groter zijn dan 80%, geleidbaarheid moet liggen tussen 600 en 700 µS/cm, pH tussen 7.8 en 8.2 en hardheid (als CaCO3) tussen de 350 en 450 mg/L, die binnen het bereik van optimale steigerend omstandigheden ligt voor N. furzeri 9). Watermonsters te nemen vóór en na het vernieuwen van het medium om te bepalen van de werkelijke samengestelde concentraties.
- Eindpunten
- Vis voor de sterfte, stress controleren (bijvoorbeeld afwijkend gedrag: zwemmen ondersteboven) of ziekte dagelijks (ochtend, avond). De publicatie van Shedd et al. raadplegen (1999) 12 voor meer informatie over de waarneming van sterfte, ziekte of stress.
- Berekenen van LC50 waarden gebaseerd op mortaliteit met behulp van de dosis / respons-curven (Ritz en Streibig, 2005) op verschillende tijdstippen. De drm -functie gebruiken in de drc-pakket in R v3.2.3 (R Core ontwikkelingsteam, 2016) of vergelijkbare statistische benaderingen.
3. chronische blootstelling Protocol
Opmerking: Gericht op een minimum van 25 vis/voorwaarde bij de aanvang van het experiment, om te minimaliseren van de kans op een scheve sex-ratio en aan potentiële achtergrond sterfte als gevolg van natuurlijke oorzaken (dwz. leeftijd-gerelateerde sterfte).
- Broedeieren (zie punt 1)
- Fase I (2 dagen na broedeieren-16 dagen post broedeieren)
- Volg protocol zoals wordt beschreven in de 2.1-2.4
- Als tijdens de tweede fase van het experiment, zal het medium degraderen gedurende de week (geen verfrissing, zie hieronder). Slaan het normbedrag van medium voor een week in grote containers onder geleide inerte zodat soortgelijke afbraak van de stof.
- Fase II (16 dagen post broedeieren-einde)
- Bereiden van 2 L experimentele glazen potten door complexvormers hen met de compound. Vul de potten met de juiste belichting middellange en voeg een lucht-buis om te beluchten van de pot. Huis vis afzonderlijk in deze potten voor de rest van het experiment. Visuele interactie aan ethische normen toestaan.
- Vernieuw het medium eenmaal per week. De vis met een net overbrengen in een nieuwe pot met hetzelfde blootstelling medium. Watermonsters nemen elke dag gedurende een week om te controleren de afbraak van de stof in de behandeling van elke concentratie. Bereken een afbraak curve voor elke behandeling als meerdere stressoren (bv . de toxiciteit van een stof in verschillende temperatuur regimes) getest. Meten van abiotische parameters (pH, temperatuur, % opgeloste zuurstof, geleidbaarheid) drie keer per week.
- Vanaf 2 dagen na broedeieren (departement) tot 23 departement, voeden de vissen tweemaal per dag, 7 dagen per week ad libitum Artemia naupliën. Van 24 departement - 37 departement, als aanvulling op het dieet van de advertentie libitumArtemia met gehakte Chironomus larven. Voeden van 38 departement volksgezondheid op, de vis tweemaal per dag, 7 dagen per week ad libitum bevroren Chironomus larven.
- Eindpunten
- Dagelijks controleren vis voor sterfte, ziekte of stress12.
- Om te bepalen van groei, het meten van de lichaamsgrootte van het op een wekelijkse basis (9 departement - 16 departement - 21 departement -...) door de overdracht van vis aan een petrischaal gevuld met medium uit hun reservoir. 4-5 grootte gekalibreerd foto's van de vis van bovenaf nemen (op een vaste hoogte) en analyseren ze digitaal met behulp van een ruimtelijke meten programma (bijvoorbeeld ImageJ).
Opmerking: Voor volwassen vis, gebruik een hogere petrischaal om behandeling stress te minimaliseren door het houden van alle vissen ondergedompeld gedurende het gehele proces te meten. - Voor mannelijke rijping, Inspecteer visueel of vis dagelijks voor de kleuring van 15 departement vanaf. Controleer de vinnen voor eerste tekenen van huwelijkse verkleuring (seksuele nevenkenmerk). Gebruik de eerste dag waarop dit zichtbaar als een proxy voor mannelijke rijpingstijd is.
- Koppel niet-sexed vis met mannetjes van dezelfde behandeling groep of niet-experimentele mannetjes driemaal per week van 30 departement vanaf om te bepalen van vrouwelijke rijpingstijd (de dag dat het eerste ei wordt gestort). Hiervoor de paaitijd protocol beschreven in 3.4.5 te gebruiken.
- Voor vruchtbaarheid, paar volwassen vrouwtjes met volwassen mannetjes 3 maal / week vanaf 30 departement, binnen hun behandelingen met behulp van een kruising regeling.
- Bereiden van een paai tank (1 L) voor elk paar, met behulp van blootstelling medium uit het mannelijke aquarium aangevuld met het kuitschieten substraat (fijn zand < 500 µm).
- Pipetteer van zowel de man als de vrouw in de paaitijd tank en laten paaien voor twee uur. Het minimaliseren van menselijke activiteit of verstoring rond de paaitijd containers tijdens dit proces.
- Daarna, zachtjes vis terug overzetten naar hun oorspronkelijke behuizing containers, zonder geen onnodige vermenging van het water, dat van de eieren in de paaitijd substraat dwarrelen zou.
- De eieren uitfilteren door het gieten van de paaitijd substraat over een maaswijdte van 500 µm. De eieren tellen en deze overbrengen (met behulp van zachte pincet) te vochtig veenmos in petrischalen9,14.
- Verwijder dode eieren dagelijks. Na een week, zegel het Petri schotel met het afdichten van de film en op te slaan in een temperatuur gecontroleerde incubator bij 28 ° C en een 14:10 cyclus h licht: donker voor onmiddellijke ontwikkeling naar de Terugmatch fase (dat wil zeggen klaar om uit te komen na ongeveer drie weken). Voor langdurige opslag, slaat u de eieren bij 17 ° C in constante duisternis waarop eieren de slapende fase ingaat en levensvatbaar blijven voor meerdere jaren. Bij het aanwerven van vis uit deze slapende eieren voor experimenten, overbrengen in de slapende eieren 28 ° C voorwaarden met 14:10 h licht: donker cyclus voor ongeveer drie weken voor de ontwikkeling naar de Terugmatch fase.
- Het meten van de kritieke thermische maximum (CTmax) (een maatregel voor prestaties15) van volwassen vis.
- Gebruik van een bad met water dat verwarmd wordt op een constante snelheid van 0.33 ° C/min en waarin het water voortdurend wordt verspreid. Voeg verschillende 1 L aquaria voor elke afzonderlijke vissen.
Opmerking: Gezien ruimtebeperkingen in het waterbad, is het nodig om te werken in diverse series. Bij het uitvoeren van statistische analyse door 'series' als een willekeurigheidsfactor, moeten rekening worden gehouden met mogelijke verschillen in omstandigheden tussen serie. - Begin het proces door de vis aan het aquarium toe te voegen wanneer het water in het aquarium heeft de experimentele steigerend temperatuur van de vis (in het algemeen 28 ° C) bereikt. Monitor de temperatuur in de 1 L aquaria van het CTmax-Bad elke 5-min met behulp van een digitale thermometer (0,1 ° C schaal).
- Eindigt het proces wanneer de vis er niet in slaagt om een dorso-ventrally rechtop of begint spiertrekkingen zwaar16,17. Meet de temperatuur in het aquarium van 1 L, oftewel de kritische maximale temperatuur. De vis ook terug overzetten naar haar gelijke huisvestings voor herstel.
- Gebruik van een bad met water dat verwarmd wordt op een constante snelheid van 0.33 ° C/min en waarin het water voortdurend wordt verspreid. Voeg verschillende 1 L aquaria voor elke afzonderlijke vissen.
- Het meten van het gewicht (nauwkeurigheid 0,1 mg) van de vissen op de laatste dag van het experiment door klopte droog en over te dragen op een gewicht boot. Opmerking: Alle vis moet worden gemeten vier uur na de laatste voeding om het gewicht van het voedsel in het darmkanaal standaardiseren.
- Euthanaseren van het vis met behulp van 0,1% tricaïne.
4. transgenerationele blootstelling protocol
Opmerking: Voor het meten van transgenerationele effecten van verontreinigende stoffen op N. furzeri, volg het protocol van de chronische blootstelling hierboven beschreven voor de eerste generatie.
- Twee keer per week, het controleren van de ontwikkeling van de geproduceerde eieren (d.w.z. de tweede generatie) opgeslagen bij 28 ° C 14:10 h licht: donker cyclus voorwaarden door te inspecteren de petrischaaltjes voor embryo's in de Terugmatch fase (Polačik et al. Zie 20169). Wanneer meer dan 50 wordt gerepliceerd van elke ouderlijke behandeling zijn volledig ontwikkeld, zij na het protocol in 1.1 uitkomen.
- Gezonde, veerkrachtige vis aan precies de zelfde set-up en de behandeling als de ouderlijke vis bloot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van de acute blootstelling van N. furzeri aan verschillende concentraties van koper, berekend zoals 2.5.2, Toon cleardose-respons relaties (Figuur 1). Er is een toename van de sterfte met toenemende toxische concentratie. LC50 waarden afnemen in de tijd, wat betekent dat met PM10, meer tijd voordat 50% van het sterven wordt gerepliceerd verstrijkt. Voor de gedetailleerde resultaten over de acute en chronische blootstelling van N. furzeri naar koper, evenals de vergelijking van de soort gevoeligheid ten opzichte van andere soorten, verwijzen we naar Philippe et al. 20177.
In de chronische blootstelling trial zijn lichaamsgrootte en vruchtbaarheid gevoelige eindpunten. Er is een uitgebreide variatie in de groei van de vis, afhankelijk van de temperatuur18. Volwassen maten tussen 30 en 50 mm worden beschouwd als normaal in deze set-up. De set-up kunt vinden van verschillen tussen behandelingen (figuur 2A). Bij een chronische blootstelling test met behulp van drijvende/varende koper, er was een significant effect van koperen blootstelling tijdens week drie (χ²5,34 40,7, P = < 0.001), met N. furzeri blootgesteld aan 19.38 µg/L Cu kleiner dan alle andere vis (alle P < 0.001) (figuur 2B). Voor vruchtbaarheid, moeten controlewaarden schommelen tussen ongeveer 50 eieren per week per vrouw op het hoogtepunt van ei productie7. In een ander experiment, met behulp van drijvende/varende chloorpyrifos en een stijging van de temperatuur 2 ° C, vonden we een belangrijke interactie tussen temperatuur stijging en chloorpyrifos blootstelling op vruchtbaarheid (χ22,202 25,3, P = < 0,001). Bij 28 ° C, vis blootgesteld aan 4 µg/L geproduceerd minder eieren in vergelijking met vis blootgesteld aan 2 µg/L en controle vis (beide P < 0.001) (figuur 2B). Bij 30 ° C, controle vis geproduceerd meer eieren in vergelijking met alle chloorpyrifos blootgesteld vis (beide P < 0,007). Zowel de belangrijkste effecten van blootstelling aan chloorpyrifos (χ22,202 96,8, P = < 0.001) en het belangrijkste effect van temperatuur (χ21.202 10.18, P = < 0.001) aanzienlijk verminderde vruchtbaarheid. De meting is nogal tijdrovend vanwege de behandeling van de vis en de beplating van de eieren op turf9, maar het is vaak het meest gevoelige eindpunt.
Rijpingstijd wordt meestal beïnvloed door verontreinigende stoffen in mannetjes. Mannelijke rijpingstijd was sterk beïnvloed door chronische blootstelling aan water chloorpyrifos (χ22,41 = 11.79, P = 0.003), met mannetjes blootgesteld aan 4 µg/L CPF (C2) hebben een tragere rijping van 18% in vergelijking met controle mannetjes (figuur 3A ). Deze reactie moet echter, met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd, aangezien rijpingstijd gescoord wordt niet indirect door het bepalen van het begin van huwelijkse verkleuring als een proxy. Hoewel mannetjes worden beschouwd als om een paar dagen na het verschijnen van kleuring9volwassen, kan er een fout op het exacte tijdstip van rijping met behulp van deze maatregel.
In de buurt van het thermal maximum vertonen vissen grillige zwemmen, verhoogde operculaire verkeer en verlies van vermogen in een dorso-ventrally rechtop 16,17te blijven. CTmax waarden verschillen tussen N. furzeri stammen. Natuurlijke populaties hebben CTmax waarden tussen 39 ° C en 42 ° C wanneer gefokt in temperaturen tussen de 24 en 28 ° C (figuur 3B). De ingeteelde stam GRZ, echter bereikt al zijn thermische maximum bij ongeveer 37-38 ° C, zelfs wanneer gefokt bij 28 ° C. Overwegende dat deze procedure niet dodelijk voor de vissen is, komen er zeldzame gevallen van sterfte. Dergelijke vis zijn best uitgesloten van de analyse van de CTmax, aangezien ze vertegenwoordigen waarschijnlijk vis die in relatief slechte algehele conditie.
De resultaten van de vorige meestal toonde dat CTmax kan worden beïnvloed door de verontreinigende stof, in dit geval, 3,4-DCA (χ22,71= 17.65, P < 0.001) met vis blootgesteld aan 0.1 mg/L 3,4-DCA met een 0.32 ° C lager thermisch maximaal in vergelijking met controle vis (P < 0,001). Ook CTmax werd beïnvloed door het fokken temperatuur (χ21,71= 322.0, P < 0.001) en vis die zijn gefokt bij 28 ° C had een 1.3 ° C hoger CTmax in vergelijking met vis die zijn gefokt bij 24 ° C.
Figuur 1: dosis-responscurve voor koperen blootstelling. Dosis / respons-curven weergegeven: cumulatieve sterfte van Nothobranchius furzeri in functie van de concentratie van de koperen blootstelling (in µg/L Cu en met betrekking tot de blootstellingstijd). Puntjes geven LC50 waarden. Dit cijfer is gewijzigd van Philippe et al. 20172. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: effecten op grootte en vruchtbaarheid als eindpunten. A) afmetingen (in cm) van Nothobranchius furzeri blootgesteld aan verschillende concentraties van koper in week 3, 7, 11 en 15. Sterretje geeft aan dat C5 vissen kleiner na drie weken op het niveau van de betekenis van P < 0.05. Waarden worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM. Sample maten zijn n = 6; 6; 7; 7; 7; 7 in week 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 in week 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 in week 11 en n = 5; 3; 3; 5; 2 in week 15. B) vruchtbaarheid door de tijd van vissen blootgesteld aan verschillende concentraties van chloorpyrifos, gekruist met twee temperatuur behandelingen, gemeten als het aantal eieren per week. Ter verbetering van de leesbaarheid en de interpretability van de figuur, worden de foutbalken niet weergegeven op de grafieken. Het aantal vrouwen in elke behandeling aan het begin en einde van het ei tot vaststelling van de periode wordt aangegeven met de letter 'n'. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: effecten op rijpingstijd en CTmax. A) gemiddelde leeftijd (in dagen) waarin de eerste tekenen van verkleuring in mannen van Nothobranchius furzeri blootgesteld aan verschillende chloorpyrifos concentraties (0 µg/L (C0), 2 µg/L (C1) en 4 µg/L CPF (C2)) en twee temperaturen (28 ° C en 30 ° C verscheen). B) gemiddelde kritieke thermische maximum (CTmax) van vissen blootgesteld aan verschillende concentraties van 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0) 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) en 0,1 mg/L 3,4-DCA (C2)) en twee temperaturen (24 ° C en 28 ° C). Nominale concentraties worden gepresenteerd als de gemiddelde waarde ± SE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft een nieuwe bioassay met behulp van Nothobranchius furzeri, een opkomende modelorganisme, te bestuderen van het individu en langetermijneffecten van toxische stoffen en andere stressoren gecombineerd. De gepresenteerde protocollen werden met succes toegepast voor het meten van de gevoeligheid van de soorten naar een matrix van toxische stoffen (koper, cadmium, 3,4-dichloroaniline en chloorpyrifos). Als gevolg van de snelle levenscyclus, dit gewervelde model zorgt voor beoordeling van subletale en transgenerationele effecten binnen vier maanden. Een ander groot voordeel van het gebruik van deze vissoorten als een model voor toxiciteit screening is het feit dat zij droogte-resistente eieren produceert. Dit kan onderzoekers te slaan eieren of aanvragen bij een leverancier en elimineert de noodzaak voor een kostbare en tijdrovende on-site cultuur. Bovendien, de embryo's kunnen worden opgeslagen voor jaren tot hatchlings benodigde12.
Na het bestuderen van de gevoeligheid van de N. furzeri op een aantal referentie toxische stoffen, die we kunnen toevoegen dat de gevoeligheid van de soorten binnen het bereik met, of hoger dan die van andere soorten, afhankelijk van de geteste stof model. Meten van effecten op de vruchtbaarheid, in het bijzonder kan verhogen de vergelijkbaarheid van de gevoeligheid op de bestudeerde soorten, aangezien er een routinematig gemeten eindpunt in andere soorten model. Tot slot de mate waarop meerdere stressoren bijwerkingen uitoefenen, toen beheerd afzonderlijk of gecombineerd, afhankelijk van het geëvalueerde eindpunt en de concentratie van de blootstelling is.
Er zijn nog enkele beperkingen bij het werken met N. furzeri. Een van de belangrijkste beperkingen is de standaardisatie van voedsel. Batches van Artemia -cysten of bloodworms in kwaliteit kunnen verschillen en kunnen, als zodanig, invloed hebben op de resultaten van de studie. Het is daarom aan te raden om een grote partij van voedsel om te gebruiken tijdens de hele duur van het experiment.
Wij zijn van mening dat dit protocol breed toepasbaar voor ecotoxicologische screening is. N. furzeri ontwikkelt zich snel tot een standaardtest soort(en) in ecotoxicologie. De beschikbaarheid van dit standaard protocol kan de oprichting brandstof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan de bol-groep van de UAntwerpen en de Vakgroep gewasbescherming van de Ugent voor analyse van watermonsters. Tijdens dit project werd ondersteund door de Excellence Center ' Eco en sociaal-evolutionaire dynamiek (PF/10/007) van het Fonds voor het onderzoek van de KU Leuven. AFG (11Q0516N) en ESJT (FWO-SB151323) als doctorale werden gefinancierd en TP (12F0716N) als postdoc door FWO Vlaanderen (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
